مقالة منهجية

بروتوكول استخراج الحمض النووي للبعوض القائم على الخرز المغناطيسي لتسلسل الجيل التالي

DOI:

10.3791/62354

⸱

أبريل 15, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Florida Medical Entomology Laboratory, Department of Entomology and Nematology, Institute of Food and Agricultural Sciences, University of Florida, 2U. S. Fish and Wildlife Service, Pacific Islands Fish and Wildlife Office, 3Department of Entomology and Nematology, University of California Davis

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الموصوف هنا هو بروتوكول استخراج الحمض النووي باستخدام الخرز المغناطيسي لإنتاج استخراج الحمض النووي عالية الجودة من البعوض. هذه الاستخراجات مناسبة لنهج تسلسل الجيل التالي من المصب.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

اقترح بروتوكول استخراج الحمض النووي الذي نشر مؤخرا باستخدام الخرز المغناطيسي وأداة استخراج الحمض النووي الآلي أنه من الممكن استخراج الحمض النووي عالي الجودة والكمية من بعوضة فردية محفوظة جيدا كافية لتسلسل الجينوم الكامل في المصب. ومع ذلك، يمكن أن يكون الاعتماد على أداة استخراج الحمض النووي الآلية باهظة الثمن مانعة بالنسبة للعديد من المختبرات. هنا ، توفر الدراسة بروتوكول استخراج الحمض النووي القائم على حبة مغناطيسية صديقة للميزانية ، وهو مناسب للنسب المنخفضة إلى المتوسطة. تم اختبار البروتوكول الموصوف هنا بنجاح باستخدام عينات البعوض Aedes aegypti الفردية. سيؤدي انخفاض التكاليف المرتبطة باستخراج الحمض النووي عالي الجودة إلى زيادة تطبيق تسلسل الإنتاجية العالية على المختبرات والدراسات المحدودة الموارد.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد سمح التطور الأخير لبروتوكول استخراج الحمض النووي المحسن1 بالعديد من الدراسات عالية التأثير في المصب التي تنطوي على تسلسل الجينوم الكامل2و3و4و5و6. يوفر بروتوكول استخراج الحمض النووي القائم على الخرز المغناطيسي هذا غلة الحمض النووي الموثوقة من عينات البعوض الفردية ، مما يقلل بدوره من التكلفة والوقت المرتبط بالحصول على عدد كاف من العينات من مجموعات الحقول.

وترتبط التطورات الأخيرة في علم الجينوم السكاني والمناظر الطبيعية ارتباطا مباشرا بانخفاض تكاليف تسلسل الجينوم بأكمله. على الرغم من أن بروتوكول استخراج الحمض النووي السابق1 يزيد من الكفاءة المرتبطة بالتسلسل الإنتاجي العالي ، إلا أن المختبرات / الدراسات الأصغر بدون الأموال قد تختار عدم استخدام هذه المناظر الطبيعية القوية الجديدة وأدوات الجينوم السكاني بسبب تكاليف تنفيذ البروتوكول (على سبيل المثال ، تكاليف الأدوات المتخصصة).

هنا، يتم تقديم بروتوكول استخراج الحمض النووي المعدلة التي تستخدم خطوة استخراج حبة مغناطيسية مماثلة نيمان وآخرون1 للحصول على الحمض النووي عالية النقاء ولكن لا تعتمد على أدوات عالية التكلفة لتحلل الأنسجة واستخراج الحمض النووي. هذا البروتوكول مناسب للتجارب التي تتطلب >10 نانوغرام من الحمض النووي عالي الجودة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تخزين العينات العامة والاستعدادات قبل استخراج الحمض النووي

  1. هيدرات العينة في 100 ميكرولتر من الماء PCR الصف لمدة 1 ساعة (أو بين عشية وضحاها) في 4 درجة مئوية إذا تم تخزين العينة في الكحول >70٪ لتنعيم الأنسجة.

2. تعطيل العينة

  1. تعيين حاضنة أو اهتزاز كتلة الحرارة في 56 درجة مئوية.
  2. جعل البروتين K (PK) العازلة / مزيج الانزيم. مطلوب 2 ميكرولتر من البروتين K (100 ملغم / مل) و 98 ميكرولتر من البروتين K العازلة (مجموع 100 ميكرولتر) لكل استخراج البعوض الفردية. لإعداد مزيج رئيسي لعينات متعددة، وزيادة المبلغ الإجمالي (مجتمعة لجميع العينات الفردية) بنسبة ~ 15٪ لضمان توافر حجم كاف.
  3. إذا كانت العينات رطبة قبل الاستخراج، فتخلص من المياه من كل أنبوب عينة.
  4. في أنبوب طرد دقيق سعة 1.5 مل يحتوي على أنسجة البعوض، أضف 100 ميكرولتر من مزيج PK العازل/الإنزيم.
  5. تجانس الأنسجة باستخدام الحشرات أنبوب الطرد الدقيق.
  6. طرد العينات لمدة دقيقة واحدة في 9600 × ز في درجة حرارة الغرفة.
  7. احتضان العينة لمدة 2-3 ساعة عند 56 درجة مئوية.
  8. أثناء الحضانة، قم بإعداد الكواشف الأخرى باستخدام خطوة استخراج الحمض النووي (الخطوة 3).

