مقالة منهجية

تغيير المرحلة قطرات دقيقة ذات قشرة ثنائي ميثيل ديوكتاديلامونيوم كنظام واعد لتوصيل الأدوية: نتائج على الكرات ثلاثية الأبعاد للخلايا السرطانية للثدييات

DOI:

10.3791/62255

⸱

مارس 14, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical Sciences and Technologies, University of Rome Tor Vergata, 2Department of Molecular Medicine, Sapienza University of Rome

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أظهرت القطرات الدقيقة اللاصقة فلور أوبنتان التي تم تطويرها بغلاف من بروميد ثنائي ميثيل ديوكتاديسيلامونيوم استقرارا غرويا استثنائيا وواجهة حيوية فاعلة. أثبتت DDAB-MDs أنها خزانات دوائية فعالة تتميز بتقارب عال مع أغشية البلازما جنبا إلى جنب مع امتصاص معزز ونشاط مضاد للأورام من دوكسوروبيسين ضد نموذج ثلاثي الأبعاد لسرطان الثدي البشري الثلاثي السلبي (MDA-MB-231).

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمر التحسن الكبير في قطرات الكربون المشبعة بالفلور (MDs) في السيناريو العلاجي الواسع من خلال تحسين تكوين MDs فيما يتعلق بكفاءة التوليف والاستقرار والقدرة على توصيل الأدوية. لهذا الهدف ، تم تصميم MDs من الديكافلور أوبنتان (DFP) التي تم تثبيتها بواسطة غلاف من الفاعل بالسطح الكاتيوني ثنائي ميثيل ديوكتاديلامونيوم بروميد (DDAB). تم الحصول على تركيز عال من DDAB-MDs بسهولة في غضون ثوان قليلة عن طريق الرنين النبضي عالي الطاقة ، مما أدى إلى قطرات منخفضة بحجم 1 ميكرومتر. تعد إمكانات ζ الإيجابية للغاية ، جنبا إلى جنب مع سلاسل هيدروكربونية طويلة ومشبعة لغلاف DDAB ، عوامل رئيسية لتثبيت القطرة وشحنة المخدرات فيها. يسمح التقارب العالي لغلاف DDAB مع غشاء بلازما الخلية بتوصيل العلاج الكيميائي الموضعي عن طريق زيادة تركيز الدواء في واجهة الخلية السرطانية وتعزيز الامتصاص. هذا من شأنه أن يحول DDAB-MDs إلى أداة توصيل الأدوية ذات الصلة التي تظهر نشاطا عاليا مضادا للأورام بجرعات منخفضة جدا من الدواء.

في هذا العمل ، تبين أن فعالية مثل هذا النهج تحسن بشكل كبير تأثير دوكسوروبيسين ضد الأفرقية ثلاثية الأبعاد للخلايا السرطانية للثدييات ، MDA-MB-231. إن استخدام مزارع الخلايا ثلاثية الأبعاد (3D) التي تم تطويرها في شكل كرويات ورمية متعددة الخلايا (أي خلايا معبأة بكثافة في شكل كروي) له مزايا عديدة مقارنة بمزارع الخلايا ثنائية الأبعاد: بالإضافة إلى القدرة على سد الفجوة بين الدراسات التقليدية في المختبر والتجارب على ، فإنه سيحسن القدرة على أداء المزيد من التنبؤ في المختبر فحوصات الفحص لتطوير الأدوية قبل السريرية أو تقييم إمكانات الأدوية خارج التسمية واستراتيجيات الاستهداف المشترك الجديدة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعتبر نواقل توصيل الأدوية القادرة على ضمان فعالية عالية مضادة للأورام وتقليل الآثار الجانبية أهدافا أساسية بينما تظل تمثل تحديا كيميائيا صيدلياشديدا 1،2. حتى الآن ، كان تقدمهم محدودا في البداية بسبب التباين بين عدم كفاية إطلاق الدواء في الموقع والمستوى الحرج من السمية غير المحددة3 ، 4 ، 5. في السنوات الأخيرة ، تم تنفيذ العديد من أنظمة توصيل الأدوية لتحسين إدارة العوامل المضادة للسرطان ، بما في ذلك الجسيمات الشحمية ، والمذيلات البوليمرية ، والبوليمرات6،7،8،9،10. تظهر هذه الأنظمة إمكانات في زيادة وقت الدورة الدموية وانتقائية الأدوية ، مع تقليل التوزيع والتراكم في الأعضاء والأنسجة السليمة. على أي حال ، أدت التركيبات المغلفة لأدوية العلاج الكيميائي المضادة للأورام ، مثل الأنثراسيكلين ، إلى انخفاض كبير في كفاءة استيعاب الأدوية. في الآونة الأخيرة ، اكتسبت ناقلات الميكرون وتحت الميكرون المستجيبة للمنبهات مثل الفقاعاتالدقيقة 11 ، والقطرات الدقيقة ، وجسيمات الذهب النانويةالهجينة 12 ، والهيدروجيلاتالنانوية 13 ، وسقالات PLGA ، والمنصات المسامية14 ، اهتماما دوائيا لتعدد استخداماتها العالية في استهداف وممارسة التأثيرات المثبطة للورم باستخدام دوكسوروبيسين (Dox) و docetaxel. مهدت التجارب الرائدة لتحويل هذه الناقلات إلى جنود فعالين مضادين للسرطان للمهام متعددة الوسائط (أي الأساليب الكيميائية والحرارية الضوئية والتآزر الجيني) والتصوير الجزيئي15 الطريق للطب النانوي العلاجي الشخصي.

