Method Article

الحث الموجه للعضويات الشبكية من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات

DOI:

10.3791/62298

⸱

April 21st, 2021

 , 
1Beijing Institute of Ophthalmology, Beijing Tongren Eye Center, Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University, Beijing Ophthalmology & Visual Science Key Laboratory

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باستخدام طريقة التنظيم الذاتي ، نقوم بتطوير بروتوكول مع إضافة COCO يمكن أن يزيد بشكل كبير من توليد المستقبلات الضوئية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

زرع خلايا الشبكية هو نهج علاجي واعد ، والذي يمكن أن يعيد بنية الشبكية ويستقر أو حتى يحسن القدرات البصرية للشبكية المتدهورة. ومع ذلك، يواجه التقدم المحرز في العلاج ببدائل الخلايا حاليا تحديات تتطلب مصدرا جاهزا لشبكية العين البشرية عالية الجودة والموحدة. لذلك ، هناك حاجة إلى بروتوكول سهل ومستقر للتجارب. هنا ، نقوم بتطوير بروتوكول محسن ، يعتمد على طريقة التنظيم الذاتي باستخدام جزيئات خارجية المنشأ والكاشف A بالإضافة إلى الاستئصال اليدوي لتوليد عضويات شبكية العين البشرية ثلاثية الأبعاد (RO). يعبر RO المشتق من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (PSCs) عن علامات محددة للمستقبلات الضوئية. مع إضافة COCO ، وهو مضاد متعدد الوظائف ، تزداد كفاءة التمايز بين سلائف المستقبلات الضوئية والمخاريط بشكل كبير. الاستخدام الفعال لهذا النظام ، الذي له فوائد خطوط الخلايا والخلايا الأولية ، وبدون مشاكل المصادر المرتبطة بالأخير ، يمكن أن ينتج خلايا شبكية متقاربة ، وخاصة المستقبلات الضوئية. وبالتالي ، فإن التمايز بين PSCs و RO يوفر منصة مثالية وذات صلة بيولوجية لنمذجة الأمراض وفحص الأدوية وزرع الخلايا.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتميز الخلايا الجذعية متعددة القدرات (PSCs) بتجديدها الذاتي وقدرتها على التمايز إلى جميع أنواع الخلايا الجسدية. وهكذا ، أصبحت المواد العضوية المشتقة من PSCs موردا مهما في أبحاث الطب التجديدي. يتميز تنكس الشبكية بفقدان المستقبلات الضوئية (القضبان والمخاريط) وظهارة صبغة الشبكية. يمكن أن يكون استبدال خلايا الشبكية علاجا مشجعا لهذا المرض. ومع ذلك ، ليس من الممكن الحصول على شبكية العين البشرية لأبحاث الأمراض وعلاجها. لذلك ، فإن عضويات الشبكية (ROs) المشتقة من PSCs ، والتي تلخص بشكل فعال وناجح خلايا الشبكية الأصلية متعددة الطبقات ، مفيدة للبحوث الأساسية والانتقالية1،2،3. يركز بحثنا....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات المؤسسية لمستشفى بكين تونغرين ، جامعة كابيتال الطبية. تم الحصول على H9 hESCs من معهد أبحاث WiCell وتمت هندستها وراثيا إلى خط الخلايا الموسوم بالطماطم.

1. توليد ROs البشرية

  1. قم بزراعة hESCs في ظل ظروف خالية من التغذية.
    1. قم بتغطية بئر واحد من صفيحة من 6 آبار ب 1 مل من كاشف 0.1 مجم / مل A (جدول المواد) عند 37 درجة مئوية لمدة نصف ساعة على الأقل باتباع تعليمات الشركة المصنعة. إذابة أليكوت من 1x106 hESCs.
      ملاحظة: تحضير 3 مل من الكاشف B المسخن مسبقا (جدول المواد) ونقل الخلايا المحفوظة بالتجميد (1 مل) إلى 3 مل من الوسط الطازج. لا تقم ب....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويصور الرسم التوضيحي التخطيطي بروتوكول التمايز لتحسين خلايا السلائف باستخدام كوكو (الشكل 1). من PSC إلى ROs ، يمكن أن تتسبب العديد من التفاصيل في اختلافات في النتائج. يوصى بتسجيل كل خطوة وحتى رقم الكتالوج ورقم اللوت لكل وسيط لتتبع الإجراء بأكمله.

هنا ، نقدم صورا ميدانية مشرقة للأيام 6 و 12 و 18 و 45 (الشكل 2). في اليوم 6 ، يبلغ قطر المواد العضوية عادة حوالي 600 ميكرومتر في صفيحة من 96 بئرا ، مع وصلات كثيفة في الداخل وحافة مشرقة (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التمايز العضوي للشبكية هو طريقة مرغوب فيها لتوليد خلايا شبكية وظيفية وافرة. RO هو مركب من خلايا شبكية العين المختلفة ، مثل الخلايا العقدية ، والخلايا ثنائية القطب ، والمستقبلات الضوئية ، التي تولدها الخلايا الجذعية متعددة القدرات نحو شبكية العين العصبية4،5،8،9. على الرغم من أنه يمكن حصاد ROs المتقاربة ، إلا أنها تستغرق وقتا طويلا ، مما قد يتطلب فترات زراعة طويلة (تصل إلى 180 يوما). ومع ذلك ، با.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر أعضاء مختبر 502 على دعمهم الفني وتعليقاتهم المفيدة فيما يتعلق بالمخطوطة. تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل مؤسسة العلوم الطبيعية لبلدية بكين (Z200014) والبرنامج الوطني الرئيسي للبحث والتطوير في الصين (2017YFA0105300).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2-mercaptoethanolLife Technologies21985-023
COCOR& D Systems3047-CC-050DAN عائلة مجال من مضادات BMP
DMEM / F-12Gibco10565-042
DMSOSigmaD2650
DPBSGibcoC141905005BT
EDTAThermo15575020
مصل الأبقار الجنينية (FBS) ، مؤهل للصناعة البيولوجية للخلايا الجذعية الجنينية البشرية04-002-1A
GMEMGibco11710-035
استبدال مصل بالضربة القاضية - متعدد الأنواعGibcoA3181502
MEM محلول الأحماض الأمينية غير الأساسي (100X)sigmaM7145
Pen StrepGibco15140-122
Primesurface 96 V-plateSbioMS9096SZتجميع الخلايا في 1.2.7
بيروفاتكاشف سيجماS8636
ABD356231Matrigel في 1.1.1
الكاشف BStemCell5990mTeSR- E8 ، PSCs الوسط القاعدي في 1.1.2
الكاشف CGibco12563-011TrypLE Express في 1.2
الكاشف DRoche11284932001DNase I ، في 1.2
حمض الريتينويكSigmaR2625-100MG
ملحق SAGEnzo Life ScienceALX-270-426-M001
1Life Technologies17502-048N-2 Supplement (100X) ، سائل ، مغطى في Medum III
TaurineSigmaT-8691-25G
Trypsin-EDTA (0.25٪) ، تفكك الفينول الأحمرGibco25200056العضيات في 2.1.3
Wnt Antagonist I ، IWR-1-endo - CalbiochemSigma681669Wnt
Y-27632 2HClSelleckS1049
مثبط

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Xie, H., et al. Chromatin accessibility analysis reveals regulatory dynamics of developing human retina and hiPSC-derived retinal organoids. Science Advances. 6 (6), 5247(2020).
  2. Lu, Y. F., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Retinal OrganoidsPluripotent Stem CellsRetinal Cell TransplantationPhotoreceptor PrecursorsOrganoid DifferentiationOptic VesicleCell AggregationDisease ModellingDrug ScreeningCRX Expression

Related Articles