Method Article

حيود الإلكترون الجهورالوفولفي للجزيئات الصغيرة

DOI:

10.3791/62313

⸱

March 15th, 2021

 , 
1Howard Hughes Medical Institute, University of California Los Angeles, 2Department of Biological Chemistry, University of California Los Angeles, 3Department of Physiology, University of California Los Angeles

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نصف الإجراءات التي تم تطويرها في مختبرنا لإعداد مساحيق بلورات الجزيئات الصغيرة لتجارب حيود الإلكترون البلوري الدقيق (MicroED).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم وصف بروتوكول مفصل لإعداد عينات الجزيئات الصغيرة لتجارب حيود الإلكترون البلوري الدقيق (MicroED). تم تطوير MicroED لحل هياكل البروتينات والجزيئات الصغيرة باستخدام معدات الفحص المجهري الإلكتروني بالتبريد (cryo-EM) القياسية. بهذه الطريقة ، تم مؤخرا تحديد الجزيئات الصغيرة والببتيدات والبروتينات القابلة للذوبان والبروتينات الغشائية بدقة عالية. يتم تقديم البروتوكولات هنا لإعداد شبكات من المستحضرات الصيدلانية ذات الجزيئات الصغيرة باستخدام عقار كاربامازيبين كمثال. يتم تقديم بروتوكولات لفحص وجمع البيانات. يتم تقديم خطوات إضافية في العملية الشاملة ، مثل تكامل البيانات وتحديد الهيكل والتحسين في مكان آخر. يقدر الوقت اللازم لإعداد شبكات الجزيئات الصغيرة بأقل من 30 دقيقة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حيود الإلكترون البلوري الدقيق (MicroED) هو طريقة مجهرية إلكترونية بالتبريد (cryo-EM) لتحديد هياكل الدقة الذرية من بلورات بحجم أقل منميكرومتر 1,2. يتم تطبيق البلورات على شبكات المجهر الإلكتروني القياسي (TEM) ويتم تجميدها إما عن طريق الغطس في الإيثان السائل أو النيتروجين السائل. ثم يتم تحميل الشبكات في TEM تعمل في درجات حرارة مبردة. توجد البلورات على الشبكة ويتم فحصها للتأكد من جودة الحيود الأولية. الدوران المستمر يتم جمع بيانات MicroED من مجموعة فرعية من البلورات التي تم فحصها ، حيث يتم حفظ البيانات باستخدام كاميرا سريعة كفيلم3. يتم تحويل هذه الأفلام إلى تنسيق بلوري قياسي ومعالجتها بشكل ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تحضير عينات الجزيئات الصغيرة

  1. انقل كمية صغيرة (0.01 - 1 مجم) من المسحوق أو السائل أو المواد الصلبة إلى قنينة أو أنبوب صغير.
  2. بالنسبة للعينات الموجودة بالفعل في شكل مسحوق ، أغلق الأنبوب باستخدام الغطاء حتى تكون هناك حاجة إلى العينة. جفف العينات السائلة إلى مساحيق قبل محاولات الطريقة 1 (الخطوة 3) أو 2 (الخطوة 4).
    ملاحظة: قد تستخدم العينات المذابة في السائل الطريقة 3 (5.X) أدناه

2. إعداد شبكات TEM

ملاحظة: تتطلب بعض TEMs المزودة بأنظمة التحميل التلقائي قص الشبكات ووضعها في علبة قبل تحميلها في عمود TEM. يتضمن القص تأمين شبكة TEM مقاس 3 مم فعليا في حلقة معدنية يمكن للمحمل التلقائي معالجتها. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MicroED هي طريقة cryoEM تستفيد من التفاعلات القوية بين الإلكترونات والمادة ، والتي تسمح بالتحقيق في البلورات الصغيرة المتلاشية12,13. بعد هذه الخطوات ، من المتوقع أن يكون هناك فيلم حيود بتنسيق بلوري تم جمعه من البلورات الدقيقة (الفيلم 1). هنا ، يتم عرض التقنية باستخدام كاربامازيبين12. تظهر النتائج مجموعة بيانات MicroED ذات دوران مستمر من بلورة كاربامازيبين دقيقة تم تحديدها على شبكة TEM (الفيلم 1). تحتوي مجم.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عادة ما يكون إعداد العينة عملية تكرارية ، حيث يتم إجراء التحسينات بعد جلسات الفحص وجمع البيانات. بالنسبة لعينات الجزيئات الصغيرة ، غالبا ما يكون من الحكمة أولا محاولة تحضير الشبكة دون تفريغ الشبكات المتوهجة ، نظرا لأن العديد من المستحضرات الصيدلانية تميل إلى أن تكون كارهة للماء10,11. إذا كانت الشبكات تحتوي على عدد قليل جدا من الرواسب البلورية النانوية ، فمن الجيد المحاولة مرة أخرى بعد تفريغ الشبكات المتوهجة أولا. قد يكون الأمر كذلك أن بلورات المساحيق المجففة بالت.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم دعم مختبر جونين بأموال من معهد هوارد هيوز الطبي. تم دعم هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة P41GM136508.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.1-1.5 مل أنابيب إيبندورففيشر Scientific14-282-300أي قارورة أو أنبوب سيفي بالغرض.
مقاطع AutogridThermo-Fisher1036173الشبكات المقطوعة ليست مطلوبة ل MicroED. وهي مطلوبة ل Thermo-Fisher TEMs المجهزة بنظام التحميل التلقائي.
حلقات Autogrid CThermo-Fisher1036171
CarbamazapineSigmaC4024-1Gأي مبلغ يكفي لهذه التجارب
كاشف CMOSالقائم على Thermo-FisherCetaD 16Mاستخدمنا CetaD 16M ، ولكن أي كاشف مع وضع مصراع المتداول أو قراءة سريعة بما فيه الكفاية مقبول.
برنامج دلفيThermo-Fisher N/ Aعلى أنظمة Thermo-Fisher TEM التي تسمح بالتناوب اليدوي لمرحلة العينة
برنامج EPU-DThermo-Fisher N/ Aبرنامج تجاري للحصول على شرائح الغطاء الزجاجي لبيانات MicroED
هامبتونHR3-231
مفرغ التوهجPelcoeasiGlow
High Precision TweezersEMS78325-ACأي ملاقط عالية الدقة ستعمل
وعاء النيتروجين السائلSpear LabFD-800وعاء رغوي قياسي للتعامل مع العينات تحت النيتروجين السائل - 800 مل
برنامج SerialEMUC BoulderN / Aبرنامج مجاني يوزعه D. Mastronarde. قسم علم الأحياء الجزيئي والخلوي والتنموي
شبكات TEMQuantifoil / EMSQ310CMAMulti-A 300 شبكة هنا ، ولكن أي شبكات كربونية رقيقة ستعمل. بالنسبة لهذه الجزيئات الصغيرة ، نقترح البدء بالكربون المستمر.
مجهر إلكتروني ناقل الحركة (TEM)Thermo-FisherTalos Arctica
WhatmanMillipore-SigmaWHA100109090 مم أو أكبر
تم استخدامورق ترشيح دائري

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals. eLife. 2, 01345(2013).
  2. Nannenga, B. L., Shi, D., Leslie, A. G. W., Gonen, T. High-resolution structure determination by continuous-rotation data ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microcrystal Electron DiffractionSmall Molecule StructureMicroED ProtocolElectron Cryo MicroscopyTEM Grid PreparationHigh Resolution StructureDiffraction Data CollectionCrystallographic SoftwareSample PreparationAtomic Resolution

Related Articles