في هذا السيناريو ، تم تقييم القطرات الدقيقة المشبعة بالفلور الكربونية (MDs) من خلال الفرصة الرئيسية التي توفرها لاقتران التحميل العالي لشحنات الأدوية ، والتنوع الكيميائي لقذيفة MDs التي تعالج الحواجز البيولوجية ، والاستقرار الغروي وكفاءة التوليف11،12. كأصل إضافي ، فإن صدى MDs التي يتم الترويج لها عن طريق التبخير الصوتي أو البصري لقلب الكربون المشبع بالفلور (PFC) تسمح باكتساب التصوير في الموقع والفعالية العلاجية الواعدة. علاوة على ذلك ، يمكن استغلال التبخر الأساسي MDs الذي تم الحصول عليه عن طريق إطلاق الطاقة لحزم الجسيمات المؤينة لتتبع الحزمة وقياس جرعات الإشعاع.

تهدف الدراسة الحالية إلى تطوير قطرات دقيقة من ديكافلور أوبنتان (DFP) مثبتة بواسطة غلاف متعدد قابل للاستخدام من الفاعل بالسطح الكاتيوني ثنائي ميثيل ديوكتاديسيلامونيوم بروميد (DDAB). تلبي DDAB المقشرة التوقعات الفيزيائية والكيميائية والبيولوجية. ثبت أن القطرات الدقيقة القائمة على DFP هي عوامل تباين قيمة لتغيير الطور لتحقيق MDs متوافقة حيويا ومستقرة للكربونالمشبع بالفلور 16. يشبع الجل البلوري DDAB السلاسل الطويلة عند درجة حرارة فسيولوجية ، ويخترق بعمق اللب الكارهة للماء ، ويثبت القطرة وشحنة المخدرات فيها. علاوة على ذلك ، فإن ζ الإمكانات الإيجابية العالية في واجهة الماء تعزز الاستقرار الغروي ل MDs. تكمن الجاذبية البيولوجية لسطح قشرة DDAB في القدرة على التسبب في موت البكتيريا والفطريات ، بتركيزات بالكاد تؤثر على خلايا الثدييات ، وربط أغشية البلازما أو البروتينات المستضدية سالبة الشحنة أو النيوكليوتيدات أو الحمض النووي أو الجسيمات النانوية. يمكن استغلال الميزات المذكورة أعلاه لتوليد عامل مناعي رائع وعلاج جيني وعمل مضاد للأورام داخل خلايا الثدييات17.

تعزز DDAB-MDs المحملة ب Dox (Dox@DDAB-MDs) الموصوفة هنا إطلاق الدواء ضد خلايا سرطان الثدي الثلاثية السلبية شديدة العدوانية والغازية وضعيفة التمايز. يتم وصف بروتوكول بسيط وسريع أدناه بناء على تناغم مسبار عالي الطاقة للحصول على DDAB-MDs مستقرة وعالية الكثافة مع توزيع ضيق الحجم مع كفاءة تحميل عالية ل Dox في تركيبة من خطوة واحدة. هذه الخصائص تنافسية حتى بالنسبة لطرق التحضير الأخرى مثل أجهزة الموائع الدقيقة والمجانسات عاليةالقص 16.

القضية الرئيسية الأخرى المقيدة في تصميم نواقل توصيل الأدوية الفعالة هي أن نشاط الدواء هو دالة لمعلمات مختلفة (على سبيل المثال ، الامتصاص والتوزيع والتركيزات) يمكن الحصول عليها في هدف بيولوجي فعلي ، والتي لا يمكن اعتبارها بواسطة نماذج الخلايا أحاديةالطبقة 18. لهذا السبب ، فإن تاريخ تطوير تركيبات جديدة مضادة للأورام مرصع بالدراسات المختبرية التي أدت للأسف إلى عدم فعاليتها بالفعل على مستوى النماذج قبل السريرية في19.

على وجه الخصوص ، ترتبط الحاجة إلى الانتقال من مزارع الخلايا إلى نظام أكثر تعقيدا وموثوقية من الدراسات في الجسم الحي وخارج الجسم الحي بالقيود المتأصلة في الدراسات الدوائية على الثقافات ثنائية الأبعاد. في هذا السياق ، يتم تضمين أنظمة 3D في المختبر ، مثل الكرويات ، والعضيات ، والأعضاء على الرقاقة ، والتي تحاكي التشكل والنشاط والاستجابة الفسيولوجية للهياكل الأكثر تعقيدا من الطبقات الأحاديةثنائية الأبعاد 20. من وجهة نظر ما قبل السريرية ، توفر نماذج الخلايا ثلاثية الأبعاد التي تحاكي البيئة المكروية الخلوية إمكانية فهم علم الأحياء المعقد بشكل أفضل في إطار أكثر صلة من الناحية الفسيولوجية حيث لا تكون الثقافات التقليدية أحادية الطبقة فعالة21،22.

