مقالة منهجية

صياغة وتميز الجسيمات النانوية الدهنية لتسليم الجينات باستخدام منصة خلط Microfluidic

DOI:

10.3791/62226

⸱

فبراير 25, 2021

 ,  ,  ,  , 
1Biologics Drug Product Development & Manufacturing, Sanofi, Framingham, Massachusetts

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تطوير الجسيمات النانوية الدهنية باستخدام نهج منصة خلط microfluidic لتغليف الحمض النووي الريبي والحمض النووي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد استخدمت ناقلات الأدوية القائمة على الدهون لأنظمة التسليم المتاحة سريريا وتجاريا بسبب صغر حجمها، وعدم التوافق البيولوجي، وكفاءة التغليف العالية. استخدام الجسيمات النانوية الدهنية (LNPs) لتغليف الأحماض النووية مفيد لحماية الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي من التدهور ، مع تعزيز امتصاص الخلوية أيضا. غالبا ما تحتوي LNPs على مكونات دهون متعددة بما في ذلك الدهون المؤينة والدهون المساعد والكوليسترول والبولي إيثيلين غليكول (PEG) الدهون المترافقة. يمكن ل LNPs تغليف الأحماض النووية بسهولة بسبب وجود الدهون المؤينة ، والتي في درجة الحموضة المنخفضة هي cationic وتسمح بالتعقيد مع الحمض النووي الريبي المشحون سلبيا أو الحمض النووي. هنا تتشكل LNPs عن طريق تغليف رسول الحمض النووي الريبي (مرنا) أو الحمض النووي البلازميد (pDNA) باستخدام الخلط السريع للمكونات الدهنية في مرحلة عضوية وعنصر حمض النيوكليك في مرحلة مائي. يتم إجراء هذا الخلط باستخدام منصة خلط دقيقة microfluidic، مما يسمح للتجميع الذاتي الجسيمات النانوية مع الحفاظ على تدفق صفح. يتم قياس حجم الهيدروديناميك والتعددية باستخدام تشتت الضوء الديناميكي (DLS). يتم تحديد الشحنة السطحية الفعالة على LNP من خلال قياس إمكانات زيتا. تتميز كفاءة التغليف باستخدام صبغة فلورية لقياس الحمض النووي المحاصر. وتبين النتائج التمثيلية إمكانية استنساخ هذه الطريقة والتأثير الذي يترتب على مختلف معايير الصياغة والعملية على الأساليب غير الرسمية المتقدمة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتستخدم شركات نقل الأدوية لحماية وتقديم العلاجية مع خصائص مواتية نموذجية بما في ذلك السمية الخلوية منخفضة, زيادة التوافر البيولوجي, وتحسين الاستقرار1,2,3. وقد تم استكشاف الجسيمات النانوية البوليمرية، micelles، والجسيمات القائمة على الدهون سابقا لتغليف الحمض النووي والتسليم4،5،6،7. وقد استخدمت الدهون في أنواع مختلفة من أنظمة النانوكارير، بما في ذلك الليبوسومات، والجسيمات النانوية الدهنية، لأنها متوافقة بيولوجيا مع استقرار عالية8. LNPs يمكن تغليف بسهولة الأحماض النووية لتسليم الجينات9،10. أنها تحمي حمض النوى من التدهور عن طريق بروتياز المصل خلال الدورة الدموية الجهازية11 ويمكن تحسين التسليم إلى مواقع محددة، كما التضاريس السطحية والخصائص الفيزيائية للNPs تؤثر على التوزيع الحيوي12. LNPs أيضا تحسين اختراق الأنسجة وامتصاصالخلوية 9. وقد أظهرت الدراسات السابقة نجاح تغليف سيرنا داخل LNP13، بما في ذلك أول علاج LNP متاح تجاريا يحتوي على علاج siRNA لعلاج اعتلال الأعصاب من الداء النشواني الوراثي بوساطة transthyretin14 العلاج الذي وافقت عليه إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) ووكالة الأدوية الأوروبية في عام 2018. في الآونة الأخيرة ، ويجري دراسة LNPs لتسليم أكبر moieties حمض النوى ، وهي ميرنا والحمض النووي9. اعتبارا من عام 2018 ، كان هناك ~ 22 نظاما لتوصيل الحمض النووي القائم على الدهون تخضع لتجارب سريرية14. بالإضافة إلى ذلك، ميرنا التي تحتوي على LNPs هي حاليا المرشحين الرئيسيين، وقد استخدمت للقاح COVID-1915،16. النجاح المحتمل لهذه العلاجات الجينية غير الفيروسية يتطلب تشكيل جزيئات صغيرة (~ 100 نانومتر) ومستقرة وموحدة مع تغليف عالية من الحمض النووي.