3. استخراج الحمض النووي

  1. جعل مزيج رئيسي حبة المغناطيسي. لكل عينة، اخلط 100 ميكرولتر من حاجز التحلل، و100 ميكرولتر من الإيزوبروبانول، و15 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي (إجمالي 215 ميكرولتر). لإعداد مزيج رئيسي لتفاعلات متعددة، وزيادة المبلغ الإجمالي (مجتمعة لجميع العينات الفردية) بنسبة ~ 20٪ لضمان توافر حجم كاف.
  2. بعد وقت الحضانة (الخطوة 2.7)، قم بنقل كل lysate إلى أنبوب طرد دقيق نظيف أو بئر ميكروبليت باستخدام ماصة.
  3. إضافة 100 μL lysate و 215 ميكرولتر من مزيج حبة مغناطيسية رئيسية لكل عينة.
  4. استخدام ماصة لخلط جيدا لمدة 10-20 ق ثم السماح لها الوقوف لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. هز الأنبوب برفق في بعض الأحيان لتحقيق أقصى قدر من الربط بين الخرز المغناطيسي والحمض النووي.
  5. ضع الأنبوب/اللوحة على فاصل الخرز المغناطيسي وانتظر حتى يصبح المحلول واضحا.
  6. تجاهل السائل من أنبوب / لوحة باستخدام ماصة. عند إزالة الناطقة الفائقة، حاول عدم لمس أو إزعاج الخرز المغناطيسي الذي يحمل الحمض النووي.
  7. نقل أنبوب / لوحة بعيدا عن فاصل حبة المغناطيسي وإضافة 325 ميكرولتر من العازلة الغسيل 1 إلى كل بئر.
  8. تخلط جيدا عن طريق pipetting واحتضان لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  9. كرر الخطوات 3.5-3.6.
  10. نقل أنبوب / لوحة بعيدا عن فاصل حبة المغناطيسي وإضافة 250 ميكرولتر من العازلة غسل 1 إلى كل بئر.
  11. تخلط جيدا عن طريق pipetting واحتضان لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  12. كرر الخطوات 3.5-3.6.
  13. حرك الأنبوب/الصفيحة بعيدا عن فاصل الخرز المغناطيسي وأضف 250 ميكرولتر من عازل الغسيل 2 إلى كل عينة.
  14. تخلط جيدا واحتضان لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  15. كرر الخطوات 3.5-3.6.
  16. نقل أنبوب / لوحة بعيدا عن فاصل حبة المغناطيسي وإضافة 250 ميكرولتر من العازلة غسل 2 إلى كل بئر.
  17. تخلط جيدا واحتضان لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  18. كرر الخطوات 3.5-3.6.
  19. نقل أنبوب / لوحة بعيدا عن فاصل حبة المغناطيسي وإضافة 100 ميكرولتر من العازلة elution إلى كل بئر.
  20. تخلط جيدا واحتضان لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  21. تحريك أنبوب / لوحة على فاصل حبة المغناطيسي والانتظار حتى الحل واضح.
  22. ماصة العملاقة في أنبوب جديد نظيف 0.5 ميكروسينتريف أو microplate جيدا.
  23. تخزين عينات الحمض النووي في 4 °C (تصل إلى 1 أسبوع) أو -80 °C.  إذا كان يتم استخدام لوحة صغيرة، وتغطية ذلك مع parafilm.
  24. تحديد غلة الحمض النووي باستخدام أي طريقة مناسبة.
    ملاحظة: في هذه الدراسة، تم استخدام قراءة الحمض النووي للفلورومتر وامتصاصه عند 260/280 نانومتر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وكان متوسط غلة الحمض النووي لكل رأس البعوض الفردية / أنسجة الصدر 4.121 نانوغرام / ميكرولتر (N = 92، الانحراف المعياري 3.513) تقاس باستخدام مقياس الفلورومتر عند التملبد باستخدام 100 ميكروغرام من العازلة elution. وهذا يكفي ل10-30 نانوغرام متطلبات إدخال الحمض النووي الجينوم اللازمة لبناء مكتبة الجينوم كله1،7. يمكن أن تتراوح كمية الحمض النووي بين 0.3-29.7 نانوغرام / ميكرولتر اعتمادا على حجم جسم البعوض وظروف الحفظ. ويرجع بعض التباين العالي إلى سمة الخرز المغناطيسي الم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن تكييف البروتوكول الموصوف هنا لأنواع الحشرات الأخرى. وقد تم اختبار النسخة الأصلية من البروتوكول الذي تم تقديمه في نيمان وآخرون1 على أنواع متعددة، بما في ذلك Aedes aegypti، Ae. busckii، Ae. taeniorhynchus، Anopheles arabiensis، An. coluzzii، An. coustani, An. دارلينجي, An. funestus, An. غامبي, An. quadriannulatus, An. rufipes, Culex pipiens, Cx. quinquefasciatus, CX. theileri, Drosophila سوزوكي, كريسوميلا aeneicollis توتا absoluta, وكيفيريا lycopersicella2

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نعترف بدعم التمويل من مركز جنوب غرب المحيط الهادئ الإقليمي للتميز للأمراض المنقولة بالنواقل الممول من المراكز الأمريكية لمكافحة الأمراض والوقاية منها (الاتفاقية التعاونية 1U01CK000516)، منحة CDC NU50CK000420-04-04، المعهد الوطني للأغذية والزراعة التابع لوزارة الزراعة الأميركية (مشروع هاتش 1025565)، وزمالة مختبر الحشرات الطبية في فلوريدا UF/IFAS إلى Tse-Yu Chen، ومنحة المرحلة الثانية من المرحلة الثانية من اتفاقية الأمن القومي CAMTech CAMTech (AWD05009_MOD0030)، ووزارة الصحة في فلوريدا (CONTRACT CODQJ). النتائج والاستنتاجات الواردة في هذه المقالة هي تلك التي المؤلف (ق) ولا تمثل بالضرورة وجهات نظر دائرة الأسماك والحياة البرية في الولايات المتحدة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
AE BufferQiagen19077Elution buffer
AL BufferQiagen19075Lysis
AW1 BufferQiagen19081Wash buffer 1
AW2 BufferQiagen19072Washing Buffer 2
MagAttract Suspension GQiagen1026901حبة مغناطيسية
حبة مغناطيسيةEpigentekQ10002-1
NanodropThermoFisherND-2000مقياس الطيف الضوئي الصغير
PK العازلةThermoFisher4489111Proteinase K العازلة
Proteinase KThermoFisherA25561
QubitInvitrogenQ33238مقياس الفلور
Buffer فاصل

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nieman, C. C., Yamasaki, Y., Collier, T. C., Lee, Y. A DNA extraction protocol for improved DNA yield from individual mosquitoes. F1000Research. 4, 1314(2015).
  2. Lee, Y., et al. Genome-wide divergence among invasive populations of Aedes aegypti in California. BMC Genomics. 20 (1), 204(2019).
  3. Schmidt, H., et al. Abundance of conserved CRISPR-Cas9 target sites within the highly polymorphic genomes of Anopheles and Aedes mosquitoes. Nature Communications. 11 (1), 1425(2020).
  4. Schmidt, H., et al. Transcontinental dispersal of Anopheles gambiae occurred from West African origin via serial founder events. Communications Biology. 2, 473(2019).
  5. Norris, L. C., et al. Adaptive introgression in an African malaria mosquito coincident with the increased usage of insecticide-treated bed nets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 815-820 (2015).
  6. Main, B. J., et al. The genetic basis of host preference and resting behavior in the major african malaria vector, Anopheles arabiensis. Plos Genetics. 12 (9), 1006303(2016).
  7. Yamasaki, Y. K., et al. Improved tools for genomic DNA library construction of small insects. F1000Research. 5, 211(2016).
  8. Tabuloc, C. A., et al. Sequencing of Tuta absoluta genome to develop SNP genotyping assays for species identification. Journal of Pest Science. 92, 1397-1407 (2019).
  9. Campos, M., et al. Complete mitogenome sequence of Anopheles coustani from São Tomé island. Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (3), 3376-3378 (2020).
  10. Cornel, A. J., et al. Complete mitogenome sequences of Aedes (Howardina) busckii and Aedes (Ochlerotatus) taeniorhynchus from the Caribbean Island of Saba. Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (2), 1163-1164 (2020).
  11. Lucena-Aguilar, G., et al. DNA source selection for downstream applications based on dna quality indicators analysis. Biopreservation and Biobanking. 14 (4), 264-270 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Aedes Aegypti DNA Proteinase K

مقالات ذات صلة