تقييم المقاييس الوظيفية لصحة العضلات الهيكل العظمي في العضلات الهيكل العظمي البشري Microtissues

العضلات الهيكل العظمي هي واحدة من الأنسجة الأكثر وفرة في جسم الإنسان ويدعم وظائف الجسم الرئيسية مثل الحركة، وهوستاسيس الحرارة والتمثيل الغذائي¹. تاريخيا، تم استخدام نماذج حيوانية وأنظمة ثنائية الأبعاد (ثنائية الأبعاد) لدراسة العمليات البيولوجية ومسببات الأمراض، وكذلك لاختبار المركبات الدوائية في علاج أمراض العضلات الهيكلية^2،3. في حين أن النماذج الحيوانية قد تحسنت كثيرا معرفتنا العضلات الهيكل العظمي في الصحة والمرض، وقد أعاقت تأثيرها الترجمي من ارتفاع التكاليف والاعتبارات الأخلاقية والاختلافات بين الأنواع^2،4. في التحول إلى النظم القائمة على الخلايا البشرية لدراسة العضلات الهيكلية ، وأنظمة زراعة الخلايا 2D مواتية بسبب بساطتها. ومع ذلك، هناك قيد. هذا الشكل غالبا ما يفشل في تلخيص الخلية الخلية والتفاعلات مصفوفة الخلية خارج الخلية التي تحدث بشكل طبيعي داخل الجسم^5،6. على مدى السنوات القليلة الماضية، ظهرت نماذج العضلات الهيكلية ثلاثية الأبعاد (3D) كبديل قوي لنماذج الحيوانات بأكملها وأنظمة الثقافة التقليدية ثنائية الأبعاد من خلال السماح بنمذجة العمليات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية والمرضية ex vivo^7،8. في الواقع، وقد ذكرت مجموعة كبيرة من الدراسات استراتيجيات لنموذج العضلات الهيكل العظمي البشري في شكل ثقافة 3D الاصطناعية^{الحيوية 1}. أحد القيود بالنسبة للعديد من هذه الدراسات هو أن القوة النشطة يتم قياسها كميا بعد إزالة أنسجة العضلات من منصات الثقافة والتعلق بمحول القوة ، وهو أمر مدمر وبالتالي ، يقتصر على العمل كمقاير نقطة النهاية^9و10و^11و12و13و¹⁴و^{15و16و17و18 ,19,20,21}. وقد صممت نظم أخرى الثقافة التي تسمح لأساليب غير الغازية لقياس القوة النشطة، ولكن ليست كلها قابلة لتطبيقات اختبار جزيء عالية المحتوى^{7،8،9،10،14،18،22،23،24،25،26،27،28 ,29}.

يصف هذا البروتوكول طريقة مفصلة لتصنيع العضلات البشرية microtissues (hMMTs) في العضلات الهيكلية (ميو) microTissue صفيف deviCe للتحقيق forCe (MyoTACTIC) منصة; جهاز لوحة 96 جيدا التي تدعم إنتاج الجزء الأكبر من 3D العضلات الهيكل العظمي microtissues³⁰. تمكن طريقة تصنيع لوحة MyoTACTIC من توليد لوحة ثقافة 96 جيدا متعددة الديمثيلسيلوكسيان (PDMS) وجميع ميزات البئر المقابلة في خطوة صب واحدة ، حيث يتطلب كل بئر عددا صغيرا نسبيا من الخلايا لتشكيل microtissue. Microtissues شكلت داخل MyoTACTIC تحتوي على الأنابيب المحاذاة، المخططة، والمتعددة النوى التي هي استنساخها من بئر إلى بئر من الجهاز، وعند النضج، يمكن أن تستجيب للمحفزات الكيميائية والكهربائية في الموقع³⁰. هنا، يتم تحديد ومناقشة تقنية تصنيع جهاز لوحة ثقافة PDMS MyoTACTIC من نسخة طبق الأصل البولي يوريثين (PU)، وهي طريقة محسنة لتنفيذ خلايا السلف الميوجينية البشرية الخالدة لتصنيع hMMTs، والتقييم الوظيفي لتوليد قوة hMMT المهندسة وخصائص مناولة الكالسيوم.

1. PDMS تصنيع لوحة MyoTACTIC

ملاحظة: PDMS تصنيع لوحة MyoTACTIC يتطلب قالب سلبي PU، والتي يمكن تصنيعها كما وصف سابقا³⁰. تم توفير ملف SolidWorks للتصميم بمساعدة الكمبيوتر (CAD) لتصميم لوحة MyoTACTIC على GitHub (https://github.com/gilbertlabcode/MyoTACTIC-SolidWork-CAD-file).