وقد أظهرت استخدام الدهون المؤينة كعنصر رئيسي في صياغة الشرطة الوطنية الليبيرية مزايا للتعقيد والتغليف والتسليم effciciency14. الدهون المؤينة وعادة ما يكون ثابت فصيل حمض (pKa) < 7; على سبيل المثال، ديلينوليمثيل-4-ديميثيلامينوبوتيرات (د-لين-MC3-DMA)، والدهون المؤينة المستخدمة في صياغة LNP وافقت ادارة الاغذية والعقاقير، لديه pKa من 6.4417. في انخفاض الرقم الهيدروجيني ، تصبح مجموعات الأمين على الدهون المؤينة بروتونات ومحملة بشكل إيجابي ، مما يسمح للتجميع مع مجموعات فوسفات مشحونة سلبا على الحمض النووي الريبي والحمض النووي. وتستخدم نسبة أمين ، "ن" ، والمجموعات إلى الفوسفات ، "ف" ، مجموعات لتحسين التجميع. تعتمد نسبة N/P على الدهون والأحماض النووية المستخدمة ، والتي تختلف وفقا للصياغة18. بعد التشكيل ، يمكن تعديل درجة الحموضة إلى درجة الحموضة المحايدة أو الفسيولوجية للسماح بالإدارة العلاجية. في هذه القيم درجة الحموضة، يتم أيضا إزالة الدهون المؤينة التي تضفي شحنة سطح محايدة إلى الشرطة الوطنية الليبيرية.

الدهون المؤينة يساعد أيضا في الهروب endosomal19،20. LNPs الخضوع لداء الغدد الصماء أثناء امتصاص الخلوية ويجب أن يطلق سراحه من الاندوسوم من أجل تسليم البضائع مرنا في سيتوبلازم الخلية أو الحمض النووي البضائع إلى النواة21. داخل الانسوم هو عادة بيئة أكثر حمضية من الوسط خارج الخلية، مما يجعل الدهون المؤينة مشحونة إيجابيا22،23. يمكن أن تتفاعل الدهون المؤينة المشحونة إيجابيا مع الشحنات السلبية على غشاء الدهون الاندوسومالي ، والتي يمكن أن تسبب زعزعة استقرار الإنسوم مما يسمح بإطلاق LNP وحمض النيوكليك. ويجري حاليا دراسة مختلف الدهون المؤينة لتحسين فعالية كل من توزيع LNP، فضلا عن الهروب endosomal14.

وتشمل المكونات النموذجية الأخرى للشرطة الوطنية الليبيرية الدهون المساعد، مثل فوسفاتيديلكولين (PC) أو فوسفوثانامين (PE) الدهون. 1،2-ديوليويل-سن-غليسيرو-3-فوسفوثانولامين (DOPE)، 1،2-distearoyl-sn-glycero-3-فوسفوخ السولين (DSPC)، و 1،2-ديوليويل-سن-غليسيرو-3-فوسفوتشولين (DOPC) هي شائعة الاستخدام الدهون المساعد24،25. وقد ثبت DOPE لتشكيل المرحلة السداسية الثاني المقلوب (HII) وتعزيز العدوى عن طريق الانصهار الغشاء26, في حين كان يعتقد DSPC لتحقيق الاستقرار LNPs مع هندستها أسطواني27. كما يتم دمج الكوليسترول في صياغة من أجل زيادة صلابة الغشاء، مما يساعد في وقت لاحق في استقرار الشرطة الوطنية الليبيرية. وأخيرا، يتم تضمين الجليكولات البولي إيثيلين المترافقة مع الدهون (PEG) في صياغة لتوفير حاجز الستيريك اللازم للمساعدة في التجميع الذاتي للجسيمات27. كما يحسن PEG استقرار التخزين LNPs عن طريق منع التجميع. وعلاوة على ذلك، يستخدم PEG في كثير من الأحيان كعنصر الشبح ويمكن أن تزيد من وقت التداول لLNPs. ومع ذلك، يمكن أن تشكل هذه السمة أيضا تحديات لتجنيد LNPs إلى خلايا الكبد من خلال آلية استهداف الذاتية التي يقودها apolipoprotein E (ApoE)28. وهكذا، فقد حققت الدراسات في طول سلسلة أسيل لنشر PEG من الشرطة الوطنية الليبيرية، ووجدت أن أطوال قصيرة (C8-14) ينأى عن الشرطة الوطنية الليبيرية وأكثر قابلية لتوظيف ApoE بالمقارنة مع أطوال أطول أسيل28. علاوة على ذلك ، فقد ثبت أن درجة تشبع ذيل الدهون التي يتم اقتران PEG بها تؤثر على توزيع الأنسجة ل LNPs29. في الآونة الأخيرة ، تبين أن توين 20 ، وهو من المواد الخافرة للأمواج شائعة الاستخدام في تركيبات منتجات الأدوية البيولوجية ولها ذيل دهون طويل غير مشبع ، لديه إصابة عالية في استنزاف الغدد الليمفاوية مقارنة ب PEG-DSPE ، والتي قامت إلى حد كبير بإصابة العضلات في موقع الحقن29. يمكن تحسين هذه المعلمة لتحقيق التوزيع الحيوي LNP المطلوب.

وتشمل الطرق التقليدية لتشكيل LNPs طريقة الترطيب رقيقة الفيلم وطريقة حقن الإيثانول27. في حين أن هذه التقنيات متاحة بسهولة ، فهي أيضا كثيفة العمالة ، ويمكن أن تؤدي إلى كفاءة تغليف منخفضة ، وتشكل تحديا لتوسيع نطاق27. وقد أدى التقدم في تقنيات الخلط في أساليب أكثر قابلية لتوسيع نطاق، في حين وضع جزيئات أكثر اتساقا27. وتشمل هذه الأساليب تي تقاطع خلط، خلط الرنجة متداخلة، وmicrofluidic الهيدروديناميكية مع التركيز27. كل طريقة لها بنية فريدة من نوعها، ولكن كل تسمح لخلط سريع لمرحلة مائي يحتوي على حمض النيوكليك مع مرحلة عضوية تحتوي على مكونات الدهون، مما أدى إلى تغليف عالية من الحمض النووي27. في هذا البروتوكول، يتم استخدام خلط سريع وتسيطر عليها من خلال خرطوشة microfluidic، والذي يستخدم تصميم خلط الرنجة متداخلة. يحدد هذا البروتوكول إعداد الحمض النووي الذي يحتوي على LNPs وتجميعه وتوصيفه.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم توفير تخطيطي للعملية الكلية في الشكل 1.