بعد إثبات أن DDAB-MDs يمكن أن تتفاعل مع غشاء الخلية لخلايا سرطان الثدي البشرية ، مما يفضل استيعاب الدواء وموت الخلايا بتركيز دوكس منخفض جدا (نانومولاري) ، تم اختبار فعالية هذه المنهجية ضد الفيرويات ثلاثية الأبعاد للخلايا السرطانية للثدييات ، MDA-MB-231.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: جميع الكواشف والأدوات مدرجة في جدول المواد.

1. تصنيع وتوصيف القطرات الدقيقة

  1. إعداد DDAB-MDs المحملة ب Dox
    1. قم بإذابة مسحوق DDAB في الإيثانول للحصول على تركيز نهائي يبلغ 10 ملي وحجم نهائي يبلغ 1 مل. تحضير 1 مل من محلول مخزون دوكس لإذابة 2 مجم مسحوق دوكس في الإيثانول.
      تنبيه: من المعروف أن Dox لديه سمية فموية حادة ، من الفئة 4 والسرطنة ، الفئة 1 ب. استخدمه فقط تحت غطاء الدخان مع القفازات والقناع الصحي.
    2. أضف 250 ميكرولتر من DFP إلى 300 ميكرولتر من محلول DDAB (طور الزيت) في أنبوب طرد مركزي متدرج من البلاستيك سعة 15 مل.
      ملاحظة: نقاء DFP هو 60٪ (GC) ، الكثافة 1.6 جم / مل (20 درجة مئوية) ، نقطة الغليان 55 درجة مئوية. نقاء دوكس هو 98 ، 0-102 ، 0٪ (HPLC). نقاء DDAB هو ≥98٪ (TLC). نقاء الإيثانول 97٪.
    3. أضف برفق 2.15 مل من الماء منزوع الأيونات في طور الزيت مما ينتج عنه خليط ماء / زيت على مرحلتين. قم بحقن 10 ميكرولتر من محلول Dox برفق مباشرة في طور الزيت مباشرة قبل الطنين لتجنب تقسيم كمية كبيرة من Dox في الطور المائي.
    4. استحلاب الخليط ثنائي الطور عن طريق الرنين المسبار (مع 1/8 في التيتانيوم المدبب microtip) باستخدام معدات معالج سائل بالموجات فوق الصوتية عالية الكثافة في وضع النبض (0.7 ثانية تشغيل و 0.3 ثانية إيقاف) عند 20 كيلو هرتز ، 100 واط لمدة 10 ثوان. قم بتخفيف MDs المحضرة حديثا على الفور بالماء منزوع الأيونات عالي الترشيح (على سبيل المثال ، MilliQ) بمعامل 1.8.
      ملاحظة: عامل التخفيف إرشادي ، تم اختياره تجريبيا. يمكن تخفيف محلول MDs أكثر طالما تم الحصول على ما يكفي من الحبيبات من أجهزة الطرد المركزي اللاحقة.
    5. خذ 1 مل من التعليق والطرد المركزي الذي تم الحصول عليه 3x ، مع تعليقه في الماء منزوع الأيونات عالي الترشيح (على سبيل المثال ، MilliQ) لإزالة فائض Dox والإيثانول. قم بإجراء الطرد المركزي الأول عند 25 درجة مئوية ، 360 × جم لمدة 3 دقائق ، والثاني والثالث عند 280 × جم في نفس درجة الحرارة والوقت.
    6. بعد الغسيل الأخير ، قم بإزالة الماء الطافي واسحب 5 ميكرولتر من الكريات وقم بتفريقها في 2 مل من الوسط لمعالجة الخلايا ، والحصول على تركيز Dox مكافئ يبلغ 10 نانومتر ، وخطوات البروتوكول لتخليق Dox@DDAB-MDs موضحة في الشكل 1.
      ملاحظة: يتم تعريف تركيز Dox المكافئ على أنه كمية Dox الحرة الموجودة في نفس حجم تعليق Dox@DDAB-MDs.
  2. توصيف DDAB-MDs المحملة ب Dox