1. إعداد ~ 110 غرام من محلول البوليمر PDMS في كوب من البلاستيك المتاح في نسبة 1:15 من مونومر إلى عامل المعالجة باستخدام المكونات في عدة الاستومر السيليكون. تحريك محلول البوليمر لمدة 2-3 دقائق باستخدام ماصة مصلية 5 مل المتاح حتى مختلطة تماما ومتجانسة.
   تنبيه: تجنب ملامسة محلول البوليمر PDMS مع الجلد والعينين؛ وتجنب استنشاق. ارتدي دائما معطف المختبر والقفازات القابلة للتصرف عند التعامل مع خليط PDMS السائل والرجوع إلى ورقة بيانات السلامة (SDS) لبروتوكولات أمان محددة.
   ملاحظة: حماية أسطح المعدات (على سبيل المثال، مقياس، أعلى مقاعد البدلاء، الخ) مع غطاء المتاح في حالة تسرب محلول البوليمر PDMS.
2. ديغا الخليط في درجة حرارة الغرفة عن طريق وضع الكأس داخل غرفة فراغ benchtop متصلة مضخة فراغ الجافة واجب القياسية ل ~ 30 دقيقة، أو حتى تتم إزالة جميع الفقاعات. كسر الفراغ كل 5-10 دقيقة للمساعدة في إزالة الغاز. استخدام فارغة 50 مل برميل حقنة لإغراق الهواء وتفجير أي فقاعات المتبقية على سطح خليط البوليمر حسب الحاجة.
   ملاحظة: يمكن استخدام قطعة من أنابيب الهوية مقاس 6.35 مم لتوصيل طرف ماصة P1250 بالبرميل لتحسين سرعة ودقة تيار الهواء.
3. في حين أن محلول البوليمر PDMS هو إزالة الغاز ، وإزالة أي قطعة من بقايا PDMS انضمت إلى قالب PU السلبية عن طريق مسح بلطف أسفل الحواف والسطح مع منشفة ورقية جافة. استخدام مرفق الهواء المضغوط، تعيين إلى 70-100 كيلو باسكال لإزالة الجسيمات الدقيقة المتبقية.
   ملاحظة: حماية العفن السلبي PU من التلف ومن تراكم الجسيمات عن طريق وضعه في كيس بلاستيكي قابل للغلق وتخزينه داخل درج محمي من حركة المرور المختبرية.
4. ضع قالب PU في غطاء كيميائي تمت حمايته بغطاء يمكن التخلص منه. الوقوف القالب أفقيا في ~ 75 درجة ورذاذ السطح النشط مع طبقة حتى من وكيل الافراج عنهم. رش القالب من أعلى إلى أسفل، ثم من اليسار إلى اليمين، في حين عقد يمكن 15-20 سم من القالب واستخدام السائل ذهابا وإيابا حركة كاسحة. تدوير القالب 180 درجة وتكرار الرش، ثم السماح للقالب PU الجلوس في غطاء محرك السيارة الكيميائية لمدة 10-15 دقيقة لتجف.
   تنبيه: تأكد من استخدام عامل الإطلاق داخل غطاء الدخان الكيميائي، وتجنب ملامسة الجلد والعينين، والإشارة إلى ورقة بيانات السلامة (SDS) لبروتوكولات أمان محددة
   ملاحظة: يحتاج الفيلم الرقيق إلى تغطية السطح النشط بالكامل ، ولكن يمكن نقل الطلاء المفرط إلى PDMS في الخطوة التالية ، والتي يمكن أن تؤثر بدورها سلبا على بذر hMMT. يجب أن يشعر السطح بقعة لمسة ولكن ليس الرطب.
5. صب 100 غرام من PDMS بالتساوي في قالب PU ومكان داخل غرفة فراغ متصلة مضخة فراغ ريشة دوارة. ديغا العفن PDMS مليئة ~ 45 دقيقة، وكسر ختم فراغ كل 5-10 دقيقة لأول 20 دقيقة لتسريع العملية. اترك داخل غرفة الفراغ حتى يصبح خليط PDMS خاليا تماما من جميع الفقاعات.
   ملاحظة: يتم استخدام مضخة فراغ ريشة دوارة لتحقيق فراغ أقل وتقليل الوقت اللازم لهذه الخطوة. يمكن إجراء إزالة الغاز من القالب المملوء ب PDMS باستخدام غرفة فراغ سطح المقعد ومضخة الفراغ الجاف القياسية ، ومع ذلك ، فإن الوقت لإبطال خليط جميع الفقاعات سيكون أطول. ما هو ضروري هو إزالة جميع الفقاعات من محلول البوليمر PDMS ، خاصة في تلك المناطق التي من المقرر أن تصبح وظائف تثبيت hMMT. فقاعات في هذه المنطقة سوف يؤدي إلى كسر مرساة آخر، وفقدان الآبار الثقافة، وبالتالي يؤدي إلى قطعة صغيرة من PDMS المتبقية إسفين في القالب.
6. نقل العفن PU PDMS مليئة degassed إلى فرن 65 درجة مئوية، واحتضان بين عشية وضحاها لعلاج المطاط السائل.
7. إزالة لوحة PDMS الشفاء إيجابية من الفرن وتبريد لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل.
8. مع مشرط بدون شفرة، فصل PDMS الشفاء بلطف من قالب PU عن طريق تشغيل الجزء الخلفي من المقبض بين PDMS وجدران القالب. تبدأ على طول الحافة العليا وفصل جميع الجوانب 4، قبل دفع وصولا الى قاعدة القالب وفصل هذا الجزء. هذه الخطوة كاملة عندما الجزء الخلفي من مقبض بسلاسة بين PDMS وجميع الجدران 4 من قالب PU.
   ملاحظة: اعمل ببطء وبعناية مع المشرط الخالي من الشفرات لمنع تكسير قالب PU أو تمزيق PDMS. يجب أن تستغرق هذه الخطوة 15-20 دقيقة.
9. بدءا من نهاية واحدة، استخدم مشرط بدون شفرة لرفع حافة PDMS وأصابع العمل بين لوحة ثقافة PDMS المعالجة وقالب PU. ثم، وذلك باستخدام كلتا يديه، ودفع أصابع أخرى تحت لوحة، تقشير ببطء صعودا والخروج من قالب PU.
   ملاحظة: العمل ببطء واستخدام كلتا يديه لتقشير بالتساوي لوحة. تقليل الانحناء للحد من احتمال كسر مرساة آخر. يجب أن تستغرق هذه الخطوة 5-10 دقائق.
10. استخدام شفرة حلاقة حافة واحدة لقطع لوحة إلى مجموعات من 6 ± 2 آبار MyoTACTIC (الشكل 1) لأغراض بذر الأنسجة. ضع لوحات MyoTACTIC الكاملة ، أو أجزاء اللوحة ، في كيس تعقيم أداة وautoclave لدورة جافة 25 دقيقة (20 دقيقة من وقت التعقيم ، و 5 دقائق من الوقت الجاف) عند 120 درجة مئوية و 100-140 كيلو باسكال.

2. ثقافة خلايا السلف الميوبلاست البشرية الخالدة

ملاحظة: تم الحصول على الخلايا الميوبلاستية الخالدة المستخدمة في هذا البروتوكول من معهد دي مولوجي (باريس، فرنسا)³¹.

1. الحصول على قارورة واحدة من الخلايا المجمدة من ديوار النيتروجين السائل وذوبان سريع القارورة في حمام الماء 37 درجة مئوية (في أقل من 1 دقيقة). يتم تجميد الخلايا بكثافة 7.5 × 10⁵ خلايا لكل 1 مل من وسائل التجميد تتكون من 90٪ مصل البقر الجنيني (FBS) و 10٪ كبريتسيد ثنائي ميثيل (DMSO).
2. نقل محتويات القارورة برفق إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل يحتوي على 9 مل من متوسط الغسيل الدافئ مسبقا يتكون من 89٪ DMEM 1x و 10٪ FBS و 1٪ Pen/Strep لتخفيف DMSO. تدور أنبوب مخروطي 15 مل في 400 × ز لمدة 10 دقيقة ومن ثم يستنشق بعيدا وسائل الإعلام مع الحرص على تجنب بيليه الخلية.
3. Resuspend بيليه في 1 مل من وسائل الإعلام النمو تتكون من 84٪ الهيكل العظمي العضلات الخلية القاعدية المتوسطة مع الهيكل العظمي نمو الخلايا العضلات المتوسطة الملحق ميكس، 15٪ FBS و 1٪ القلم / ستريب ومن ثم نقل إلى أنبوب مخروطي 50 مل مع 29 مل من وسائل الإعلام النمو.
4. نقل 10 مل من الوسائط التي تحتوي على ما يقرب من 2.5 × 10⁵ خلايا إلى طبق ثقافة الخلية 100 ملم × 20 ملم. كرر هذه الخطوة مع المتبقية 20 مل من حل الخلية. ثم نقل أطباق زراعة الخلايا إلى حاضنة ثقافة الخلية الرطبة تعيين إلى 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂.
5. تحديث الوسائط الثقافية كل يومين. ثقافة الخلايا حتى أنها تحقق ~ 70٪ -80٪ التقاء (عادة 4-5 أيام)، وعند هذه النقطة يتم إعداد الخلايا للبذر. 1.5 × 10⁵ خلايا مطلوبة لتوليد كل hMMT. لذلك، مرور الخلايا حسب الحاجة لتحقيق العدد المطلوب من الخلايا.
   ملاحظة: يجب ألا تتجاوز خطوط خلايا السلف الميوبلاستية الخالدة التقاء بنسبة 80٪ قبل بذر الخلايا في آبار MyoTACTIC أو تمرير الخلايا أو إعداد مخزون الفريزر. hMMTs ملفقة من الخلايا التي تجاوزت 80٪ التقاء غالبا ما تفشل في الوصول إلى النضج الانكماشي. إجراءات passaging متطابقة مع الطرق الموضحة أدناه في الخطوة 3.

3. البذر hMMTs هندسيا مع MyoTACTIC

1. إعداد آبار الثقافة MyoTACTIC والكواشف للبذر hMMT.
   ملاحظة: يوفر هذا البروتوكول تفاصيل محددة لإنتاج 6 hMMTs.
   1. 2-3 ح قبل البذر الخلية، ووضع 6 جيدا MyoTACTIC جزء لوحة في طبق ثقافة الخلية 10 سم. إعداد كل ثقافة MyoTACTIC الفردية بشكل جيد عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من محلول Pluronic F-127 بنسبة 5٪ في كل بئر. وضع الغطاء على طبق ثقافة 10 سم، وتطبيق البارافين لختم المسافة بين طبق 10 سم والغطاء، ومن ثم وضع لوحة 10 سم التي تحتوي على جزء MyoTACTIC في جهاز طرد مركزي مجهزة محول الدوار لوحة.
      ملاحظة: إذا لم يتوفر محول دوار لوحة الطرد المركزي ، يمكن استخدام طرف ماصة P20 لإزالة الفقاعات بعناية من خلف المشاركات ، وبالتالي ضمان أن سطح الثقافة بأكمله مغلف بالتساوي.
   2. جهاز الطرد المركزي في 1550 × ز لمدة 1 دقيقة لإزالة جميع الفقاعات داخل آبار الثقافة ، وخاصة وراء الوظائف. تخزين طبق ثقافة الخلية 10 سم التي تحتوي على جزء لوحة MyoTACTIC التي تحتوي على محلول Pluronic F-127 في 4 درجة مئوية حتى يتم إعداد الخلايا للبذر.
      ملاحظة: يمكن تطبيق طلاء Pluronic F-127 لأقل من 2 ساعة إلى ما يصل إلى 24 ساعة. على سبيل المثال، يمكن ملء الآبار بحل Pluronic F-127 في نهاية اليوم للاستخدام في اليوم التالي. لا تتجاوز 24 ساعة لأن هذا سيؤثر سلبا على إعادة عرض hMMT وتفشل في تشكيل الأنسجة السليمة التي تصل إلى مرحلة النضج الانكماشي.
   3. ببطء إذابة واحد 50 ميكرولتر الطابق السفلي غشاء استخراج aliquot واحد 10 ميكرولتر thrombin aliquot (100 U / مل حل الأسهم) على الجليد داخل غطاء محرك السيارة الثقافة.
      ملاحظة: لا إعادة تجميد الطابق السفلي غشاء استخراج aliquots. فهي ذات استخدام واحد. الثرومبين aliquots قابلة لإعادة الاستخدام، وبالتالي، إعادة تجميد ما يصل إلى 5 مرات بعد الاستخدام.
   4. تزن ~ 7 ملغ من الفيبرينوجين مسحوق في أنبوب 1.5 مل من أجهزة الطرد الدقيق ومن ثم نقل إلى غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية. إضافة 700 ميكرولتر من 0.9٪ (wt/vol) محلول NaCl في الماء (أو محلول ملحي) للوصول إلى محلول تركيز نهائي 10 ملغم/مل. لا دوامة الفيبرينوجين لتذوب، بدلا من ذلك وضع الأنبوب في حاضنة ثقافة الخلية 37 درجة مئوية لمدة 3-5 دقائق.
   5. إزالة ونفض الغبار عن أنبوب بلطف، ثم نبض تدور الحل الذائب في جهاز طرد مركزي صغير benchtop (microfuge) والعودة إلى غطاء محرك السيارة الثقافة. فلتر محلول الفيبرينوجين باستخدام حقنة 1 مل مجهزة بمرشح حقنة 0.22 ميكرومتر. نقل محلول الفيبرينوجين الذائب إلى الجليد جنبا إلى جنب مع استخراج غشاء الطابق السفلي وaliquots thrombin.
   6. وأخيرا، إعداد وسائل الإعلام البذر hMMT التي سيتم إدخالها إلى آبار الثقافة بعد بذر الأنسجة. تحتوي هذه الوسائط على هيكل عظمي العضلات الخلية القاعدية المتوسطة تكملها 20٪ FBS, 1٪ P /S و 3٪ 6-حمض أمينوكابرويك (ACA; 1.5 يتم تحقيق التركيز النهائي ملغ/ مل عن طريق التخفيف من محلول الأسهم 50 ملغ / مل; يتم التعبير عن ٪ كما v/v). قم بتدفئة الوسائط مسبقا عند 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
2. إعداد خلايا للبذر hMMT.
   1. جمع لوحات ثقافة الخلية من حاضنة الثقافة. يستنشق الوسائط من كل لوحة، ثم يغسل الخلايا مرة واحدة مع D-PBS بإضافة 5 مل من D-PBS في كل لوحة ثقافة. المقبل يستنشق D-PBS وفصل الخلايا عن طريق إضافة 1 مل من 0.25٪ تريبسين-EDTA في كل طبق الثقافة. ضع في حاضنة ثقافة الخلية لمدة 3 دقائق.
   2. وقف التريبسين بإضافة 3 مل غسل المتوسطة (89٪ من 1x DMEM + 10٪ FBS + 1٪ القلم / ستريب) إلى طبق الثقافة. نقل محلول الخلية إلى أنبوب مخروطي الحجم بشكل مناسب، ومن ثم بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 400 × ز لمدة 10 دقيقة. يستنشق وسائل الإعلام مع الحرص على تجنب بيليه الخلية. ثم إعادة إنفاق بيليه الخلية في 1 مل من المتوسط غسل.
   3. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم وصبغة زرقاء تريبان تحت المجهر برايتفيلد.
      إذا كنت تستخدم لوحات متعددة من الخلايا، وهذا التعليق الخلية تكون مركزة جدا. تعليق الخلايا المخففة قبل العد حسب الحاجة.
   4. بما أن كل نسيج يتطلب 150,000 خلية أعيد إنفاقها في 15 ميكرولتر من خليط المصفوفة خارج الخلية (ECM)، فإن هناك حاجة إلى 900,000 خلية في 90 ميكرولتر من خليط ECM ل 6 أنسجة. لحساب فقدان محلول الخلية ECM الذي يحدث أثناء عملية التحضير بسبب تكوين الفقاعة أو فقدان المصة ، قم بإعداد خليط إضافي من الخلية ECM (أي 8 أنسجة ، أو 1200000 خلية في 120 ميكرولتر من ECM). نقل حجم تعليق الخلية التي تحتوي على 1,200,000 الخلايا في أنبوب مخروطي جديد. زيادة حجم إلى 10 مل مع المتوسطة غسل وتدور في 400 × ز لمدة 10 دقيقة.
   5. بينما تدور الخلايا لأسفل، قم بإعداد خليط ECM سعة 150 ميكرولتر في أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 مل باستخدام الوصفة التالية. أولا إضافة 60 ميكرولتر من DMEM (40٪ حجم), ثم إضافة 60 ميكرولتر من فيبرينوجين 10 ملغ / مل حل (40٪ حجم) وأخيرا إضافة 30 ميكرولتر من استخراج غشاء الطابق السفلي (20٪ حجم). تخزين خليط ECM على الجليد حتى الاستخدام.
      ملاحظة: استخدم دائما نصائح مبردة مسبقا عند -20 درجة مئوية عند العمل مع حلول تحتوي على مستخلص غشاء الطابق السفلي. خليط ECM يحتوي على 4 ملغم / مل من الفيبرينوجين.
3. البذر hMMTs
   1. جمع أنبوب مخروطي يحتوي على نسج أسفل الخلايا و يستنشق وسائل الإعلام مع الحرص على تجنب بيليه الخلية. نفض الغبار بقوة نهاية الأنبوب مع إصبع قفاز لطرد بيليه ومواصلة الخفقان حتى بيليه يظهر كما الطين الخلية.
      ملاحظة: من المهم أن يستنشق أكبر قدر ممكن من وسائل الإعلام غسل لضمان تعليق الخلية ECM هو في التخفيف المطلوب. استخدام ماصة لإزالة وسائل الإعلام غسل المتبقية إذا لزم الأمر.
   2. نقل 120 ميكرولتر من محلول ECM إلى الأنبوب الذي يحتوي على بيليه الخلية. ماصة صعودا وهبوطا لإعادة إنفاق الخلايا بدقة داخل ECM لتوليد تعليق خلية واحدة. ماصة ببطء وبعناية لتجنب إدخال فقاعات، والتي من شأنها أن تقلل من حجم العمل. ثم ضع محلول ECM الخلية على الجليد حتى الاستخدام.
   3. استرداد أجزاء لوحة MyoTACTIC التي تحتوي على آبار مطلية Pluronic F-127 MyoTACTIC من الثلاجة 4 درجة مئوية ووضع طبق 10 سم التي تحتوي على آبار MyoTACTIC على رأس كيس الثلج داخل غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية.
   4. يستنشق حل Pluronic F-127 من كل بئر. وPDMS مسامية وسوف تمتص محلول Pluronic F-127، وخاصة إذا تم نسج لوحات أسفل مع جهاز طرد مركزي. السماح المتبقية Pluronic F-127 حل للافراج عن وتسوية إلى الجزء السفلي من البئر عن طريق السماح لل آبار الجلوس لمدة 5 دقائق، ثم يستنشق مرة أخرى.
      ملاحظة: استخدام ماصة باستور مع طرف p1250 المرفقة في نهاية، وطرف p200 على طرف p1250 عند قرصنة الحل Pluronic F-127. وهذا من شأنه أن يحسن الدقة لمنع الطموح العرضي لهياكل البريد. تجنب كشط منطقة البذر الخلايا على شكل بركة البيضاوي في الجزء السفلي من البئر مع ماصة لأن هذا يعطل طلاء Pluronic F-127 ويتداخل مع عملية التنظيم الذاتي hMMT. التقنية المناسبة هي تحوم طرف ماصة فقط على حمام السباحة البيضاوي في حين أسبيراتينغ حل Pluronic F-127.
   5. ماصة تعليق الخلية ECM بعناية لإعادة إنفاق أي الخلايا التي قد غرقت إلى الجزء السفلي من الأنبوب. ثم نقل 105 ميكرولتر من تعليق الخلية ECM في أنبوب جديد، مبردة مسبقا 1.5 مل. الحرص على فهم أنبوب قريبة من أعلى لمنع الحل من الاحترار.
   6. إضافة 0.84 ميكرولتر من محلول الأسهم الثرومبين U/mL 100 إلى تعليق الخلية ECM 105 ميكرولتر للوصول إلى تركيز نهائي قدره 0.2 U/mg من الفيبرينوجين. Pipette بسرعة، بعناية، و تماما لخلط، مع تجنب إدخال فقاعات.
      ملاحظة: يبدأ ثروبين التحويل السريع للفيبرينوجين إلى جلطة الفيبرين. على هذا النحو، هناك وقت محدود لزرع الأنسجة على إضافة الثرومبين. لتجنب التخثر المبكر قبل نقل خليط الخلية ECM إلى آبار الثقافة ، قم بتعيين ماصة P20 إلى 15 ميكرولتر قبل إضافة الثرومبين. استخدام نصائح المبردة مسبقا أو تراجع غيض ماصة في الجليد الباردة DMEM لبضع ثوان قبل جمع ونقل 15 ميكرولتر من خليط الخلية ECM في كل بئر. ومن أفضل الممارسات لإعداد خليط الخلية ECM aliquots بحيث لا يتم بذر أكثر من 6 hMMTs في وقت واحد.
   7. لإضافة 15 ميكرولتر من خليط الخلايا -ECM (أي 150,000 خلية) إلى كل بئر على حدة. إضافة بعناية خليط الخلية ECM إلى وسط حمام السباحة البيضاوي وتجنب الضغط على طرف ماصة في الجزء السفلي من البئر. ثم، مع اثنين من الاقتراحات الخفيفة، ونشر تعليق الخلية وراء كل وظيفة في البئر. مرة واحدة هو المغلفة بالتساوي السطح في تعليق الخلية ECM، والانتقال إلى البئر المقبل.
      ملاحظة: العمل بكفاءة لتجنب هلام سابق لأوانه من خليط الخلية ECM في الأنبوب قبل أن يتم بذر جميع الأنسجة. عند بذر الآبار، من المهم للغاية تجنب نقل الفقاعات حيث أن الفقاعة ستتداخل مع إعادة عرض hMMT، مما يجعل hMMT غير قابل للاستخدام.
   8. ضع الغطاء على لوحة زراعة 10 سم التي تحتوي على الآبار المصنفة ونقلها إلى حاضنة زراعة الأنسجة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق تقريبا.
      ملاحظة: ضع أنبوب الطرد المركزي الدقيق مع خليط الخلية ECM المتبقي في الحاضنة كب التأكيد على عملية بلمرة الجل.
   9. بعد أن يبوليمر خليط الخلية ECM ، أضف 200 ميكرولتر من وسائط البذر hMMT قبل الحرب إلى كل بئر MyoTACTIC. استبدل الغطاء الموجود على طبق 10 سم ثم أعد أجزاء طبق MyoTACTIC ضمن طبق 10 سم إلى الحاضنة. يشار إلى هذه النقطة الزمنية باسم اليوم -2. لا تزعج الأنسجة حتى الخطوة التالية.
4. التمييز بين hMMTs
   1. بعد يومين من الحضانة، إزالة وسائل الإعلام البذر hMMT بعناية باستخدام ماصة واستبدالها مع 200 ميكروغرام من وسائل الإعلام التمايز قبل الحرب التي تحتوي على 2٪ مصل الحصان، 1٪ القلم / ستريب، 4٪ ACA (أي، 2 ملغ / مل التركيز النهائي من تركيز المخزون من 50 ملغ / مل؛ يتم التعبير عن ٪ كما v /v) و 10 ميكروغرام / مل الإنسان الأنسولين المؤتلف في DMEM. ويشار إلى هذه النقطة الزمنية باسم اليوم 0 من التمايز.
   2. كل يومين بعد ذلك ، وتبادل نصف وسائل الإعلام مع وسائل الإعلام التمايز جديدة حتى اليوم 12 من التمايز ، في اليوم الأخير من الثقافة(الشكل 2a).
      ملاحظة: تم نشر تفاصيل بروتوكول لتصنيع hMMTs باستخدام myoblasts الإنسان الأولية في مكان آخر³⁰. إذا كانت هناك مخاوف بشأن بقاء الخلية بعد البذر، واحتضان hMMTs مع كالسين والبروبيديوم يوديد لقياس الجدوى.

4. التحفيز الكهربائي وتحليل انحراف آخر الناجمة عن hMMT

1. إعداد الزجاج السفلي واضحة أو البلاستيك جبل المرحلة على المجهر المقلوب وإرفاق كاميرا الهاتف الذكي إلى العدسة المجهر باستخدام جبل المجهر الكاميرا. سيتم استخدام المجهر التباين المرحلة في التكبير 10x (الشكل 3a).
   ملاحظة: أي المجهر النقيض المرحلة مقلوب تجهيزها مع هدف التكبير 10x سيكون من المناسب. سيتم إزالة بناء بئر PDMS من طبق 10 سم ووضعه مباشرة على جبل المرحلة السفلية الواضحة ، وبالتالي ، مفتوح في الهواء. تعقيم جميع الأسطح والمعدات مع الإيثانول 70٪ وتقليل حركة المرور في المنطقة أثناء التجريب.
2. لإعداد أقطاب التحفيز الكهربائي، وقطع ~ 30 سم من الأسلاك النحاسية المغلفة بالقصدير. ثم، بدءا من محور إبرة شطبة العادية 25 G، التفاف ~ 10 سم من السلك بإحكام حول النصف العلوي، وترك ~ 20 سم من الأسلاك الزائدة. كرر لإبرة ثانية ثم قطع المحور قبالة كل إبرة.
   ملاحظة: يجب أن يكون السلك ضيقا حول الإبرة لضمان عدم تحركه ويجب ألا يلمس الجزء الملفوف من السلك الكهربائي PDMS لأن هذا يمكن أن يعوق توليد المجال الكهربائي.
3. إرفاق BNC إلى كابل موصل مقطع التمساح إلى قناة الإخراج على مولد الموجي وتعيين القناة لنبضات مربعة مع دورة واجب 20٪، 5 V السعة (قوة المجال الكهربائي من 10 V /cm). وسيغير التردد بين 0.5 هرتز و20 هرتز لتقلصات الارتعاش والكزاز، على التوالي.
   ملاحظة: قد تتطلب إعدادات مولد الموجي التحسين الخاصة بالتجربة
4. ضع جزء لوحة MyoTACTIC يحتوي على hMMTs على مرحلة المجهر وأدخل بلطف كل نهاية شطبة قطب كهربائي في PDMS خلف كل مشاركة مباشرة في المسبح البيضاوي. الشريط بعناية أسفل أقسام 20 سم من الأسلاك الزائدة إلى مرحلة المجهر بحيث الإبر لا تزال عمودية و ~ 10 سم من كل سلك لا يزال حرا للاتصال(الشكل 3a).
   تنبيه: لا تضع إصبعا عاريا على طرفي القطب الكهربائي. تأكد من ارتداء كشتبان على السبابة لتطبيق ضغط الضوء على القطب عند إدخاله في PDMS.
5. ركز مجال الرؤية المجهري على أحد المشاركات، بحيث يكون التركيز حادا على حافة المنشور الأقرب إلى القطب الكهربائي. ثم قم بقفل تركيز كاميرا الهاتف الذكي على أوضح منطقة في المنشور. وهذا أمر مهم لتحليل المصب كتغير في التركيز أثناء التسجيل سوف تتداخل مع التحليل.
6. قم بتوصيل النهايات الحرة للأسلاك المسجلة بمولد الموجي عبر مشابك التمساح(الشكل 3a).
7. بدء تسجيل الفيديو على كاميرا الهاتف الذكي، ومن ثم تشغيل إخراج القناة لبدء التحفيز. حث hMMT للخضوع ل 3 نشل و 3 تقلصات الكزاز، مع 2 دقيقة من الراحة بين سلسلة التحفيز نشل والكزاز.
8. إيقاف إخراج القناة، وفصل مقاطع التمساح من الأسلاك النحاسية المغلفة بالقصدير، وإزالة الشريط من الأسلاك، ومسح كل قطب كهربائي مع الإيثانول 70٪ قبل إدراجها في آبار hMMT اللاحقة. كرر الإجراء من الخطوة 4.5 لكافة hMMTs.
   ملاحظة: الحد من الوقت الذي تقضيه hMMTs خارج الحاضنة عن طريق تحفيز ما لا يزيد عن 3 أنسجة في كل مرة. إذا بقيت hMMTs إضافية داخل جزء لوحة MyoTACTIC ليتم تحليلها، أعد اللوحة إلى الحاضنة لمدة 10 دقائق للسماح ل hMMTs بالعودة إلى 37 درجة مئوية.
9. لتحليل انحراف آخر وذلك لحساب الجيل قوة hMMT، استخدم البرنامج النصي المخصص، الذي تم توفيره على GitHub (https://github.com/gilbertlabcode/myoTACTIC). اتبع التعليمات الواردة في README.md لإعداد البرنامج النصي وإطلاقه، ثم افتح كل فيديو تتبع منشور لإجراء تحليل القوة.
10. حدد منطقة الاهتمام (ROI) على طول حافة المنشور ليتم تعقبها لمرحلة ما بعد الترحيل. اضغط Enter لتأكيد عائد الاستثمار واضغط على Enter مرة أخرى لتشغيل البرنامج النصي(فيديو إضافي 1).
    ملاحظة: انحرافات كبيرة تتسبب في فشل تعقب. إذا فشل المتعقب أثناء الانكماش ، يمكن زيادة حجم عائد الاستثمار لجعل التتبع أقل حساسية ولكنه يسمح بتتبع الانحرافات الكبيرة. يتم توفير ثلاثة أحجام في التعليمات البرمجية ويمكن ضبطها عن طريق ضبط تعليقات البرنامج النصي.
11. ينتهي البرنامج النصي مع اثنين من متطلبات الإدخال. أولا، أدخل y لتأكيد احتواء الفيديو على تقلصات متعددة. ثانيا، أدخل y (نعم) أو n (لا) لتصدير النتائج إلى . ملف CSV (فيديو تكميلي 1).
12. تأكد من الإبلاغ عن نتائج انحراف المنشور كإزاحة بالبكسل لكل انكماش. تحويل وحدات البكسل إلى قيم μm لإعداد تكبير 10x المجهر. ثم، تحويل أرقام ما بعد الإزاحة إلى القوى العقدية المطلقة (μN) بضرب القيم (μm) بعامل تحويل القوة والإزاحة من 2.36 ميكرون / ميكرومتر، وهو ما يتوافق مع عامل المعالجة 1:15 إلى نسبة مونومر من PDMS المستخدمة في تصنيع MyoTACTIC³⁰.

5. تحليل الكالسيوم عابرة باستخدام التحفيز الكهربائي

ملاحظة: لتجارب التعامل مع الكالسيوم، تم نقل الخلايا الميوبلاستية الخالدة بشكل ثابت مع مراسل MHCK7-GCAMP6 كما هو موضح سابقا^11،12. تم فرز الخلايا المنقولة FACS لGFP للحصول على السكان إيجابية، ومن ثم تستخدم لتصنيع hMMTs. قد تكون الطرق البديلة لتصوير الكالسيوم مثل استخدام الأصباغ المترية مثل Fura-2 AM و Indo-1 أو التصوير مدى الحياة الفلوري لمؤشرات الكالسيوم (على سبيل المثال، Fluo-4 أو Oregon Green BAPTA1) قابلة لنظامنا.

1. إعداد مرحلة المجهر ومعدات التحفيز (الأقطاب الكهربائية، مولد الموجي، الخ) كما هو موضح سابقا في الخطوة 4. لهذه التجربة، استخدم تكبير 4x.
   ملاحظة: ستكون هناك حاجة إلى غرفة مظلمة ومجهر فلورسينس مجهز بكاميرا CCD.
2. قم بتشغيل برنامج تصوير المجهر، وحدد قناة فلتر FITC (الضوء الأزرق)، وحدد وظيفة تسجيل الأفلام. تعيين في التعرض من 500 مللي ثانية ودقة 680 × 510 (Binning 2x2).
   ملاحظة: قد تختلف برامج التصوير ويتم تعيين التعرض يدويا من قبل المستخدم. الحرص على تجنب hMMT على التعرض قبل التحفيز. في بقية, مخطط الأنسجة الداكنة / الظل مع مضان عفوية أمر طبيعي في حين أن صورة واضحة الأنسجة هو أكثر من التعرض (فيديو تكميلي 2). تأكد من أن التعرض متسق لجميع hMMTs داخل التجربة.
3. أغلق مصراع المجهر وابق قناة FITC مطفأة حتى تصبح جاهزة لتسجيل معالجة الكالسيوم.
4. عندما يتم إعداد جميع المعدات والبرامج، استرداد جزء لوحة MyoTACTIC التي تحتوي على hMMTs لتحليلها وتعيينها مباشرة على مرحلة المجهر. ثم أدخل الأقطاب الكهربائية وربطها كما هو موضح سابقا في الخطوة 4.
5. استخدم brightfield لتركيز مجال الرؤية على مركز hMMT المحدد. ثم قم بإيقاف تشغيل المصباح.
6. افتح مجهر مصراع قناة FITC، وتأكد من تشغيل الضوء الأزرق، ثم حدد سجل الأفلام في البرنامج.
7. قم بتشغيل الإخراج على مولد الموجي لبدء التحفيز الكهربائي. حث hMMT للخضوع 8 نشل و 8 تقلصات الكزاز. السماح لمدة 2 دقيقة من الراحة بين سلسلة التحفيز نشل والكزاز، وخلال هذه الفترة مصراع FITC هو في موقف مغلق.
   ملاحظة: السماح لمدة 10 s من النشاط التلقائي قبل وبعد التحفيز الكهربائي لتسجيل الحد الأدنى من الفلورسينس لأغراض الحساب وتحليل البيانات.
8. إيقاف إخراج القناة، وفصل مقاطع التمساح من الأسلاك النحاسية المغلفة بالقصدير، وإزالة الشريط من الأسلاك، ومسح كل قطب كهربائي مع الإيثانول 70٪ قبل إدراجها في آبار hMMT اللاحقة. تكرار التحفيز وتسجيل الإجراء لجميع hMMTs.
9. حفظ الأفلام بتنسيق ملف TIFF للتحليل في ImageJ أو برنامج تصوير بديل.
   ملاحظة: الحد من الوقت الذي تقضيه hMMTs خارج الحاضنة عن طريق تحفيز ما لا يزيد عن 3 أنسجة في كل مرة. إذا بقيت hMMT إضافية ضمن جزء لوحة MyoTACTIC ليتم تحليلها، أعد الجهاز إلى الحاضنة لمدة 10 دقائق للسماح hMMTs للعودة إلى 37 درجة مئوية.
10. لتحليل بيانات الكالسيوم العابرة، افتح ImageJ أولا. حدد تحليل، ثم تعيين القياسات، ثم حدد متوسط القيمة الرمادية ثم قم بإلغاء تحديد كافة الخيارات الأخرى. عند الانتهاء، افتح مقطع فيديو للكالسيوم (.tiff)(فيديو تكميلي 2).
11. مخطط حدود microtissue باستخدام أداة اختيار المضلع وحفظ هذه المنطقة كما ROI (فيديو تكميلي 2). ضمن المزيد في إطار إدارة عائد الاستثمار، حدد Multi Measure وقياس كثافة الفلورسنت لجميع شرائح الملفات بصف واحد لكل شريحة ( فيديو تكميلي2).
12. نسخ جميع القياسات، بما في ذلك رقم الشريحة (الإطار)، إلى جدول بيانات ومقارنة كثافة الفلورسنت لكل شريحة إلى الحد الأدنى من كثافة الفلورسنت التلقائي من الملف باستخدام ΔF/F₀ = (F_فوري -_{F الحد الأدنى}) / F_{الحد الأدنى} (فيديو تكميلي 2).
13. حساب الوقت لكل إطار عن طريق ضرب الفيلم تسجيل سرعة الإطار من قبل عدد شريحة (الإطار)، ورسم ΔF / F₀ ضد الوقت للاستجابة العابرة الكالسيوم hMMT للتحفيز (فيديو تكميلي 2).
14. حدد ذروة إشارة الكالسيوم العابرة لكل من 6 تقلصات متتالية ومتوسط القيم لحساب المتوسط النسبي لتغير كثافة الفلورسنت الذروة لكل hMMT (فيديو تكميلي 2).
    ملاحظة: تستبعد دائما البيانات الناشئة عن انكماش الارتعاش الأول من التحليل الكلي. تم توفير جدول بيانات بعنوان "قالب معالجة الكالسيوم.xlsx" على GitHub (https://github.com/gilbertlabcode/Calcium-Handling-Template-) لتسهيل تحليل الكالسيوم العابر hMMT. يتم تمييز الخلايا القابلة للتعبئة حيث يتم إدخال القيم والمدخلات باللون الرمادي. تأكد من ضبط أرقام التحديد الذروة لأن هذا هو مجرد دليل للمساعدة في اختيار الذروة (فيديو تكميلي 2).

وصف هنا هي أساليب ليلقي 96 جيدا PDMS المستندة إلى منصة الثقافة MyoTACTIC من قالب PU، لتصنيع صفائف من الأنسجة المتماثلة hMMT، وتحليل جانبين من وظيفة hMMT داخل توليد قوة الجهاز الثقافة والتعامل مع الكالسيوم. الشكل 1 يقدم نظرة عامة تخطيطية لإعداد آبار الثقافة MyoTACTIC قبل البذر hMMT. PDMS هو البوليمر على أساس السيليكون المستخدمة على نطاق واسع، والتي يمكن تشكيلها بسهولة لإنشاء أجهزة معقدة32. تم تصميم بروتوكول يستند إلى PDMS ليلقي عددا غير محدود من أجهزة الثقافة 96-well من قالب PU سلبي مصنع30. النهائي PDMS الشفاء لوحة إيجابية مرنة ويمكن قطع بسهولة إلى وحدات وظيفية أصغر حجما بمساعدة شفرة حلاقة حافة واحدة (الشكل 1). وهذا يسمح للمستخدم لتوسيع نطاق الجهاز لتلبية النسخة المتماثلة hMMT يحتاج محددة لتصميمها التجريبي. هذه الوحدات الوظيفية الصغيرة مفيدة أيضا للتغلب على قيود العمل مع سقالة ECM التي تبلمرة بسرعة ، مثل هيدروجيلس الفيبرين ، عن طريق ضبط عدد الآبار بسهولة لتتناسب مع سرعة بذر الخلية للمستخدم. وعلاوة على ذلك، PDMS هو autoclavable بسهولة ويمكن تخزينها لفترة غير محددة. وأخيرا، من وجهة نظر لوجستية، يمكن تغطية لوحة MyoTACTIC كاملة من قبل أي غطاء لوحة 96 جيدا القياسية، والبعد والملف الشخصي للأجزاء لوحة MyoTACTIC قابلة للحضانة داخل لوحة ثقافة 10 سم، لضمان عقم الثقافة hMMT. Pluronic F-127 طلاء الحل قبل بذر الخلية يخدم دورا مزدوجا لتوفير قدر إضافي من الثقافة تعقيم جيدا، وكخافض الأعصاب غير الأيونية، ومنع الالتصاق الخلية لصالح خلية موحدة - إعادة عرض ECM (الشكل 1).

عندما تكون مجموعة خلايا السلف الميوجينية الخالدة جاهزة للتجريب ، يتم تغليف الخلايا بعد ذلك في هيدروجيل يتألف من استخراج غشاء الفيبرينوجين والطابق السفلي. ثم يتم إيداع خليط الخلية ECM بالتساوي في المسبح البيضاوي في الجزء السفلي من كل بئر MyoTACTIC ، ثم على مدى فترة ثقافة مدتها 14 يوما ، تنظم الخلايا نفسها مكانيا عبر هاتين المشاركتين الرأسيتين لتشكيل ميكروتيسو ثلاثي الأبعاد يسكنه سرير من الميوتوبات المنحازة والمتعددة النوى والمزخرطة التي تشبه جوانب تنظيم الأنسجة الأصلية (الشكل 2a، ز،ح). خلال عملية إعادة عرض، يتم إنشاء التوتر أحادية الجنس بين نقطتي مرسى، وهذا يوجه عملية التنظيم الذاتي الأنسجة لدفع بدوره تشكيل الأنسجة المدمجة. خلال فترة التمايز ، لا يزال عرض hMMTs التي شيدت من الخلايا الميوبلاستية المستمدة من المرضى الأصحاء متسقا إلى حد ما. ومع ذلك ، في أحداث الأخطاء التي تتداخل مع إعادة عرض hMMT ، يتم فقدان هذا التوحيد (الشكل 2a-f) ، مما يجعل هذا المقياس البسيط مفيدا في تقييم مراقبة الجودة hMMT. على سبيل المثال ، يمكن أن يؤدي الاختلاط المفرط للخلية - تعليق ECM إلى تكوين فقاعات. فقاعات ترحيلها إلى MyoTACTIC تعوق جيدا hMMT إعادة عرض. في مثل هذه الحالات، فقاعات إزاحة بعض أو كل من الخلايا الميوبلاست من المنطقة التي تحتلها فقاعة، وتشكيل في نهاية المطاف شق في hMMT النهائي(الشكل 2B؛ انظر السهم الأحمر). وثمة مثال آخر يتعلق بسلامة طلاء Pluronic F-127 في الآبار. Pluronic F-127 هو السطحي غير الأيونية التي تمنع الخلايا من التمسك جيدا MyoTACTIC. إذا تم كشط الطلاء قبالة خلال الطموح، سوف تلتزم myoblasts إلى سطح الآبار MyoTACTIC، وتشكيل نقاط مرسى جديدة، مما أدى إلى myotubes التي لا تتماشى عبر اثنين من الوظائف (الشكل 2C). أخطاء إضافية يمكن أن يؤدي أيضا إلى إعادة عرض hMMT شاذة، كما رأينا في الشكل 2D-و. ويمكن أيضا خلية حيوية بعد البذر يمكن تقييمها باستخدام كالسين / بروبيديوم iodide القائم على تلطيخ المقايسات. عندما يتم تجنب هذه الأخطاء التقنية، يتم ملؤها hMMTs بواسطة سرير من الأنابيب الميوتوبيت المنحازة والمتعددة النوى التي تمتد عبر طول كل hMMT (الشكل 2G). و myotubes موحدة إلى حد ما في الحجم عبر طولها وبين hMMTs مختلفة (الشكل 2h-ط). تتميز الميوتوب بوجود تصدعات الساركومير التي يتم تصورها عن طريق التلطخ المناعي α الساركومريك - أكتينين (SAA؛ الشكل 2h).

ويمكن أيضا أن تدرس خصائص وظيفية في hMMTs ابتداء من حوالي 7 أيام من التمايز. ويتضح الإعداد التجريبي لإكمال هذه الدراسات الوظيفية في الشكل 3أ. يتم تصوير إعداد المجهر على رأس جدول vibraplane; ومع ذلك، هذا غير مطلوب لإكمال التحقيقات الوظيفية. في الدراسات الوظيفية ، يتم إدخال الأقطاب الكهربائية المولدة كما هو موضح في قسم التحفيز الكهربائي للبروتوكول في PDMS ، بحيث تتواجد الأقطاب الكهربائية خلف المشاركات. من المهم أن يكون التصور الجيد للمنطقة ما بعد قبل إدراج القطب كما الحاجة إلى إعادة إدراج قد يؤدي إلى إزاحة الأنسجة من آخر. الإدراج السليم للأقطاب الكهربائية مهم أيضا للحصول على تركيز حاد على المنشور بحيث يمكن تتبع ما بعد الانحراف لاحقا مع نص الثعبان. يظهر الشكل 3b إزاحة تمثيلية للوحة بئر MyoTACTIC استجابة للتحفيز الكهربائي منخفض (نشل، 0.5 هرتز) وعالي (الكزاز، 20Hz). يمكن استخدام القياس الكمي لإزاحة ما بعد الإزاحة لحساب القوة العقدية المستحثة ل hMMTs(الشكل 3c). عندما يتم دمج هذه المعلومات مع منطقة المقطع العرضي hMMT، يمكن تحديد قوة محددة30. وعلاوة على ذلك، عابري الكالسيوم تلعب دورا هاما في تقلص العضلات. نقل مستقر من العضلات الهيكل العظمي myoblasts مع مؤشر الكالسيوم المشفرة وراثيا مثل GCaMP612،30،33،34، تمكن المراقبة الحية للعابرات الكالسيوم12،30،34. تم تحليل عابري الكالسيوم باستخدام إعداد التحفيز الكهربائي الموصوف أعلاه لتحفيز اليوم 12 hMMTs المتولد مع الخلايا الميوبلاستية الخالدة التي تعبر عن مراسل MHCK7-GCAMP6(الشكل 4a)، وكميا كميا ككثافة ذروة الفلورسنت المتوسطة أثناء انخفاض (الارتعاش ، 0.5 هرتز) وعالية (التيتانوس ، 20Hz) التحفيز الكهربائي التردد(الشكل 4b). ويلاحظ أن خصائص مناولة الكالسيوم hMMT قياسها عبر تجارب مختلفة متسقة نسبيا(الشكل 4ب). وترد طرق القياس الكمي لمرحلة ما بعد انحراف والمناولة الكالسيوم في الفيديو التكميلي 1 والفيديو التكميلي 2.

الشكل 1: إعداد لوحة PDMS MyoTACTIC قبل البذر hMMT. منصة 96 جيدا يشار إليها باسم MyoTACTIC ملفقة من خلال علاج البوليديميثيلسيلوكسيان الأول (PDMS) داخل قالب البولي يوريثان السلبي (PU). ثم يتم تقشير منصة الثقافة المستندة إلى PDMS بعناية من قالب PU السلبي. في بيئة أكاديمية، يتم قطع جهاز PDMS بعد ذلك إلى وحدات أصغر تحتوي على 6 ± بئرين وظيفيين. ثم يتم وضع هذه الآبار في حقيبة التعقيم، autoclaved وتخزينها حتى الاستخدام. قبل يوم واحد من الاستخدام، يتم وضع العدد المطلوب من أجزاء الجهاز داخل لوحة ثقافة 10 سم ويتم إضافة Pluronic F-127 إلى كل بئر. يضاف غطاء طبق 10 سم، وختم الحافة مع parafilm قبل احتضان لوحة في 4° لمدة 2-24 ح. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: MyoTACTIC يدعم hMMT التنظيم الذاتي وتشكيل myotubes الانحياز. (أ)(أعلى) الجدول الزمني التخطيطي للتنظيم الذاتي hMMT والنضج myotube اللاحقة على مدى فترة الثقافة 14 يوما. (أسفل) صور التباين المرحلي التمثيلية 4x لتوضيح حركية التنظيم الذاتي للخلايا الميوبلاستية الخالدة عبر المشاركتين الرأسيتين اللذين ينتج عنهما تشكيل hMMT ثلاثي الأبعاد. شريط مقياس، 500 ميكرومتر (ب-و) صور تمثيلية 4x المرحلة التباين من hMMTs في اليوم 12 من التمايز تظهر نتائج hMMT الناجمة عن (ب) فقاعة داخل الخلية - ECM في وقت البذر (نقاط السهم الأحمر لفقاعة تحفز تلف hMMT)، (ج) طموح غير صحيح من طلاء الحل Pluronic F-127، و (د-و ) hMMT الإفراط في إعادة عرض التي يمكن أن تشير إلى هلام ECM غير لائق، وعدم وجود نشاط ACA في وسائل الإعلام الثقافية، والرعاية غير لائق من خط الوالدين myoblast، الخ. شريط مقياس، 500 ميكرومتر (ز) صورة تمثيلية من البلاط وسويت confocal من يوم 12 hMMT التي اتخذت في التكبير 10x. يتم إصلاح hMMTs مباشرة في قالب PDMS ، ثم إزالتها بعناية ووضعها في لوحة ثقافة بئر 96 للتلطيخ. ساركومريك α-أكتينين (SAA) هو مبين في أرجواني, وهويشست 33342 مضادة النووية تظهر في سماوي. شريط مقياس، 500 ميكرومتر (ح) صورة كونفوجال تمثيلية ليوم 12 hMMT في التكبير 40x. يتم تصور hMMT myotubes والنواة عن طريق التلطخ المناعي لSAA (أرجواني) ومكافحة الاحتواء مع Hoechst 33342 (سماوي). شريط مقياس، 50 ميكرومتر(ط) رسم بياني مؤامرة نقطة من متوسط قطر الميوتوب hMMT في اليوم 12 من التمايز. يتم الإبلاغ عن القيم على أنها متوسط ± SEM. n = 8 hMMTs من 3 نسخ بيولوجية متماثلة ، تتميز بأشكال الرموز ، حيث يتم تحليل ما لا يقل عن 30 myotubes لكل hMMT. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3:قياس القوة المتعاقدة في الموقع داخل منصة MyoTACTIC. (أ) تمثيل ترتيب التحفيز الكهربائي (يسار). على الرغم من أن في الصورة في هذا الإعداد، جدول vibraplane غير مطلوب. تم تجهيز كاميرا الهاتف الذكي وجبل إلى العدسة من المجهر المقلوب مجهزة مصباح مضان لتسجيلات الفيديو من hMMTs التحفيز الكهربائي آخر التشريد (اليسار). تم لف إبر 25 G بأسلاك نحاسية مغلفة بالقصدير (أسفل اليمين) ، متصلة بكابل موصل BNC إلى مشبك التمساح (أعلى اليمين) وتم لصقها على مولد موجي تعسفي. يظهر موضع الأقطاب الكهربائية أثناء التحفيز الكهربائي في أسفل اليمين. (ب)لقطات تمثيلية مأخوذة من أشرطة الفيديو بعد انحراف المكتسبة من hMMTs في اليوم 12 من التمايز. تم التقاط مقاطع الفيديو بتكبير 10x. تظهر الخطوط العمودية البيضاء الصلبة موضع النشر عندما تكون hMMTs مسترخية ، في حين تظهر الخطوط العمودية البيضاء المنقطة إزاحة ما بعد الإزاحة بعد تحفيز التردد العالي (التيتانوس 20 هرتز) أو المنخفض (0.5 هرتز). شريط المقياس، 100 ميكرومتر (ج) الرسم البياني لمؤامرة نقطة من متوسط نشل hMMT (0.5 هرتز) - والتيتانوس (20 هرتز) الناجمة عن القوة العقدية في اليوم 12 من التمايز. يتم الإبلاغ عن القيم على أنها متوسطة ± SEM. n = 9 hMMTs من 3 نسخ بيولوجية متماثلة، تتميز بأشكال الرموز. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4:قياس مناولة الكالسيوم في الموقع داخل منصة MyoTACTIC. (أ) صور تمثيلية من تسجيل فيديو تكبير 4x ل GCaMP6 التلقائي+ عابري الكالسيوم وعابري الكالسيوم استجابة لانخفاض (انكماش الارتعاش ، 0.5 هرتز) وارتفاع (انكماش الكزاز ، 20 هرتز) التحفيز الكهربائي التردد. يتم تحديد hMMTs بواسطة خط أصفر منقط. شريط المقياس، 200 ميكرومتر (ب) الرسم البياني مؤامرة نقطة تبين كمي من متوسط كثافة الفلورسنت الذروة لكل hMMT التالية منخفضة (انكماش نشل، 0.5 هرتز) وعالية (انكماش الكزاز، 20 هرتز) التحفيز الكهربائي التردد. يتم الإبلاغ عن القيم على أنها متوسطة ± SEM. n = 9 hMMTs من 3 نسخ بيولوجية متماثلة، تتميز بأشكال الرموز. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

فيديو إضافي 1: عرض توضيحي لطرق تحليل بيانات ما بعد الانحراف. شريط فيديو تمثيلي لتحليل انحراف آخر في اليوم 12 من التمايز يجري تعقبها من قبل السيناريو المخصص أثناء تحفيز الكزاز. أولا يتم تحديد حجم عائد الاستثمار مباشرة ضمن برنامج نصي تتبع آخر. بعد ذلك يتم فتح الفيديو عن طريق تحديد زر التشغيل لتشغيل البرنامج النصي. يتم تحديد منطقة مركزة بحدة من المنشور كما يتم وضع عائد الاستثمار ومربع تتبع البريد الأزرق. يتم الضغط على Enter لتأمين عائد الاستثمار والضغط عليه مرة أخرى لتشغيل البرنامج النصي. يتم إدخال "y" استجابة للمطالبة "فيديو انكماش متعدد؟ [Y/N]" ، ثم يتم إدخال 'n' كرد على المطالبة "تصدير مواقع النشر كملف .csv؟ [Y/N]". آخر انحراف والتشريد النسبي في بكسل هو الإخراج النهائي. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.

فيديو إضافي 2: عرض توضيحي لطرق تحليل بيانات GCaMP6 العابرة للكالسيوم. فيديو تمثيلي لتحليل معالجة الكالسيوم في اليوم 12 من التمايز أثناء تحفيز الكزاز. أولا، تم فتح فيديو للعابفين الكالسيوم (حفظها كسلسلة من الصور tiff) في ImageJ والمستخدم قد انتقل من خلال الإطارات حتى hMMT مرئيا. ثم يتم تأكيد قياس التحليل المطلوب "متوسط القيمة الرمادية" ويتم تحديد hMMT باستخدام أداة الرسم المضلع. يتم حفظ هذا المخطط التفصيلي كما يتم تحليل المنطقة ذات الاهتمام وكثافة الفلورسنت لكل شريحة فيديو باستخدام قياس متعدد. يتم نسخ هذه القياسات إلى جدول البيانات "قالب معالجة الكالسيوم" مع بيانات الإطار وقيم ذروة الكالسيوم العابرة التي تم ملؤها وتأكيدها. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.

ولا يوجد لدى صاحبي البلاغ تضارب في المصالح يعلنانه.