1. إعداد المخازن المؤقتة

ملاحظة: يتم اقتراح تصفية معقمة من المخازن المؤقتة للغاية هنا لإزالة أي الجسيمات التي قد تؤثر على حمض النوى وجودة LNP.

  1. ملحي الفوسفات المخزنة مؤقتا (PBS)
    1. إعداد برنامج تلفزيوني 1x باستخدام 8 mM Na2HPO4، 2 mM KH2PO4 ، 137 mM NaCl ، و 2.7 mM KCl في الماء الخالي من النيوكليز وضبط درجة الحموضة إلى 7.4.
    2. تعقيم عن طريق الترشيح فراغ باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر المسام الحجم.
  2. Citrate المخزن المؤقت
    1. إعداد العازلة سيترات باستخدام 5 mM سيترات الصوديوم، 5 M حمض الستريك، و 150 mM كلوريد الصوديوم في ماء خالية من النيوكليز والتكيف مع درجة الحموضة 4.5.
    2. تعقيم عن طريق الترشيح فراغ باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر المسام الحجم.
      ملاحظة: يجب إعداد المخزن المؤقت للسيترات فقط إذا كان الحمض النووي الريبي هو الحمض النووي الذي سيتم تغليفه في LNP. إذا كان سيتم تغليف الحمض النووي تخطي 1.2 والمضي قدما إلى 1.3.
  3. عازل حمض ماليك
    1. إعداد العازلة حمض ماليك باستخدام حمض ماليك 20 mM و 30 mM كلوريد الصوديوم في ماء خالية من النيوكليز والتكيف مع درجة الحموضة 3.0.
    2. تعقيم عن طريق الترشيح فراغ باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر المسام الحجم.
      ملاحظة: المخزن المؤقت لحمض ماليك يحتاج فقط إلى أن يكون مستعدا إذا كان الحمض النووي هو حمض النوى التي سيتم تغليفها في LNP. تخطي 1.3 إذا كان مرنا هو أن تكون مغلفة. يستخدم المخزن المؤقت سيترات لتغليف مرنا، كما درجة الحموضة أقل من 3.0 مع العازلة حمض ماليك قد يؤدي إلى زيادة احتمال تدهور الحمض النووي الريبي. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.

2. إعداد مزيج الدهون

  1. إذا كانت الدهون المخزون في شكل مسحوق، solubilize في الإيثانول 200 دليل نقي.
  2. حساب المزيج المطلوب من مكونات الدهون على أساس نسبة الضرس المطلوب. سيتم استخدام نسبة الضرس من 50:10:39:1 (الدهون المؤينة: الدهون المساعد: الكوليسترول: PEG) هنا كمثال على تركيز الدهون الكلي من 10 mM. ويبين الجدول 1 التركيزات والأحجام اللازمة لكل عنصر من هذه المكونات.
    ملاحظة: عند حساب الحجم اللازم لتحقيق تركيز مزيج الدهون في الإيثانول (EtOH) لخلاط microfluidic ، يتم حساب الحجم الإجمالي لضمان أن إضافة EtOH لا يؤثر على تركيزات الدهون. فعلى سبيل المثال، يحسب حجم الدهون المؤينة 68.5 ميكرولتر بضرب تركيز 5 ملايين متر في الإيثانول بكمية مزيج دهون إجمالية قدرها 533 ميكرولتر ثم بقسمتها على تركيز الدهون في المخزون الذي يبلغ 38.9 مليون متر.
  3. أضف الكمية المناسبة من كل محلول مخزون من الدهون إلى قارورة زجاجية للسماح للمكونات بالخلط مع الدوامة المتقطعة. إضافة 200 الإيثانول دليل على مزيج من مجموع 533 ميكرولتر. على سبيل المثال في الجدول 1، وهذا هو 254 ميكرولتر من الإيثانول.
    ملاحظة: للحصول على تشغيل واحد لإنتاج 1 مل من LNPs، هناك حاجة إلى 342.5 ميكرولتر من محلول الدهون. ويرجع ذلك إلى مزيج 3:1 من حمض النيوكليك المائي إلى محلول الدهون العضوية مع بعض الحجم المهملة قبل وبعد جمع العينة. يتم إجراء مزيج من 533 ميكرولتر للتعويض عن الإفراط.

3. إعداد محلول الحمض النووي

ملاحظة: إعداد ومعالجة حلول الحمض النووي هو أن يتم في بيئة معقمة وخالية من RNase كلما كان ذلك ممكنا. العمل في خزانة السلامة الحيوية كلما كان ذلك ممكنا مع حمض النوى.