    1. قم بقياس توزيع الحجم باستخدام مقياس ضوئي لتشتت الضوء الديناميكي (DLS) وقم بتحليل الارتباطات التي تم الحصول عليها باستخدام خوارزمية CONTIN لاستقراء أوقات الاضمحلال المرتبطة بها. ثم استخدم أوقات الاضمحلال لتحديد توزيع معاملات انتشار الجسيمات (D) وتحويلها في توزيع الأقطار الهيدروديناميكية (2RH) باستخدام علاقة Stokes-Einstein RH = kBT / 6πηD ، حيث kBT هي الطاقة الحرارية للنظام η لزوجة المذيب.
    2. تحقق من توزيع الحجم والحجم أيضا باستخدام الفحص المجهري للمجال الساطع باستخدام برنامج تحليل الصور (على سبيل المثال ، الصورة J) ، وقياس حجم ما لا يقل عن 100 قطرة لكل إطار (ل 3 أو 4 إطارات) ، والحصول على متوسط القيمة والانحراف المعياري.
      ملاحظة: بالنسبة لقياسات DLS ، قم بتخفيف محلول MDs في الماء منزوع الأيونات عالي الترشيح (على سبيل المثال ، MilliQ) ، PBS وفي وسط زراعة الخلايا لتجنب التشتت الخلوي إلى تركيز ثابت يبلغ 1.5 × 108 MDs / مل. بالنسبة للمياه فائقة الترشيح ، منزوعة الأيونات ، و PBS في وسط زراعة الخلايا ، حصلنا على قيم متوسطة الحجم تبلغ 1.1 ± 0.1 ميكرومتر و 1.1 ± 0.25 ميكرومتر و 1.2 ± 0.2 ميكرومتر ، على التوالي. لا تظهر MDs المستردة من الكريات ، بعد الطرد المركزي ، أي تغييرات في الحجم داخل الأخطاء.
    3. استخدم شريحة غرفة عد الخلايا للفحص المجهري لتقييم تركيز MDs. تتكون الغرفة من منطقتي عد مختلفتين بسمك 0.10 مم. ضع 10 ميكرولتر من تعليق MDs فوق الغرفة. عد MDs داخل مربع 0.25 × 0.25 نانومتر2 من الغرفة باستخدام مجهر بصري مع هدف مسافة طويلة 40x وتحليلها باستخدام برنامج مجاني لتحليل الصور.
    4. احسب تركيز MDs ، معبرا عنه كعدد MDs / مل ، وفقا للمعادلة:
      figure-protocol-1
    5. تحقق من صور Dox الداخلية بواسطة مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر (CLSM) التي تستغل التألق الذاتي Dox عند 590 نانومتر. قم بقياس محتوى Dox باستخدام مقايسة الفلورية ، وتشتيت الجسيمات في الماء الفائق الترشيح أو منزوع الأيونات أو PBS ، والطرد المركزي لها عند 25 درجة مئوية ، 360 × جم لمدة 3 دقائق ثم تحديد كمية الدواء الحر عن طريق تقييم مضان المادة الطافية عند 590 نانومتر مع منحنى معايرة (النطاق الخطي لتركيز Dox: 2-20 ميكرولتر / مل ، R2 = 0.99).
      ملاحظة: اطرح القيمة التي تم الحصول عليها من التركيز الكلي ل Dox للحصول على الكمية المغلفة من Dox. قم بإجراء التجربة في ثلاث نسخ. ينتج عن كفاءة تغليف Dox 28٪ ± 2٪ ، محسوبة بقسمة كمية الدواء من Dox في MDs مع المحتوى الكلي ل Dox المنشور.
    6. قم بإجراء تجارب إطلاق Dox بمرور الوقت ، عن طريق الطرد المركزي وتكرار الإجراء وفقا للخطوة 1.2.3 للحصول على النسبة المئوية ل Dox المنبعثة في المادة الطافية إلى عدد المغلفات. بعد التحديد الأول ، كرر الإجراء عن طريق تقليل سرعة الطرد المركزي إلى 280 × جم لتجنب كسر MDs. ارسم منحنى تحرير بمرور الوقت. تأكد من أن تركيز Dox الذي تم إطلاقه في غضون 24 ساعة في المادة الطافية يصل إلى 20٪ كحد أقصى.
    7. قم بقياس ζ الجهد عند 37 درجة مئوية باستخدام جهاز مخصص (على سبيل المثال ، NanoZetaSizer) وتحقق من أن القيم التي تم الحصول عليها حوالي 90-100 مللي فولت.

2. تصنيع الكرويات في ركائز غير لاصقة مصبوبة دقيقة

  1. صب القوالب الدقيقة
    1. ضع قوالب 3D صغيرة و 1 غرام من مسحوق الاغاروز النقي في حاويات مناسبة للتعقيم. قم بالتعقيم لمدة 30 دقيقة في دورة جافة (121 درجة مئوية).
    2. في خزانة السلامة الحيوية ، أضف 50 مل من محلول ملحي 0.9٪ (NaCl) إلى الزجاجة الزجاجية التي تحتوي على الاغاروز المعقم وضعها في فرن الميكروويف لغلي المسحوق وإذابته. دع الاغاروز المنصهر يبرد حتى 60 درجة مئوية وأضف 500 ميكرولتر إلى كل قالب دقيق لتجنب تكوين فقاعات عند سحب العينات.
      تحذير: يمكن أن يسبب الاغاروز المنصهر حروقا شديدة في الجلد. هناك حاجة إلى معدات الحماية الشخصية المناسبة.
    3. قم بإزالة الاغاروز المتبلور عن طريق ثني القالب بعناية وإزالة الركيزة المشكلة حديثا. ضع الركائز في طبق 12 بئر وأضف 2 مل من وسط الاستزراع الطازج لكل بئر. احتضن لمدة 15 دقيقة على الأقل لتحقيق التوازن بين كل ركيزة.
      ملاحظة: قم بإعداد وسط الاستزراع مسبقا وقم بتمريره عبر مرشح 0.22 ميكرومتر لإزالة الجسيمات أو الملوثات المحتملة.
  2. بذر الخلايا
    1. زراعة MDA-MB 231 خلية مع وسط كامل (DMEM مكمل ب 1٪ Pen / Strep ، و 10٪ FBS ، و 1٪ L-Glu) في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2. عندما تصل الخلايا إلى حوالي 80٪ من التقاء في قارورة T75 ، تخلص من الوسط ، واشطفه ب 4 مل من DPBS وأضف 3 مل من التربسين / EDTA. ضع القارورة في الحاضنة وانتظر حتى تنفصل الخلايا. افحص المفرزة تحت مجهر مقلوب (عند 20x) كل 5 دقائق.
    2. اجمع الخلايا المنفصلة مع 3 مل من DPBS مع 10٪ من FBS في أنبوب 15 مل وجهاز طرد مركزي عند 235 × جم لمدة 10 دقائق. تخلص من المادة الطافية التي تحتوي على كل من DPBS و trypsin / EDTA وأعد تعليق الخلايا في 3 مل من الوسط الطازج. ماصة 10 ميكرولتر من تعليق الخلية مع 10 ميكرولتر من الtrypanblue وعد الخلايا باستخدام غرفة Neubauer.
      ملاحظة: عند حصاد الخلايا ، قم بتحييد التربسين / EDTA باستخدام DPBS الذي يحتوي على 10٪ من FBS لمنع التربسين من إتلاف الخلايا أثناء خطوة الطرد المركزي.
    3. للحصول على قطر كروي اسمي يبلغ 50 ميكرومتر (~ 15 خلية / كروي) ، قم بتخفيف تعليق الخلية إلى تركيز نهائي يبلغ 3،840 خلية / 190 ميكرولتر ، مما ينتج عنه 256 كروية في القالب الصغير. بدلا من ذلك ، بالنسبة لقطر كروي يبلغ 200 ميكرومتر (~ 1,000 خلية / كروي) ، يتم تخفيفه إلى تركيز نهائي يبلغ 81,000 خلية / 190 ميكرولتر ، مما ينتج عنه 81 كرويا في القالب الكبير ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    4. قم بإزالة وسط الاستزراع من اللوحة المكونة من 12 بئرا وإمالة الركائز لإزالة الوسط بعناية من غرفة بذر الخلية. أضف 190 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل ركيزة (بطريقة متساقطة) وانتظر حتى تستقر الخلايا لمدة 10 دقائق في حاضنة زراعة الأنسجة.
    5. أضف 2 مل من الوسط المحيط لكل بئر وضع الآبار المتعددة مرة أخرى إلى الحاضنة. افحص التكوين الكروي كل 24 ساعة. استبدلها بوسط جديد عند الحاجة.
  3. حصاد ومعالجة الكرويات
    1. ضع طبق بتري مقاس 35 مم يحتوي على 2 مل من الوسط الطازج في الحاضنة ليتوازن لمدة 10-15 دقيقة.
    2. قم بإزالة وسط زراعة الخلية المحيط بالركيزة. باستخدام ملقط معقم ، قم بإزالة الركيزة من البئر واقلبها في طبق بتري. اضغط برفق على الجزء السفلي من الركيزة لجعل الكرويات تسقط بالجاذبية.
    3. ضع طبق بتري الذي يحتوي على الكرويات مرة أخرى في الحاضنة لمزيد من المعالجة. يتم عرض خطوات البروتوكول لتصنيع الكرويات في الشكل 2.

3. العلاج الكروي

  1. قم بإزالة المادة الطافية من القالب واستبدلها ب 200 ميكرولتر من تشتت Dox@DDAB-MDs ، المحضرة كما هو موضح في الخطوة 1.1.6.
  2. بعد 5 دقائق ، أضف 2 مل / بئر من الوسط المحيط للتوازن. بعد وقت العلاج المطلوب ، تابع وفقا للخطوة 2.1.

4. توصيف حجم الكروية والتشكل

  1. تحقق من الحجم الكروي بعد وقت الحضانة المطلوب بهدف 40x جنبا إلى جنب مع برنامج معالجة الصور المجهرية.
  2. قم بقياس حجم ما لا يقل عن 10 كرويات لجمع بيانات كافية للإحصاءات المناسبة وتحليل أحجامها كما هو مذكور في الخطوة 7.

5. مقايسة الانتشار / البقاء: الفحص المجهري الفلوري مع تلطيخ الخلايا الحية

ملاحظة: اتبع التعليمات الخاصة بتصنيع الكرة الكروية حتى الخطوة 2.2.5.

  1. قم بإزالة المادة الطافية من القالب واستبدلها ب 200 ميكرولتر من 4 ميكرومتر كالسين-AM في PBS واحتضانها لمدة 3 ساعات في درجة حرارة الغرفة في الظلام. خلال آخر 20 دقيقة من الحضانة ، أضف 10 ميكروغرام / مل من يوديد البروبيديوم لتلطيخ الخلايا الميتة.
  2. احصد الكرويات عن طريق قلب الركيزة في طبق بتري وفقا للخطوة 2.3.2.
  3. قم بتصوير الكرات في محلول تلطيخ باستخدام CLSM بأهداف 40x / 60x وليزر Ar + ، وضبط الكسب والثقب بالطرق المناسبة للحصول على صور مركزة.

6. تحليل الصور والاقتناء

  1. إرسال الصور ثنائية الأبعاد ومتحد البؤر
    1. افتح البرنامج متحد البؤر (الملف التكميلي أ) وحدد الهدف (60x ، 40x ، إلخ). في اللوحة اليمنى ، انقر فوق Trans لتحديد قناة الإرسال.
    2. انقر فوق Live لتصور الصورة والبحث عن التركيز المحسن. انقر فوق Single لإيقاف الاستحواذ.
    3. للحصول على الصور متحد البؤر ، انقر فوق قنوات الليزر الحمراء أو الخضراء حسب صبغة الفلورسنت المستخدمة. في قسم الثقب ، حدد فتحة S في القائمة المنسدلة واضبط قسم الكسب على 6.00 B.
    4. انقر فوق Live واضبط فتحة الثقب والكسب لتحسين التباين. انقر فوق فردي لإيقاف الاستحواذ وحفظ الصورة. قم بتداخل الإرسال والصورة متحد البؤر عن طريق تحديد القناة الصحيحة في شريط الأدوات العلوي.
  2. صور ثلاثية الأبعاد متحدة البؤر
    1. انقر فوق Z في اللوحة اليمنى (الملف التكميلي B). انقر فوق الزر الأحمر لإعادة تعيين الإعدادات.
    2. حدد قسم المرجع ، وانقر فوق Live وابحث في الخطة المتوسطة داخل الكائن الذي يحرك التركيز. حدد الجزء العلوي وحرك التركيز لأعلى حتى يخرج الكائن عن التركيز ويختفي.
    3. كرر الخطوة 6.2.2 للقسم السفلي الذي يتحرك لأسفل التركيز.
    4. اضبط حجم الخطوة على 0.75 ميكرومتر. انقر فوق Z-stack ثم على Single لبدء المسح. احفظ الصور بتنسيق .ics.
  3. الصور البصرية والتحليل
    1. افتح برنامج المجهر البصري ، والتقط الصورة بتركيز بؤري طويل 40x أو هدف 20x بالضغط على تشغيل في شريط الأدوات العلوي. اضغط على إيقاف واحفظ الصورة.
    2. في شريط الأدوات العلوي ، انقر فوق View و Analysis Control و Annotations and Measurements افتح لوحة بخيارات مختلفة (الملف التكميلي C). في لوحة Annotation and Measurements ، حدد Semiaxis وانقر فوق Ellipse.
    3. في البحث عن الصور، ابحث عن المحور الذي يناسب شكل الكائن بشكل أفضل واضغط على Enter على لوحة المفاتيح لنقل القيمة التي تم الحصول عليها على جدول اللوحة الأيمن.
    4. كرر الخطوة 6.3.3 ل 10 كائنات على الأقل للحصول على بيانات كافية. انقر فوق تصدير إلى ورقة بيانات Excel لتصدير البيانات وحفظها.
  4. تصور صورة 3D Z-Stack والحساب العددي للحجم
    1. افتح الصورة ثلاثية الأبعاد الملتقطة باستخدام المجهر متحد البؤر في برنامج المجهر البصري (الملف التكميلي D).
    2. لمشاهدة إعادة البناء ثلاثية الأبعاد ، انقر فوق إظهار عرض الحجم في شريط أدوات الصورة ؛ يمكن تدوير الكائن في أي اتجاه بالنقر فوق زر الماوس الأيسر. لتحديد جزء من وحدة التخزين، استمر في الضغط على مفاتيح ctrl + الماوس الأيسر (الملف التكميلي E).
    3. اضغط على الزر x على لوحة المفاتيح لالتقاط لقطة للصورة ثلاثية الأبعاد وحفظها.
    4. لحساب حجم الكائن ، انقر فوق قياس ، قياسات الكائن ثلاثية الأبعاد تفتح لوحة (ملف تكميلي ، صورة F). انقر فوق شريط أدوات اللوحة تحديد عتبة 3D وقم بتعيين الحد المحسن باستخدام المرشحات السلسة والنظيفة أيضا (ملف تكميلي ، صورة G). انقر فوق موافق للحصول على معلمات مختلفة في لوحة قياسات الكائن ثلاثية الأبعاد ، بما في ذلك الحجم.
    5. انقر فوق تصدير إلى Excel لتصدير البيانات وحفظها.

7. تحليل البيانات الكروية

  1. بالنسبة لحسابات حجم الكرويات ، قم بتقريب الهيكل ثلاثي الأبعاد باستخدام شكل بيضاوي برولاتي ، مع تقدير المحور الرئيسي والثانوي من خلال الإسقاط ثنائي الأبعاد كما هو موضح في إدراج الشكل 3.
  2. تحقق من صحة تقريب البروليت الإهليلجي من خلال مقارنة بين الحجم المحسوب عدديا كما هو موضح في الخطوة 6.4 وصيغة figure-protocol-2 حجم البروليت الإهليلجي مع b>a = c حيث a و b و c هي المحور الإهليلجي).
  3. احسب متوسط الحجم لما لا يقل عن 10 كرويات والانحرافات المعيارية ذات الصلة. إذا كان التوزيع الحجمي للكروية طبيعيا ، فقم بتطبيق اختبار Dixon لتحديد القيمة الخارجية ورفضها. بعد ذلك ، احسب نسبة الحجم بين العينات المعالجة والعينات جنبا إلى جنب مع انتشار الخطأ كما هو مذكور في الشكل 6 أ.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تطوير Dox@DDAB-MDs وفقا للبروتوكول (القسم 1) كما هو موضح تخطيطيا في الشكل 1. تتكون MDs التي تم الحصول عليها من طبقة أحادية من DDAB تغلف نواة DFP (الشكل 1 أ). تتجنب الشحنة الموجبة ل DDAB وإجراء الصوتنة تكوين طبقات DDAB متعددة الرقائق مكدسة في DFP وواجهة المياه23.

يظهر الرسم المجهري CLSM (الشكل 1 ب) إنتاج قطرات كروية مركزة بتركيز 1.5 × 1010 MDs / مل ، ب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لتحسين فعالية الأنثراسيكلين كأدوية مضادة للأورام ، يعرض هذا العمل تكوين قطرات PFC مقبسة DDAB تغلف عقار العلاج الكيميائي دوكسوروبيسين (Dox) وتأثير تفاعل هذه التركيبة مع خلايا سرطان الثدي الثلاثية السلبية عالية العدوانية ، MDA-MB-231.

بناء DOX@DDAB-MDs
تمت صياغة MDs المحملة ب Dox بطريقة الرنين باستخدام بروتوكول سريع للغاية وقابل للتكرار وسهل الاستخدام وفعال. تسمح هذه الطريقة بالحصول على MDs بتوزيع حجم ضيق للغاية يتمركز عند حوالي 1 ميكرومتر وت...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تضارب المصالح: يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح.

حقوق الإنسان /: لا تحتوي هذه المقالة على أي دراسات مع البشر أو التي أجراها أي من المؤلفين.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تلقى هذا العمل تمويلا من برنامج البحث والابتكار التابع للاتحاد الأوروبي Horizon 2020 بموجب اتفاقية المنحة AMPHORA (766456).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
µ-Petri طبقIbidi8115635mm عالية, IbiTreat
1,1,1,2,3,4,4,5,5,5-DecafluoropentaneSigma-Aldrich138495-42-8b.p. 55° C
12 بئر لوحةكورنينج
15 مل أنبوب الطرد المركزيفالكون89039-664
أطباق 3D-Petri 12:256الأنسجة الدقيقة (سيجما ألدريتش)Z764000-6EAأطباق
صغيرة ثلاثية الأبعاد بتري 12:81الأنسجة الدقيقة (سيجما ألدريتش)Z764019-6EAحاضنة ثقافة CO2
كبيرة 5٪ ، 37 درجة ؛ CThermo ScienificHERAcell 150i
50 مل أنبوب الطرد المركزيFalcon352070
خزانة السلامة البيولوجية ، المستوى
CalceinSigma-Aldrich
Calcein-AMSigma-Aldrich148504-34-14mM حل مخزون في
DMSO cam sCMOS Andor Zyla 4.2Andor Instruments
جهاز طرد مركزي Hettich Universal 320RHettich Lab. التكنولوجيا
DAPISIgma-Aldrich
Dimethyldioctadecylammonium مسحوق بروميدSigma-Aldrich3700-67-2
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)Corning15-013-CV
Doxorubicin hydrochlorideSigma-Aldrich25316-40-9
DPBS (Dulbecco's Modified PBS)Corning21-030-CVدرجة الحموضة 7,4
الإيثانول 70٪سيجما ألدريتش
EZ-C1 رقمي كليسإنسترومنتسالإصدار الفضي 3.91
مصل الأبقار الجنيني (FBS)كورنينج35-079-CV
مقياس الزوايا BI-200SMشركات بروكهافن للأدوات
ليزر Ar+ أطياف الفيزياء
ليزر He-NeMelles-Griot
L-GlutammineCorning25-005-CI
Mcroscope نيكون Eclipse TiNikon Instruments
MDA-MB 231 خط الخليةATCC
مايكروسوفت إكسلمايكروسوفت مايكروسوفت
ميكروبلايت قارئ سباركتيكان مجموعة
NanoZetaSizer ZSMalvern Instruments Ltd
Neubauer غرفة محسنة718605
NIS Elements SoftwareNikon InstrumentsAR 4.30
Pen / StreptoCorning30-002-CI
Photocorrelator BI-9000 ATBrookhaven Instruments Corporations62927-1
مقياس الضوء HC120Brookhaven Instruments CorporationsN & deg ؛ 1275
ماصات ونصائح ، أحجام مختلفةGilson
Propidium IodideSIgma-Aldrich
ماصات مصلية ، أحجام مختلفةCorning
Solid-state laserSuwtech LaserN & deg ؛ 22368
قوارير T25Sarstedt83.3910.002
قوارير T75Sarstedt83.3911.002
Trypsin / EDTA 0.05٪EuroCloneECB3052D
Vibra-Cell VCX-400Sonics & amp المواد, بما في ذلك
حمام37 درجة ؛ ج
ثقافة الثاني نيكون من مائي

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Aryal, S., Park, H., Leary, J. F., Key, J. Top-down fabrication-based nano/microparticles for molecular imaging and drug delivery. International Journal of Nanomedicine. 14, 6631-6644 (2019).
  2. Peng, Y., et al. Research and development of drug delivery systems based on drug transporter and nano-formulation. Asian Journal of Pharmaceutical Sciences. 15, 220-236 (2020).
  3. Chan, K. S., Koh, C. G., Li, H. Y. Mitosis-targeted anti-cancer therapies: Where they stand. Cell Death and Disease. 3, 411(2012).
  4. Raj, S., Franco, V. I., Lipshultz, S. E. Anthracycline-induced cardiotoxicity: A review of pathophysiology, diagnosis, and treatment. Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 16, 315(2014).
  5. Iyer, A. K., Singh, A., Ganta, S., Amiji, M. M. Role of integrated cancer nanomedicine in overcoming drug resistance. Advanced Drug Delivery Reviews. 65, 1784-1802 (2013).
  6. Blanco, E., Shen, H., Ferrari, M. Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery. Nature Biotechnology. 33, 941-951 (2015).
  7. Davis, M. E., Chen, Z., Shin, D. M. Nanoparticle therapeutics: An emerging treatment modality for cancer. Nature Reviews Drug Discovery. 7, 771-782 (2008).
  8. Lammers, T., Hennink, W. E., Storm, G. Tumour-targeted nanomedicines: Principles and practice. British Journal of Cancer. 99, 392-397 (2008).
  9. Couvreur, P., et al. Polycyanoacrylate nanocapsules as potential lysosomotropic carriers: preparation, morphological and sorptive properties. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 31, 331-332 (1979).
  10. Yordanov, G. G., Dushkin, C. D. Preparation of poly(butylcyanoacrylate) drug carriers by nanoprecipitation using a pre-synthesized polymer and different colloidal stabilizers. Colloid and Polymer Science. 288, 1019-1026 (2010).
  11. Kooiman, K., Vos, H. J., Versluis, M., De Jong, N. Acoustic behavior of microbubbles and implications for drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 72, 28-48 (2014).
  12. Fasolato, C., et al. Antifolate SERS-active nanovectors: Quantitative drug nanostructuring and selective cell targeting for effective theranostics. Nanoscale. 11, 15224-15233 (2019).
  13. Cerroni, B., et al. Temperature-tunable nanoparticles for selective biointerface. Biomacromolecules. 16, 1753-1760 (2015).
  14. Chronopoulou, L., et al. PLGA based particles as "drug reservoir" for antitumor drug delivery: characterization and cytotoxicity studies. Colloids Surfaces B: Biointerfaces. 180, 495-502 (2019).
  15. Calderó, G., Paradossi, G. Ultrasound/radiation-responsive emulsions. Current Opinion in Colloid and Interface Science. 49, 118-132 (2020).
  16. Capece, S., et al. Complex interfaces in 'phase-change' contrast agents. Physical Chemistry Chemical Physics. 18, 8378-8388 (2016).
  17. Mielczarek, L., et al. In the triple-negative breast cancer MDA-MB-231 cell line, sulforaphane enhances the intracellular accumulation and anticancer action of doxorubicin encapsulated in liposomes. International Journal of Pharmaceutics. 558, 311-318 (2019).
  18. Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Paul Solomon, F. D. 3D cell culture systems: Advantages and applications. Journal of Cellular Physiology. 230, 16-26 (2015).
  19. Heinonen, T. Better science with human cell-based organ and tissue models. Alternatives to Laboratory Animals. 43, 29-38 (2015).
  20. Thoma, C. R., Zimmermann, M., Agarkova, I., Kelm, J. M., Krek, W. 3D cell culture systems modeling tumor growth determinants in cancer target discovery. Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 29-41 (2014).
  21. Astashkina, A., Grainger, D. W. Critical analysis of 3-D organoid in vitro cell culture models for high-throughput drug candidate toxicity assessments. Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 1-18 (2014).
  22. Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 42-51 (2014).
  23. Feitosa, E., Karlsson, G., Edwards, K. Unilamellar vesicles obtained by simply mixing dioctadecyldimethylammonium chloride and bromide with water. Chemistry and Physics of Lipids. 140, 66-74 (2006).
  24. Cancerrxgene. Doxorubicin IC50. Genomics of drug sensitivity in cancer. , Available from: https://www.cancerrxgene.org/compound/Doxorubicin/133/overview/ic50 (2020).
  25. Boo, L., et al. Phenotypic and microRNA transcriptomic profiling of the MDA-MB-231 spheroid-enriched CSCs with comparison of MCF- 7 microRNA profiling dataset. PeerJ. 2017, 1-27 (2017).
  26. Domenici, F., Castellano, C., Dell'unto, F., Congiu, A. Temperature-dependent structural changes on DDAB surfactant assemblies evidenced by energy dispersive X-ray diffraction and dynamic light scattering. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 95, 170-177 (2012).
  27. Choosakoonkriang, S., et al. Infrared spectroscopic characterization of the interaction of cationic lipids with plasmid DNA. Journal of Biological Chemistry. 276, 8037-8043 (2001).
  28. Yin, H., et al. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nature Reviews Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).
  29. Lentacker, I., Geers, B., Demeester, J., De Smedt, S. C., Sanders, N. N. Design and evaluation of doxorubicin-containing microbubbles for ultrasound-triggered doxorubicin delivery: Cytotoxicity and mechanisms involved. Molecular Therapy. 18, 101-108 (2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة