يوفر هذا البروتوكول إرشادات مفصلة لعملية زرع الأعضاء الأولية والمستمرة لأورام ذبابة الفاكهة في بطن المضيفين البالغين لدراسة الجوانب المختلفة للأورام. باستخدام جهاز الحقن الذاتي ، يمكن للباحثين تحقيق كفاءة محسنة وغلة الورم مقارنة بتلك التي تحققت بالطرق اليدوية التقليدية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
زرع الورم في ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر مع حاقن نانولتر تلقائي قابل للبرمجة
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يصف هذا البروتوكول عملية زرع الأورام في ذبابة الفاكهة باستخدام جهاز حقن نانولتر تلقائي. باستخدام جهاز الحاقن الذاتي ، يمكن للمشغلين المدربين تحقيق نتائج زرع أكثر كفاءة واتساقا مقارنة بتلك التي تم الحصول عليها باستخدام حاقن يدوي. هنا ، نغطي الموضوعات بطريقة زمنية: من عبور خطوط ذبابة الفاكهة ، إلى تحريض وتشريح الورم الأساسي ، وزرع الورم الأساسي في مضيف بالغ جديد واستمرار زرع الورم من الأجيال لإجراء دراسات موسعة. كعرض توضيحي ، نستخدم هنا المجال داخل الخلايا Notch (NICD) الإفراط في التعبير الناجم عن أورام الحلقة اللعابية الوهمية لزرع الأجيال. يمكن أولا تحفيز هذه الأورام بشكل موثوق به في بيئة مجهرية في منطقة انتقالية داخل الحلقات التخيلية للغدة اللعابية اليرقية ، ثم يتم استزراعها واستزراعها في الجسم الحي لدراسة نمو الورم المستمر وتطوره وانبثاثه. يمكن أن تكون طريقة الزرع هذه مفيدة في برامج فحص الأدوية المحتملة ، وكذلك لدراسة التفاعلات بين الورم والمضيف.
المقدمة
يوفر هذا البروتوكول إرشادات خطوة بخطوة لزرع أورام الحلقة الوهمية للغدة اللعابية اليرقية (SG) في بطن المضيفين البالغين باستخدام جهاز حقن نانولتر تلقائي (على سبيل المثال ، Nanoject). يوفر هذا البروتوكول أيضا توجيهات لإعادة تجميع الأورام لاحقا في أجيال جديدة من المضيفين البالغين ، مما يوفر فرصا لمواصلة الدراسة الطولية لخصائص الورم ، مثل تطور الورم والتفاعلات بين الورم والمضيف. يمكن أيضا تطبيق البروتوكول على تجارب فحص الأدوية.
تم تطوير هذه الطريقة لتحسين فعالية إجراء زراعة الأعضاء في ذبابة الفاكهة باستخدام الحقن اليدوي1 ، والتي غالبا ما تكون غير متسقة في قوى الشفط والحقن ، مما يؤدي إلى نتائج دون المستوى....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد ورم الحلقة الوهمية SG
- عبر الذباب البالغ مع الأنماط الجينية من UAS-NICD (الذكور: 10-15 الذباب) و Act-Gal4 ، UAS-GFP / CyO ؛ tub-Gal80ts (الإناث العذراء: 10-15 الذباب) والسماح لهم بالتكاثر لمدة يوم واحد عند 18 درجة مئوية. يجب أن يكون عمر الذباب البالغ المختار 5-9 أيام لضمان خصوبة عالية.
- اسمح للذباب البالغ بوضع البيض في طعام الذبابة الموجود في القوارير لمدة 24 ساعة عند 18 درجة مئوية ، ثم قم بإزالة الذباب البالغ.
ملاحظة: يتم إعداد الطعام الطائر باستخدام وصفة طعام دقيق الذرة القياسية من مركز ذبابة الفاكهة 8. يجب أن تحتوي كل قارورة على حوالي 10 مل من طعام الذبابة. - اسمح ل....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
هنا ، أجرينا عملية زرع الأجيال لأورام الحلقة الوهمية SG باستخدام جهاز الحقن الذاتي لحقن النانولتر وأجرينا تصويرا حيا لاحقا للورم باستخدام مجهر المسح الضوئي بالليزر البؤري ، مما سمح بالغوص بشكل أعمق في مواضيع نمو الورم ، وهجرة الخلايا السرطانية ، والتفاعلات بين الورم والمضيف. عند تركيب الذباب ، قم بلصقها على شريحة مجهرية وكبح جماحها عبر كتلة polydimethylsiloxane (PDMS)11.
يتميز الشكل 5A بالتقاط تصوير حي لورم حلقة وهمية من الجيلالأول
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يمكن أن يساعد زرع الورم الباحثين على معالجة بعض المشاكل التي تنشأ أثناء نمو ورم ذبابة الفاكهة وتقدمه. أحد هذه التحديات هو التحايل على الوفيات المبكرة لليرقات الحاملة للورم أو البالغين أثناء زراعة الورم الأولية12. في هذا السياق ، يسمح استمرار زراعة الورم للأورام بالنمو إلى أجل غير مسمى ، مما يسهل الدراسات الطولية لنمو الورم والانبثاث والتطور. زرع الورم مفيد أيضا لتقييم الجوانب المختلفة للتفاعلات بين المضيف والورم 7,13. يمكن التلاعب.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
لا يوجد تضارب في المصالح للإعلان عنه بين المؤلفين.
شكر وتقدير
نشكر أعضاء المختبر السابقين الدكتور شنغ آن يانغ والسيد خوان مارتن بورتيلا على مساهمتهم في تطوير هذا البروتوكول. نحن ممتنون لمختبر الدكتور يان سونغ في كلية علوم الحياة بجامعة بكين لمشاركة بروتوكولهم بشأن الزرع اليدوي. كما نشكر السيد كالدر إلسورث والسيد إيفرست شابيرو على القراءة النقدية للمخطوطة.
تلقت أسلحة الدمار الشامل تمويلا (GM072562 و CA224381 و CA227789) لهذا العمل من المعهد الوطني للصحة (https://www.nih.gov/) وتمويلا (IOS-155790) من المؤسسة الوطنية للعلوم (htps://nsf.gov/). لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات وتحليلها أو اتخاذ قرار النشر أو إعداد المخطوطة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر | Zeiss | LSM 980 | المعروف أيضا باسم "Zeiss LSM 980" |
| طباب دقيق الذرة | Fly Food Bloomington ذبابة الفاكهة Stock Center | N / A | المعروف أيضا باسم "BDSC Standard Corn Food" |
| إبرة التشريح (30Gx1 / 2) | BD PrecisionGlide | 305106 | |
| لوحة | تشريح فيشر Scientific | 12-565B | |
| يطير الشريط | فيشربراند | 159015A | |
| محول الفلور لعلوم المجهر الإلكتروني Stero | SFA-UV | المعروف أيضا باسم "محول التألق NightSea" مجهر | |
| الفلور | Zeiss | 495015-0001-000 | المعروف أيضا باسم "Zeiss Stereo Discovery.V8" |
| العلوم الدقيقة | الملقط | 11251-10 | يعرف أيضا باسم "Dumont # 5 Fallps" |
| الشعيرات الدموية الزجاجية (3.5 بوصة) | Drummond | 3-000-203-G / X | |
| Glue | Elmer | E305 | المعروف أيضا باسم "Elmer Washabale Clear Glue" |
| المجهر الضوئي | Zeiss | 435063-9010-100 | المعروف أيضا باسم "Zeiss Stemi 305" |
| Micropipette Puller | World Precision Instruments | PUL-1000 | المعروف أيضا باسم "مجتذب الماصات الدقيقة ذات الأربع خطوات" |
| جهاز Nanoject | Drummond | 3-000-204 | المعروف أيضا باسم" حاقن Nanoject II Auto-Nanoliter " |
| 21720001 | ThermoFisher | المتوسطة من شنايدر | |
| (27G x1 / 2) BD | PrecisionGlide | 305109 | |
| قارورة | Fisherbrand | AS507 |
المراجع
- Rossi, F., Gonzalez, C. Studying tumor growth in Drosophila using the tissue allograft method. Nature Protocols. 10 (10), 1525-1534 (2015).
- Magadi, S. S., et al. Dissecting Hes-centred transcriptional networks in neural stem....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