  1. حساب نسبة N/P. نسبة N/P هي العدد الإجمالي لمجموعات أمين الدهون المؤينة (N) إلى العدد الإجمالي لمجموعات فوسفات حمض النيوكليك المشحونة سلبيا (P). نسبة N/P غالبا ما تكون معلمة يمكن تحسينها أثناء تشكيل LNP. اتبع الخطوات أدناه.
    1. حساب عدد الوحدات N باستخدام الصيغة أدناه:
      figure-protocol-1
      ملاحظة: تركيز الدهون المؤينة (الجدول 1) هو 5 م م، وهو ما يعادل 5 × 10-6 مول / مل. حجم حقن الدهون المطلوبة هو 0.3425 مل. على سبيل المثال، إذا كان عدد وحدات N لكل جزيء هو 1، وذلك باستخدام المعادلة أعلاه، هناك 1.03 × 1018 N وحدات في مزيج الدهون.
    2. حساب وحدات P لنسبة N/P المطلوبة. هنا N / P = 36 يستخدم على سبيل المثال.
      figure-protocol-2
  2. حساب تركيز الحمض النووي اللازم للحصول على 2.86 × 10وحدات P 16 باستخدام المعادلة أدناه.
    figure-protocol-3
    حيث، وعدد وحدات P لكل زوج قاعدة لرنا هو 1 والحمض النووي هو 2. بالنسبة إلى مرنا مع 1200 قاعدة ، فإن كمية الحمض النووي الريبي المطلوبة ل N / P = 36 هي 3.96 × 10-11 شامات.
  3. حساب تركيز كتلة مرنا المطلوبة لN / P = 36 باستخدام المعادلة أدناه.
    figure-protocol-4
    متوسط الوزن الجزيئي لوحدة الريبونوكليوتيد أحادي الفوسفات هو 322 غرام /مول30. مع 1,200 قاعدة مرنا, الوزن الجزيئي من مرنا هو 386,400 غرام / مول. حجم الحقن المطلوب من محلول الحمض النووي هو 1.028 مل. وبالتالي، فإن تركيز مرنا اللازمة هو 1.488x10-5 غرام / مل، وهو 14.88 ميكروغرام / مل.
  4. تشكل 1.5 مل من 14.88 ميكروغرام / مل من مرنا في المخزن المؤقت سيترات.
    ملاحظة: عندما يكون الحمض النووي هو حمض النوى المغلف، استخدم عازل حمض ماليك لتعويض محلول الحمض النووي.

4. فتيلة القنوات microfluidic

ملاحظة: هذا البروتوكول مقتبس من إرشادات الشركة المصنعة للجهاز.

  1. إدخال المعلمات فتيلة في برنامج الصك عن طريق النقر على الحقول المناسبة (الجدول 2).
    ملاحظة: ينصح نسبة تدفق 3:1 ومعدل تدفق 4-12 مل / دقيقة27،31 . وقد ثبت أن هذا هو الأمثل في الدراسات المقدمة هنا، وكذلك من قبل الشركة المصنعة. يمكن أن يكون هذا متنوعا إذا كان ذا أهمية للتطبيق.
  2. افتح غطاء الجهاز وضع خرطوشة microfluidic في كتلة دوارة.
  3. ارسم ما لا يقل عن 0.5 مل من الإيثانول في حقنة 1 مل، مما يضمن عدم وجود فقاعات أو فجوات في الهواء عند طرف الحقنة. قم بتحميل هذه الحقنة في المدخل الأيمن للخرطوشة.
  4. ملء حقنة 3 مل مع 1.5 مل من العازلة المائية (سترات للحمض النووي الريبي وحمض ماليك للحمض النووي)، وضمان عدم وجود فقاعات الهواء أو الثغرات. قم بتحميل هذه الحقنة في المدخل الأيسر للخرطوشة.
  5. أدخل أنبوبين مخروطيين سعة كل منهما 15 مل في حاملات القصاصات لتكون بمثابة حاويات نفايات.
  6. انقر على تشغيل في برنامج الصك لبدء الاختلاط، وضمان أن المعلمات هي الإدخال بشكل صحيح.
  7. عندما يتوقف الصك فتيلة، وأشار من قبل الضوء الأزرق السفلي إيقاف، وفتح الغطاء والتخلص بشكل صحيح من الأنابيب المخروطية والمحاقن.

5. تشكيل الشرطة الوطنية الليبيرية

ملاحظة: هذا البروتوكول مقتبس من إرشادات الشركة المصنعة للجهاز.

  1. تحديث البرنامج مع المعلمات صياغة من خلال النقر على الحقول المناسبة (الجدول 2).
  2. ملء حقنة 1 مل مع مزيج الدهون (أعدت في الخطوة 2). قم بإزالة أي فجوات هوائية أو فقاعات في طرف الحقنة وأدخل الحقنة في الجانب الأيمن من الخرطوشة.
  3. ارسم محلول الحمض النووي (المعد في الخطوة 3) في حقنة سعة 3 مل، مع ضمان عدم وجود فقاعات أو فجوات هوائية في طرف الحقنة. أدخل المحاقن في المدخل الأيسر للخرطوشة.
    ملاحظة: يتم توفير وحدات التخزين لجعل حل 1 مل LNPs. ويمكن أن تتضمن هذه الأداة أحجام حقن تصل إلى 10 مل، ويمكن تحجيم الأحجام وفقا لذلك دون أي تأثير على النتيجة. الحد الأقصى لحجم LNPs التي يمكن إعدادها في إعداد واحد هو 12 مل.
  4. تسمية أنبوب مخروطي خالية من RNase 15 مل مع اسم العينة وإدراجها في مقطع الأنبوب الأيسر. ضع مخروطي نفايات سعة 15 مل في مقطع الأنبوب الأيمن.
  5. أغلق غطاء الأداة وانقر فوق تشغيل، بعد تأكيد الإدخال الصحيح للمعلمات.
  6. بعد الانتهاء من تشغيل الجهاز، تجاهل حاوية النفايات والخرطوشة بشكل صحيح. احتفظ بالأنبوب المخروطي مع عينة LNP.
  7. تمييع LNP 5x مع برنامج تلفزيوني لتقليل الإيثانول إلى <5٪ (v/v).
    ملاحظة: من المهم تخفيف LNPs في برنامج تلفزيوني في أقرب وقت ممكن بعد خلط microfluidic لمنع التدهور. دائما أداء التخفيف في خزانة السلامة البيولوجية والاستمرار في العمل في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية في جميع أنحاء التبادلات العازلة.

6. تبادل المخزن المؤقت

ملاحظة: يتم توفير بروتوكول لاستخدام مرشحات الطرد المركزي فائقة. بينما ينتج عن هذا الأسلوب تبادل أكثر كفاءة الوقت من المخازن المؤقتة، يمكن استبدال غسيل الكلى هنا.

  1. قم بغسل فلتر طرد مركزي فائق (بحجم 100 كيلودا مسام) مع 2 مل من برنامج تلفزيوني عن طريق الطرد المركزي عند 1000 × ز لمدة 5 دقائق. إفراغ برنامج تلفزيوني من المقصورة السفلية.
    ملاحظة: يتم اختيار برنامج تلفزيوني لزيادة درجة الحموضة إلى 7.4 ± 0.2، وهو أمر ذو صلة من الناحية الفسيولوجية وسيؤدي إلى الدهون المؤينة وجود تهمة محايدة.
  2. أضف LNPs المخفف إلى المقصورة العلوية لمرشح الطرد المركزي فائق الغسيل والمطرد المركزي الذي تم غسله مسبقا عند 1000 × ز لمدة 12 دقيقة.
  3. تجاهل التدفق من خلال المقصورة السفلية. قم بإجراء غسلين إضافيين بإضافة 5 مل من برنامج تلفزيوني إلى فلتر الطرد المركزي الفائق في كل مرة. جهاز طرد مركزي بنفس المعلمات. لا يوجد حد أقصى لحجم التخزين الذي يجب الاحتفاظ به.
    ملاحظة: إذا تم إعداد حجم زيادة LNPs، زيادة حجم برنامج تلفزيوني لكل غسل وفقا لذلك. على سبيل المثال، إذا تم إعداد 2 مل من LNPs في شوط واحد، ثم اقترح 10 مل برنامج تلفزيوني لكل غسل.
  4. Pipette حل الشرطة الوطنية الليبيرية ضد جدران فلتر الطرد المركزي فائقة عدة مرات للحد من فقدان الشرطة الوطنية الليبيرية. قم بإزالة محلول LNP من فلتر الطرد المركزي فائق السعة وتخزينه في قارورة خالية من النيوكليز. إضافة برنامج تلفزيوني إذا لزم الأمر لتحقيق حجم نهائي من حل الشرطة الوطنية الليبيرية من 1 مل.
  5. فلتر من خلال مرشح حقنة 0.2 ميكرومتر مبلل مسبقا، إذا لزم الأمر.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.

7. قياس كفاءة التغليف

  1. إعداد منحنى قياسي عن طريق جعل 2 أضعاف المخففات التسلسلية من محلول حمض النووي العامل في برنامج تلفزيوني، بدءا من أعلى تركيز 500 نانوغرام / مل، وجعل ما لا يقل عن خمسة التخفيفات. استخدام برنامج تلفزيوني باعتبارها فارغة.
  2. إعداد مخففات عينة LNP. تمييع عينات LNP مع برنامج تلفزيوني، لتحقيق تركيز نظري تقريبي التي تقع حول نقطة منتصف منحنى القياسية (على سبيل المثال~ 250 نانوغرام / مل من حمض النيوكليك المقدر من التركيز الأولي).
  3. إعداد حل لمكواة قياس الحمض النووي الريبي (لقياسات الحمض النووي الريبي) مع TritonX-100 لتعطيل LNPs وقياس الكمية الإجمالية للحمض النووي داخل وخارج الشرطة الوطنية الليبيرية. يحتوي هذا الحل على 0.5٪ (v/v) كاشف الحمض النووي الريبي، و 0.4٪ (v/v) TritonX-100، و 99.1٪ (v/v) PBS.
  4. إعداد حل للكواشف دون TritonX-100 لقياس كمية حمض النوى غير مغلفة في LNPs. يحتوي هذا الحل على 0.5٪ (v/v) كاشف الحمض النووي الريبي و99.5٪ (v/v) PBS.
    ملاحظة: إذا LNPs تغليف الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل (dsDNA)، مثل الحمض النووي البلازميد، استخدم كاشف dsDNA في 7.3 و 7.4 بدلا من ذلك، بعد نفس الإجراء.
  5. في لوحة 96 جيدا الفلورسينس الأسود قادرة، تحميل ما لا يقل عن أربعة يكرر كل من LNP وحلول الحمض النووي القياسية التي أعدت في 7.1 و 7.2.
  6. إلى نصف النسخ المتماثلة للمعايير والعينات، أضف حجما متساويا من الكاشف الذي يحتوي على TritonX-100. وهذا سوف يحدد كميا الكمية الإجمالية للحمض النووي.
  7. إلى الآبار المتبقية من المعايير والعينات، إضافة حجم متساو من الكاشف دون TritonX-100. وهذا سوف يحدد كميا كمية الحمض النووي غير مغلفة داخل الشرطة الوطنية الليبيرية.
  8. هز اللوحة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لضمان خلط شامل للمعايير والعينات مع الكاشف المضاف ، مع اتخاذ الاحتياطات اللازمة لتجنب التعرض للضوء.
  9. قياس الفلورسينس باستخدام قارئ microplate، مع الطول الموجي الإثارة من 480 نانومتر وطول موجي انبعاث 520 نانومتر.
  10. حساب تركيز حمض النوى خارج الشرطة الوطنية الليبيرية باستخدام منحنى القياسية المصنوعة مع إضافة الكاشف دون TritonX-100. ضرب من قبل عامل التخفيف المستخدمة في 7.2.
  11. حساب تركيز حمض النوى داخل وخارج الشرطة الوطنية الليبيرية باستخدام منحنى القياسية المصنوعة مع إضافة الكاشف الذي يحتوي على TritonX-100. ضرب من قبل عامل التخفيف المستخدمة في 7.2.
  12. حساب تركيز الحمض النووي داخل بطرح تركيز الحمض النووي خارج (محسوبة من الخطوة 7.10) من التركيز الكلي للحمض النووي داخل وخارج (محسوبة من الخطوة 7.11)
  13. قياس كفاءة التغليف من نسبة تركيز الحمض النووي داخل LNP (محسوبة من الخطوة 7.12) والتركيز الكلي للحمض النووي (محسوبة من الخطوة 7.11).
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.

8. تعديلات التركيز

  1. إذا لزم الأمر، ضبط تركيز حمض النوى داخل محلول LNP باستخدام النتائج من كفاءة التغليف.
  2. إذا كان الحل أقل تركيزا هو المطلوب، تمييع الحل مع برنامج تلفزيوني لتحقيق التركيز المطلوب.
  3. إذا كان هناك حل أكثر تركيزا، قم بإجراء تشغيل طرد مركزي إضافي باستخدام فلتر طرد مركزي فائق.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.

9. قياس حجم الهيدروديناميكية LNP وتعدد التخصصات

  1. تمييع aliquot من LNP الحل 40x مع برنامج تلفزيوني للحصول على حجم نهائي من 1 مل.
    ملاحظة: قد يتم تغيير هذا التخفيف إذا لزم الأمر. ويقترح هذا التخفيف القيمة لأنها تستخدم كمية صغيرة من الأسهم LNP الحل مع توفير نتائج الجودة.
  2. باستخدام cuvette شبه مايكرو، وقياس القطر الهيدروديناميكي ومؤشر تعدد الأضلاع. إضافة حل الشرطة الوطنية الليبيرية في cuvette وإدراجها في الصك. إعداد إجراء تشغيل في برنامج الجهاز لتضمين نوع القياس وتفاصيل العينة (المواد والتشتت ودرجة الحرارة ونوع الخلية) وتعليمات القياس (عدد الأشواط). انقر فوق ابدأ عندما تكون جاهزة لبدء اكتساب القياس.

10. قياس LNP زيتا المحتملة

  1. تمييع aliquot من LNP الحل 40x مع ماء خالية من النيوكليز للحصول على حجم النهائي من 1 مل.
    ملاحظة: يستخدم ماء Nuclease الحر كمذيب للقياسات المحتملة زيتا لتقليل تأثير مخازن الملح العالية على الموصلية.
  2. باستخدام خلية زيتا الشعرية مطوية، وقياس إمكانات زيتا.
    1. إضافة حل LNP في cuvette يصل إلى خط التعبئة. أدخل في الجهاز لضمان أن الأقطاب الكهربائية تجري اتصالات مع الجهاز.
    2. إعداد إجراء تشغيل في برنامج الجهاز لتضمين نوع القياس وتفاصيل العينة (المواد والتشتت ودرجة الحرارة ونوع الخلية) وتعليمات القياس (عدد الأشواط). انقر فوق ابدأ عندما تكون جاهزة لبدء اكتساب القياس.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تطوير دفعات متعددة من LNPs بنفس تركيبة الدهون ونسبة N /P من 6 في أيام منفصلة لإثبات قابلية إعادة إنتاج هذه التقنية. وأسفرت الدفعة 1 و 2 عن تداخل توزيعات الحجم مع تعدد تشتت مماثل(الشكل 2A)لم يلاحظ أي فرق كبير في الحجم أو كفاءة التغليف بين الدفعتين المختلفتين(الشكل 2B). كانت كفاءة التغليف عالية لكل دفعة (>98.5٪) وكانت الأحجام متشابهة بقطر 77 نانومتر LNP. وكانت الجسيمات موحدة بمتوسط مؤشر تعدد الأضلاع (PDI) قدره 0.15 للدفعة 1 و...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعد إمكانية إعادة الإنتاج والسرعة وانخفاض الحجم مزايا كبيرة لاستخدام خلط السائل الدقيق لتشكيل LNPs مقارنة بالطرق الأخرى الموجودة (على سبيل المثال ، ترطيب فيلم الدهون وحقن الإيثانول). لقد أثبتنا قابلية استنساخ هذه الطريقة دون أي تأثير على كفاءة التغليف أو حجم الجسيمات الملاحظ مع دفعات LNP المختلفة. هذا هو المعيار الأساسي لأي العلاجية، بما في ذلك LNPs، لتصبح متاحة سريريا.

تستخدم التقنية الموصوفة هنا خلطا متداخلا لعظم الرنجة الدقيق ، مما يؤدي إلى تشكيل LNP على النطاق الزمني لبضع دقائق فقط. يستخدم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جميع المؤلفين هم من موظفي سانوفي. ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لديهما تضارب في المصالح أو مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

شكرا لأتول سالوجا، ياتين غوكارن، ماريا تيريزا بيراتشيا، والتر شوينجر، وفيليب زاكاس على توجيهاتهم ومساهماتهم في تطوير الشرطة الوطنية الليبيرية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1،2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000 (C-14 PEG)Avanti Polar Lipids880151P
10 & micro ; ل نصائح تصفية متدرجة   ؛ (RNase - ، DNase - ، خالي من الحمض النووي)الولايات المتحدة الأمريكية العلمية1121-3810
1000 & ل نصائح مرشح متدرجة (RNase - ، DNase - ، خالية من الحمض النووي) الولاياتالمتحدة الأمريكية العلمية1111-2831
20 & micro ؛ ل نصائح مرشح مشطوفة (RNase - ، DNase - ، خالية من الحمض النووي)الولايات المتحدة الأمريكية العلمية1120-1810
200 & micro ؛ ل نصائح المرشح المتخرج (RNase - ، DNase - ، خالية من الحمض النووي)الولايات المتحدة الأمريكية العلمية1120-8810
3 & بيتا ؛ - هيدروكسي -5 كوليستين ، 5-كوليستين -3 بيتا ؛ -ol (الكوليسترول)سيجما ألدريتشC8667
BD محاقن معقمة ذات طرف انزلاق (حقنة 1 مل)تحاقن معقمة من Thermo FisherScientific 14-823-434
BD Slip Tip محاقن معقمة (حقنة 3 مل)Thermo Fisher Scientific14-823-436
BD Vacutainer إبر حقنة للاستخدام العام (إبرة تعبئة BD Blunt 18G)Thermo Fisher Scientific23-021-020
جهاز طرد مركزي منضدةبيكمان كولتر
أسود 96 ألواح بئرThermo Fisher Scientific14-245-177
BrandTech BRAND BIO-CERT RNase- و DNase وأنابيب الطرد المركزي الدقيقة الخالية من الحمض النووي (1.5 مل)Thermo Fisher Scientific14-380-813
حامض الستريكفيشر العلمي02-002-611
كورنينج 500 مل نظام فلتر فراغ / زجاجة تخزين ، 0.22 ميكرومتركورنينج430769
خلايا شعرية مطوية يمكن التخلص منهامالفيرنDTS1070
كحول إيثيلي ، نقي 200 دليلعلى سيجما ألدريتش459844
فيشر العلامة التجارية شبه مايكرو كوفيتثيرمو فيشر الأنابيب
Invitrogen (15 مل) (خالية من DNase-RNase) ThermoFisher ScientificAM12500
MilliporeSigma Amicon وحدات تصفية الطرد المركزيالفائقة Thermo Fisher ScientificUFC901024
NanoAssemblr BenchtopPrecision Nanyosystems
مياه خالية من النوكليازThermo Fisher ScientificAM9930
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ThermoFisher ScientificAM9624
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay KitThermo Fisher Scientific  P7589
Quant-iT RiboGreen RNA Assay KitThermo Fisher ScientificR11490
كلوريد الصوديومفيشر Scientific02-004-036
سترات الصوديوم ، ثنائي الهيدرات ، الحبيباتفيشر Scientific02-004-056
SpectraMax i3xالأجهزة
Zetasizer NanoMalvern
المخروطية 14955127 Scientificالجزيئية

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mitchell, M. J., Billingsley, M. M., Haley, R. M., Wechsler, M. E., Peppas, N. A., Langer, R., et al. Engineering precision nanoparticles for drug delivery. Nature Reviews Drug Discovery. , 1-24 (2020).
  2. Davis, M. E., Chen, Z., Shin, D. M. Nanoparticle therapeutics: an emerging treatment modality for cancer. Nanoscience and technology: A collection of reviews from nature journals. (239), 250(2010).
  3. Patra, J. K., Das, G., Fraceto, L. F., et al. Nano based drug delivery systems: recent developments and future prospects. J Nanobiotechnol. 16 (71), (2018).
  4. Rai, R., Alwani, S., Badea, I. Polymeric nanoparticles in gene therapy: New avenues of design and optimization for delivery applications. Polymers. 11 (4), 745(2019).
  5. Bailey, C. M., Nagarajan, R., Camesano, T. A. Designing polymer micelles of controlled size, stability, and functionality for siRNA delivery. ACS Symposium Series. 1271, 35-70 (2017).
  6. Yin, H., et al. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nature Reviews Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).
  7. Bailey-Hytholt, C. M., Nagarajan, R., Camesano, T. A. Förster resonance energy transfer probing of assembly and disassembly of short interfering RNA/Poly(ethylene glycol)-Poly-L-Lysine polyion complex micelles. Molecular Assemblies: Characterization and Applications. , 47-60 (2020).
  8. Puri, A., Loomis, K., Smith, B. Lipid-based nanoparticles as pharmaceutical drug carriers: from concepts to clinic. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 26 (6), 523-580 (2009).
  9. Cullis, P. R., Hope, M. J. Lipid nanoparticle systems for enabling gene therapies. Molecular Therapy. 25 (7), 1467-1475 (2017).
  10. Munsell, E. V., Ross, N. L., Sullivan, M. O. Journey to the center of the cell: Current Nanocarrier design strategies targeting biopharmaceuticals to the cytoplasm an nucleus. Current Pharmaceutical Design. 22 (9), 1227-1244 (2016).
  11. Zhao, Y., Huang, L. Lipid nanoparticles for gene delivery. Advances in Genetics. 88, 13-36 (2014).
  12. Chen, S., et al. Influence of particle size on the in vivo potency of lipid nanoparticle formulations of siRNA. Journal of Controlled Release. 235, 236-244 (2016).
  13. Wan, C., Allen, T. M., Cullis, P. R. Lipid nanoparticle delivery systems for siRNA-based therapeutics. Drug Delivery and Translational Research. 4 (1), 74-83 (2014).
  14. Kulkarni, J. A., Cullis, P. R., Van Der Meel, R. Lipid nanoparticles enabling gene therapies: From concepts to clinical utility. Nucleic Acid Therapeutics. 28 (3), 146-157 (2018).
  15. Shin, M. D., et al. COVID-19 vaccine development and a potential nanomaterial path forward. Nature Nanotechnology. 15 (8), 646-655 (2020).
  16. Thanh Le, T., et al. The COVID-19 vaccine development landscape. Nature Reviews. Drug Discovery. 19 (5), 305-306 (2020).
  17. Tam, Y. Y. C., Chen, S., Cullis, P. R. Advances in lipid nanoparticles for siRNA delivery. Pharmaceutics. 5 (3), 498-507 (2013).
  18. Cayabyab, C., Brown, A., Tharmarajah, G., Thomas, A. mRNA lipid nanoparticles. Precision Nanosystems Application Note. , (2019).
  19. Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nature Biotechnology. 31 (7), 638-646 (2013).
  20. Suzuki, Y., Ishihara, H. Structure, activity and uptake mechanism of siRNA-lipid nanoparticles with an asymmetric ionizable lipid. International Journal of Pharmaceutics. 510 (1), 350-358 (2016).
  21. Kowalski, P. S., Rudra, A., Miao, L., Anderson, D. G. Delivering the messenger: Advances in technologies for therapeutic mRNA delivery. Molecular Therapy. 27 (4), 710-728 (2019).
  22. Schmid, J. A. The acidic environment in endocytic compartments. Biochemical Journal. 303 (2), 679-680 (1994).
  23. Maugeri, M., et al. Linkage between endosomal escape of LNP-mRNA and loading into EVs for transport to other cells. Nature Communications. 10 (1), (2019).
  24. Kulkarni, J. A., Witzigmann, D., Leung, J., Tam, Y., Cullis, P. R. On the role of helper lipids in lipid nanoparticle formulations of siRNA. Nanoscale. (45), (2019).
  25. Hafez, I. M., Maurer, N., Cullis, P. R. On the mechanism whereby cationic lipids promote intracellular delivery of polynucleic acids. Gene Therapy. 8 (15), 1188-1196 (2001).
  26. Hafez, I. M., Culis, P. R. Roles of lipid polymorphism in intracellular delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 47 (2-3), 139-148 (2001).
  27. Evers, M. J. W., et al. State-of-the-art design and rapid-mixing production techniques of lipid nanoparticles for nucleic acid delivery. Small Methods. 2 (9), 1700375(2018).
  28. Mui, B. L., et al. Influence of polyethylene glycol lipid desorption rates on pharmacokinetics and pharmacodynamics of siRNA lipid nanoparticles. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 2 (139), (2013).
  29. Zukancic, D., et al. The importance of poly(Ethylene glycol) and lipid structure in targeted gene delivery to lymph nodes by lipid nanoparticles. Pharmaceutics. 12 (11), 1-16 (2020).
  30. NEBioCalculator. New England BioLabs Inc. , Available from: https://nebiocalculator.neb.com/#!/formulas (2020).
  31. Kastner, E., et al. High-throughput manufacturing of size-tuned liposomes by a new microfluidics method using enhanced statistical tools for characterization. International Journal of Pharmaceutics. 477 (1-2), 361-368 (2014).
  32. Zhigaltsev, I. V., et al. Bottom-up design and synthesis of limit size lipid nanoparticle systems with aqueous and triglyceride cores using millisecond microfluidic mixing. Langmuir. 28 (7), 3633-3640 (2012).
  33. Belliveau, N. M., et al. Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipid nanoparticles for in vivo delivery of siRNA. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1 (8), 37(2012).
  34. Hassett, K. J., et al. Optimization of lipid nanoparticles for intramuscular administration of mRNA vaccines. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 15, 1-11 (2019).
  35. Tanaka, H., et al. The delivery of mRNA to colon inflammatory lesions by lipid-nano-particles containing environmentally-sensitive lipid-like materials with oleic acid scaffolds. Heliyon. 4 (12), 00959(2018).
  36. Singh, J., et al. Nucleic acid lipid nanoparticles. Precision Nanosystems Application Note. , (2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة