Method Article

تحليل تكوين الدهون من البكتيريا الفطرية من قبل طبقة رقيقة الكروماتوغرافيا

DOI:

10.3791/62368

⸱

April 16th, 2021

 ,  , 
1Departament de Genètica i de Microbiologia, Facultat de Biociències, Universitat Autònoma de Barcelona

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تقديم بروتوكول لاستخراج المحتوى الكلي للدهون من جدار الخلية من مجموعة واسعة من البكتيريا الفطرية. وعلاوة على ذلك، يتم عرض بروتوكولات استخراج وتحليل أنواع مختلفة من الأحماض الميكوليك. كما يتم توفير بروتوكول كروماتوغرافي طبقة رقيقة لرصد هذه المركبات البكتيرية mycobacterial.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن أن تختلف أنواع البكتيريا الفطرية عن بعضها البعض في معدل النمو ، ووجود التصبغ ، ومورفولوجيا المستعمرة المعروضة على الوسائط الصلبة ، بالإضافة إلى الخصائص الظاهرية الأخرى. ومع ذلك ، لديهم جميعا في الطابع المشترك الأكثر صلة من البكتيريا الفطرية : جدار الخلية فريدة من نوعها ومائية للغاية. تحتوي أنواع الميكوباكتيريا على مركب مرتبط بالغشاء التكافؤي يتضمن الأرابينوغالاكتان والببتيدوغليكان والسلاسل الطويلة من الأحماض الميكوليكية مع أنواع تختلف بين أنواع البكتيريا الفطرية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تنتج البكتيريا الفطرية أيضا الدهون الموجودة، غير المرتبطة بشكل مشترك، على أسطح خلاياها، مثل phthiocerol dimycocerosates (PDIM)، الجليكوليبيدات الفينولية (PGL)، glycopeptidolipids (GPL)، أسيلترهالوس (AT)، أو المانوسيدات فوسفاتيل-إينوزيتول (PIM)، من بين أمور أخرى. ويعتبر بعضها عوامل الفوعة في البكتيريا الفطرية المسببة للأمراض، أو الدهون المضادة للجينات الحرجة في التفاعل بين البكتيريا الفطرية المضيفة. لهذه الأسباب ، هناك اهتمام كبير في دراسة الدهون الفطرية بسبب تطبيقها في العديد من المجالات ، من فهم دورها في مسببات الأمراض في عدوى البكتيريا الفطرية ، إلى تأثير محتمل كعوامل مناعية لعلاج الأمراض المعدية وغيرها من الأمراض مثل السرطان. هنا ، يتم تقديم نهج بسيط لاستخراج وتحليل محتوى الدهون الكلي وتكوين حمض الميكوليك لخلايا البكتريا التي تزرع في وسط صلب باستخدام خليط من المذيبات العضوية. بمجرد الحصول على مستخلصات الدهون ، يتم إجراء الكروماتوغرافيا رقيقة الطبقة (TLC) لمراقبة المركبات المستخرجة. يتم إجراء تجربة المثال مع أربعة بكتيريا مختلفة: بروماي Mycolicibacterium البيئية سريعة النمو و Mycolicibacterium fortuitum ، و Mycobacterium bovis Calmillus-Guérin (BCG) ، ومسبب الأمراض الانتهازي سريع النمو Mycobacterium abscessus ، مما يدل على أن الأساليب الموضحة في البروتوكول الحالي يمكن استخدامها لمجموعة واسعة من البكتيريا الفطرية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mycobacterium هو جنس الذي يضم الأنواع المسببة للأمراض وغير المسببة للأمراض، تتميز وجود جدار الخلية مسعور للغاية وغير منفذة التي شكلتها الدهون غريبة. على وجه التحديد، جدار الخلية الفطرية يحتوي على الأحماض الميكوليكية، وهي α الألكيل والأحماض الدهنية β هيدروكسي، التي α فرع ثابت في جميع الأحماض الميكوليكية (باستثناء طول) وسلسلة β، ودعا سلسلة meromycolate، هي سلسلة طويلة اليفيتكي التي قد تحتوي على مجموعات كيميائية وظيفية مختلفة وصفها جنبا إلى جنب مع الأدب (α، α،، ميثوكسي، κ-، الايبوكسي،، كاربوكسي-، وω-1-ميثوكسي-ميكولات)، وبالتالي إنتاج سبعة أنواع من الأحماض الميكوليك (I-VII)1. وعلاوة على ذلك، الدهون الأخرى ذات أهمية لا يرقى إليها الشك موجودة أيضا في جدار الخلية من الأنواع المتفطرة. الأنواع المسببة للأمراض مثل Mycobacterium tuberculosis, العامل المسبب لمرض السل2 إنتاج عوامل محددة للفوعة القائمة على الدهون مثل ديميكوسيروسات phthiocerol (PDIMs)، الجليكوليبيد الفينولية (PGL)، دي، ثلاثي، وبينتا أسيلترهالوس (DAT، TAT، وبات)، أو sulfolipids، من بين أمور أخرى3. وقد ارتبط وجودها على سطح البكتيريا الفطرية مع القدرة على تعديل الاستجابة المناعية المضيف، وبالتالي، تطور واستمرار البكتيريا الفطرية داخل المضيف4. على سبيل المثال ، ارتبط وجود triacylglycerols (TAG) مع النمط الظاهري المفرط للفيروسات من النسب الفرعي 2 - بكين من M. tuberculosis, ربما بسبب قدرتها على توهين الاستجابة المناعية المضيف5,6. الدهون الأخرى ذات الصلة هي lipooligosaccharides (LOSs) موجودة في البكتيريا الفطرية السل وغير المسببة للركل. في حالة Mycobacterium marinum، يرتبط وجود LOSs في جدار الخلية الخاص به بحركية انزلاقية والقدرة على تشكيل الأغشية الحيوية ويتداخل مع التعرف عليه من قبل مستقبلات التعرف على نمط الضامة ، مما يؤثر على امتصاص والقضاء على البكتيريا عن طريق الخلايا الفواجية المضيفة7,8. بالإضافة إلى ذلك ، فإن غياب أو وجود بعض الدهون يسمح لأعضاء من نفس النوع بتصنيفهم إلى أنواع مورفوتية مختلفة مع ملامح خبيثة أو مخففة عند التفاعل مع الخلايا المضيفة. على سبيل المثال، غياب الجليكوبيدوليبيدات (GPL) في شكل مورفو نوع الخام من Mycobacterium abscessus وقد ارتبط مع القدرة على الحث على تحمض داخل الphagosomal، وبالتالي موت الخلايا المبرمج9، على عكس النمط المورفوتيب السلس الذي يمتلك ال جي بي ال في سطحه. وعلاوة على ذلك، يرتبط محتوى الدهون من جدار الخلية البكتيرية إلى القدرة على تعديل الاستجابة المناعية في المضيف. هذا هو ذات الصلة في سياق استخدام بعض البكتيريا الفطرية لتحريك ملف المناعة واقية ضد أمراض مختلفة10,11,12,13. وقد ثبت، على سبيل المثال، أن Mycolicibacterium vaccae، و mycobacterium saprophytic ، الذي هو حاليا في المرحلة الثالثة التجارب السريرية كلقاح العلاج المناعي لمرض السل ، وعرض اثنين من الأنواع المورفولوجية الاستعمارية. في حين أن النمط الظاهري السلس ، الذي يحتوي على البوليستر في سطحه ، يؤدي إلى استجابة Th2 ، فإن النمط الظاهري الخام الخالي من البوليستر يمكن أن يحفز ملف Th1 عندما يتفاعل مع الخلايا المناعية المضيفة14. ذخيرة من الدهون الموجودة في الخلية الفطرية لا يعتمد فقط على الأنواع المتفطرة، ولكن أيضا على ظروف الثقافات الفطرية: وقت الحضانة15,16 أو تكوين الوسط الثقافي17,18. في الواقع ، تؤثر التغيرات في التركيبة المتوسطة للثقافة على النشاط المضاد للمناعة والمناعة M. bovis BCG و Mycolicibacterium brumae in vitro17. وعلاوة على ذلك، فإن الشخصية المناعية الواقية الناجمة عن M. bovis BCG ضد M. tuberculosis التحدي في نماذج الفئران يعتمد أيضا على وسائل الإعلام الثقافية التي M. bovis BCG ينمو17. ويمكن بعد ذلك أن تكون هذه ذات صلة لتكوين الدهون من البكتيريا الفطرية في كل حالة الثقافة. لجميع هذه الأسباب ، فإن دراسة محتوى الدهون من البكتيريا الفطرية ذات الصلة. يتم تقديم إجراء بصري لاستخراج وتحليل تكوين الدهون من جدار الخلية البكتيرية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. استخراج مجموع الدهون غير المرتبطة بالتساهم من البكتيريا الفطرية (الشكل 1)

  1. خدش 0.2 غرام من البكتيريا الفطرية من وسائل الإعلام الصلبة وإضافة إلى أنبوب زجاجي مع قبعات بوليتيترافلورويثلين (PTFE) بطانة المسمار. إضافة محلول يتكون من 5 مل من الكلوروفورم و 10 مل من الميثانول (الكلوروفورم: الميثانول، 1:2).
    ملاحظة: عند استخدام المذيبات العضوية، يجب استخدام متلقي الزجاج فقط. لا يسمح بحاويات بلاستيكية. وعلاوة على ذلك، هناك حاجة إلى قبعات PTFE بطانة المسمار للزجاجات.
    تنبيه: الكلوروفورم مادة يحتمل أن تكون سامة وخطيرة للغاية. يجب استخدامه في غطاء تدفق صفح يرتدي معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر، والنظارات الواقية، وقفازات النتريل).
    تنبيه: الميثانول مادة قد تكون سامة وخطرة للغاية. يجب استخدامه في غطاء تدفق صفح يرتدي معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر، والنظارات الواقية، وقفازات النتريل).
  2. اترك الأنبوب في إثارة مستمرة بين عشية وضحاها لاستخراج الدهون غير المرتبطة بالتساهمية من سطح الخلية البكتيرية mycobacterial.
    ملاحظة: إذا لم تتوفر منصة اهتزاز مدارية، يمكن استبدال التحريك المستمر بالتحريك اليدوي الدوري قدر الإمكان.
  3. قم بتغطية قمع زجاجي بورق فلتر، وتصفية المذيبات العضوية، وجمعها في أنبوب زجاجي.
  4. استخدام تدفق غاز النيتروجين لتتبخر المرحلة السائلة في الأنبوب. ملء أنبوب مع غاز النيتروجين، وتغطي وتخزينه في 4 °C.
    ملاحظة: توصيل ماصة باستور الزجاج إلى تيار من غاز النيتروجين لتتبخر على وجه التحديد الأنبوب المطلوب. بالإضافة إلى ذلك، الحفاظ على أنبوب داخل سخان كتلة جافة للأنابيب في 37 درجة مئوية. عندما يتبخر المذيب، املأ الأنبوب بغاز النيتروجين قبل إغلاقه.
  5. إضافة 15 مل من محلول الكلوروفورم:الميثانول (2:1) إلى الحطام الخلوي. اترك الأنبوب في إثارة مستمرة بين عشية وضحاها لاستخراج الدهون غير المرتبطة بالتساهمية من سطح الخلية البكتيرية mycobacterial.
    ملاحظة: إذا لم تتوفر منصة اهتزاز مدارية، يمكن استبدال التحريك المستمر بالتحريك اليدوي الدوري قدر الإمكان.
  6. دع الخليط يستريح لمدة ساعة واحدة. مع ماصة باستور، واستعادة المذيبات العضوية. قم بتغطية قمع زجاجي بورق فلتر وتصفية المذيبات العضوية وجمعها في نفس الأنبوب الزجاجي المستخدم سابقا في الخطوة 1.3. استخدام تدفق غاز النيتروجين لتتبخر المرحلة السائلة في الأنبوب. ملء أنبوب مع غاز النيتروجين، وإغلاقه وتخزينه مرة أخرى في 4 °C.

2. استخراج حمض الميكوليك بواسطة الميثانول الحمضي (الشكل 2A)

  1. إضافة 2-5 مل من حل استيرifying في أنبوب زجاجي محكم مع غطاء المسمار بطانة PTFE. إضافة 0.2 غرام من الكتلة الحيوية mycobacteria في أنبوب زجاجي.
    ملاحظة: يتم تشكيل محلول استيرينغ عن طريق خلط 30 مل من الميثانول، و 15 مل من التولوين، و 1 مل من حمض الكبريتيك. يمكن أخذ خلايا البكتريا الفطرية من الثقافات الصلبة أو، حتى من الخلايا الهذيانية بعد إجراء استخراج إجمالي الدهون غير المرتبطة بالتساهمية من البكتيريا الفطرية (الخلايا المتبقية بعد التصفية في الخطوة 1.6).
    تنبيه: الولوين مادة قابلة للاشتعال وخطرة للغاية. يجب استخدامه في غطاء تدفق صفح يرتدي معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر، والنظارات الواقية، وقفازات النتريل).
    تنبيه: حمض الكبريتيك مادة مسببة للتآكل وخطرة. يجب استخدامه في غطاء تدفق صفح يرتدي معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر، والنظارات الواقية، وقفازات النتريل).
  2. امزج المحتوى عن طريق الدوامة. دع الخليط يقف داخل حمام جاف عند 80 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  3. السماح للأنبوب لتبرد حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة ومن ثم إضافة 2 مل من n-hexane إلى الأنبوب. امزج المحتويات عن طريق الدوامة لمدة 30 s واترك الأنبوب يستقر حتى تظهر مرحلتان واضحتان.
    تنبيه: n-hexane هو مادة قابلة للاشتعال ومهيجة ومدمرة بيئيا وخطيرة للغاية. يجب استخدامه في غطاء تدفق صفح يرتدي معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر، والنظارات الواقية، وقفازات النتريل).
  4. استعادة المرحلة العليا المقابلة لمرحلة n-hexane. نقلها إلى أنبوب جديد.
  5. كرر الخطوة 2.3. استعادة المرحلة العليا مرة أخرى ونقله إلى نفس الأنبوب المستخدمة في الخطوة 2.4.
  6. تتبخر محتويات الأنبوب باستخدام تدفق غاز النيتروجين. ملء أنبوب مع غاز النيتروجين، وإغلاقه، وتخزينه في 4 درجة مئوية.

3. استخراج حمض الميكوليك عن طريق النسغ والمثيلة (الشكل 2B)

  1. خدش 0.2 غرام من البكتيريا الفطرية من وسائل الإعلام الصلبة وإضافة إلى أنبوب زجاجي مع غطاء المسمار PTFE.
  2. أضف 2 مل من محلول الميثانول والبنزين (80:20) الذي يحتوي على هيدروكسيد البوتاسيوم بنسبة 5٪. خلط محتويات دوامة. سخني الخليط لمدة 3 ح عند 100 درجة مئوية.
    تنبيه: البنزين مادة قابلة للاشتعال ومسرطنة وخطرة. يجب استخدامه في غطاء تدفق صفح يرتدي معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر، والنظارات الواقية، وقفازات النتريل).
  3. السماح للأنبوب لتبرد لدرجة حرارة الغرفة. إضافة 20٪ حمض الكبريتيك لتحمض العينات لتحقيق درجة الحموضة = 1.
  4. إضافة 3 مل من الأثير ديثيل. مزيج بلطف محتويات دوامة.
  5. دع المرحلتين تتشكلان عن طريق التسوية. استعادة مرحلة الأثير ديثيل ونقل إلى أنبوب جديد. كرر خطوة الغسيل لما مجموعه ثلاث مرات.
  6. غسل استخراج الأثير diethyl مع 2 مل من الماء المقطر ونقل الجزء العلوي المقابلة الأثير diethyl إلى أنبوب جديد. كرر خطوة الغسيل لما مجموعه ثلاث مرات.
  7. إضافة 2 غرام من كبريتات الصوديوم اللامائية على استخراج الأثير diethyl لتجفيفه.
  8. تصفية التعليق. تبخر المحتوى باستخدام تدفق غاز النيتروجين.
  9. لتنفيذ خطوة الميثيل، حل 3 غرام من اليوريا N-نيتروسو-ن-ميثيل في محلول مبرد مسبقا شكلتها 45 مل من الأثير ديثيل و 9 مل من 40٪ KOH في الماء المقطر.
    تنبيه: N-نيتروسو-N-ميثيل يوريا مادة سامة، مهيجة، مسرطنة، وخطرة. يجب استخدامه في غطاء تدفق صفح يرتدي معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر، والنظارات الواقية، وقفازات النتريل).
  10. نقل supernatant (diazomethane) إلى قارورة جديدة تبريدها في الثلج التي تحتوي على حبيبات هيدروكسيد البوتاسيوم (حوالي 30 غرام).
    ملاحظة: إذا لم يتم استخدام الناسخة الفائقة على الفور، يمكن تخزينها عند -20 درجة مئوية بحد أقصى 1 ساعة.
    تنبيه: الكريات هيدروكسيد البوتاسيوم هي مادة مهيجة وتآكل. يجب استخدام هذه المواد في غطاء تدفق صفح يرتدي معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر، والنظارات الواقية، وقفازات النتريل).
    تحذير: ديازوميثان شديد السمية ويحتمل أن يكون متفجرا. يجب استخدامه في غطاء تدفق صفح مع زجاج الأمان ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر، والنظارات الواقية، وقفازات النتريل).
  11. إضافة 2 مل من محلول الأثير التي تحتوي على diazomethane, التي تم الحصول عليها في الخطوة 3.10, في استخراج الأثير ديثيل المجففة التي تحتوي على الأحماض الميكوليك, التي تم الحصول عليها في الخطوة 3.8. حضانة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  12. تبخر التعليق عند 40 درجة مئوية. ملء أنبوب مع غاز النيتروجين، وإغلاقه، وتخزين الدهون الميثيلية في 4 درجة مئوية.
    ملاحظة: تبخر الديازوميثان من محلول الأثير تحت غطاء تدفق صفح، حتى يفقد الأثير اللون الأصفر.

4. طبقة رقيقة الكروماتوغرافيا (TLC) تحليل

  1. تشبع غرفة TLC الزجاج. للقيام بذلك، قم بتغطية أحد جدران غرفة TLC بقطعة من ورق التصفية والسماح لها بالتواصل مع المرحلة المتنقلة المكونة من خليط المذيبات. ضع الحجم المتبقي للمذيب في الجزء السفلي من غرفة TLC.
    ملاحظة: يجب تغطية الجزء السفلي من غرفة TLC بما لا يقل عن 1 سم من مرحلة التنقل. وفي التجارب الحالية، استخدمت مراحل متنقلة مختلفة لتطوير مراكز TLCs. وتألفت من 85 مل من n-hexane بالإضافة إلى 15 مل من الأثير diethyl; 100 مل من ثنائي كلورو الميثان؛ 90 مل من الكلوروفورم و10 مل من الميثانول و1 مل من الماء؛ 30 مل من الكلوروفورم، بالإضافة إلى 8 مل من الميثانول، و1 مل من الماء؛ 60 مل من الكلوروفورم، بالإضافة إلى 35 مل من الميثانول، و8 مل من الماء؛ 95 مل كلوروفورم زائد 5 مل من الميثانول؛ و 90 مل من الأثير البترولي (60-80 درجة مئوية) بالإضافة إلى 10 مل من الأثير ديثيل.
    ملاحظة: في TLC ثنائي الأبعاد، استخدم n-hexane:acetone (95:5) في الاتجاه الأول ثلاث مرات، واستخدم تطورا واحدا مع toluene:acetone (97:3) في الاتجاه الثاني لتحليل تكوين حمض الميكوليك. لتحليل PIMs، استخدم الكلوروفورم:الميثانول:الماء (60:30:6) في الاتجاه الأول مرة واحدة، واستخدام الكلوروفورم:حمض الخليك: الميثانول: الماء (40:25:3:6) في الاتجاه الثاني. لتحليل PDIM وAG، استخدم الأثير البترولي (60-80 درجة مئوية): خلات الإيثيل (98:2) في الاتجاه الأول ثلاث مرات، واستخدم تطورا واحدا مع الأثير البترولي (60-80 درجة مئوية): الأسيتون (98:2) في الاتجاه الثاني.
    تنبيه: الأثير Diethyl هو مادة سامة وخطرة محتملة. يجب استخدامه في غطاء تدفق صفح يرتدي معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر، والنظارات الواقية، وقفازات النتريل).
    تنبيه: ثنائي كلورو الميثان مادة سامة وخطرة محتملة. يجب استخدامه في غطاء تدفق صفح يرتدي معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر، والنظارات الواقية، وقفازات النتريل).
    تنبيه: الأثير البترولي هو مادة قابلة للاشتعال وضارة بالبيئة وخطيرة للغاية. يجب استخدامه في غطاء تدفق صفح يرتدي معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر، والنظارات الواقية، وقفازات النتريل).
    تنبيه: حمض الخليك هو مادة قابلة للاشتعال والتآكل المحتملة. يجب استخدامه في غطاء تدفق صفح يرتدي معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر، والنظارات الواقية، وقفازات النتريل).
    تنبيه: خلات الإيثيل هي مادة قابلة للاشتعال وخطرة. يجب استخدامه في غطاء تدفق صفح يرتدي معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر، والنظارات الواقية، وقفازات النتريل).
    تنبيه: الأسيتون مادة قابلة للاشتعال وخطرة. يجب استخدامه في غطاء تدفق صفح يرتدي معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر، والنظارات الواقية، وقفازات النتريل).
  2. أغلق غرفة TLC لتشبعها لمدة 20 دقيقة على الأقل. وفي الوقت نفسه، حل الدهون الموجودة في أنبوب زجاجي في 0.2-1 مل من الكلوروفورم.
    ملاحظة: يمكن تعديل الحجم المستخدم لإذابة الدهون اعتمادا على التركيز المطلوب أو المتوقع للعينة.
  3. تطبيق 10 ميكرولتر من كل تعليق باستخدام أنبوب زجاجي الشعرية مباشرة على لوحة TLC والسماح للعينة الجافة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: يجب تطبيق عينات في الجزء السفلي من لوحة ترك 1 سم على كل جانب. يجب فصل العينات عن الأخرى لمدة 0.5 سم على الأقل. بمجرد تطبيق العينة على اللوحة ، يمكن تبخر الأنابيب مرة أخرى مع غاز النيتروجين وتخزينها عند 4 درجات مئوية لمزيد من الاستخدام.
  4. أدخل اللوحة في غرفة TLC المشبعة التي تحتوي على المرحلة المتنقلة. السماح لمرحلة المحمول لتشغيل من خلال TLC.
    ملاحظة: أي حركة تطبق على غرفة TLC يؤثر على المذيبات قيد التشغيل على لوحة ويؤثر على حركة الدهون. وفي حالة أداء TLC ثنائي الأبعاد، يلزم وجود غرفتين من غرف TLC لاحتواء نظامي elution.
  5. قم بإزالة اللوحة من غرفة TLC عندما يصل المذيب إلى مسافة 1 سم من الطرف العلوي من اللوحة. اترك الطبق تحت تدفق الصفيحة حتى يجف السيليكا تماما.
    ملاحظة: في حالة تحليل تكوين حمض الميكوليك، باستخدام n-hexane و diethyl-ether (85:15)، كرر الخطوتين 4.4 و 4.5 مرتين أكثر، حتى تشغيل المرحلة المتنقلة ثلاث مرات على لوحة TLC.
  6. كشف لوحة مع وصمة عار المطلوبة. سخني اللوحة إذا لزم الأمر.
    ملاحظة: في هذه التجربة، استخدمت 15-20 مل من الحلول التالية لرش لوحات TLC: 10٪ هيدرات حمض موليبداتوفوسفوريك في الإيثانول حتى تصبح اللوحة صفراء زاهية، تليها تسخين اللوحة عند 120 درجة مئوية. 5٪ في الإيثانول من 20٪ α-النفثول في حمض الكبريتيك تليها تسخين لوحة في 120 درجة مئوية. الموليبدينوم الأزرق الكاشف (1.3٪ أكسيد الموليبدينوم في 4.2 M حمض الكبريتيك) حتى ظهرت عصابات الفوسفات أو 1٪ من الأثرون في حمض الكبريتيك.
    تنبيه: هيدرات حمض موليبداتوفوسفوريك هي مادة قابلة للاشتعال والتآكل. يجب استخدامه في غطاء تدفق صفح يرتدي معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر، والنظارات الواقية، وقفازات النتريل).
    تنبيه: الإيثانول مادة قابلة للاشتعال وخطرة محتملة. يجب استخدامه في غطاء تدفق صفح يرتدي معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر، والنظارات الواقية، وقفازات النتريل).
    تنبيه: 1-نابثول مادة قابلة للاشتعال، تآكل، وخطرة للغاية. يجب استخدامه في غطاء تدفق صفح يرتدي معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر، والنظارات الواقية، وقفازات النتريل).
    تنبيه: موليبدنوم الأزرق رذاذ الكاشف هو مادة تآكل، سامة، وخطيرة للغاية. يجب استخدامه في غطاء تدفق صفح يرتدي معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر، والنظارات الواقية، وقفازات النتريل).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بهدف إظهار مجموعة واسعة من الدهون الموجودة في أنواع مختلفة من البكتيريا الفطرية ، تم اختيار M. bovis BCG لأنها بكتيريا صغيرة خشنة وبطيئة النمو. وأضيفت الخام وسريعة النمو M. الحصون و M. brumae في الإجراء، وأخيرا، تم تضمين مورفوتيب سلس من خراج م. أيضا. تسمح لنا هذه الأنواع الأربعة بتصور طيف واسع من الدهون المشتقة من الميككوباتريا مثل acyltrehaloses (AT) و GPLs و PDIM و PGL و PIM و TDM و TMM. وعلاوة على ذلك، فإن جميع الأنواع الأربعة لديها أنماط حمض الميكوليك المختلفة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تقديم بروتوكول بسيط يعتبر الطريقة القياسية الذهبية لاستخراج مركبات الدهون غير المرتبطة بشكل غير مكافئ من جدار الخلية البكتيرية mycobacterial. يظهر مزيد من التصور من قبل TLCs أحادية واثنين الأبعاد من الدهون المستخرجة من أربعة بكتيريا مختلفة.

خليطين متتاليين من الكلوروفورم والميثانول لاستعادة المحتوى الدهني للخلايا الميكوبكتيرية هو خليط المذيبات الأكثر استخداما على نطاق واسع23،24،25،

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل هذا البحث من قبل وزارة العلوم والابتكار والجامعات الإسبانية (RTI2018-098777-B-I00) وصناديق FEDER و Generalitat of Catalunya (2017SGR-229). ساندرا غوالار غاريدو حاصلة على عقد دكتوراه من جنرال كاتالونيا.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
حمض الخليكميرك100063الحذر. اللامائية للتحليل EMSURE® ACS ، ISO ، ريج. Ph Eur
الأسيتونكارلو إربا400971Nالحذر. ACETONE RPE-ACS-ISO لتحليلات مل 1000
AnthroneMerck8014610010Anthrone للتوليف.
البنزينكارلو إيربا426113الحذر. البنزين RPE - للتحليل - ACS 2.5 لتر
أنبوب زجاجي شعريMerckBR708709BRAND & reg ؛   BLAUBRAND & reg المتاح ؛   الماصات الدقيقة ، intraMark
ChloroformCarlo Erba412653الحذر. الكلوروفورم RS - ل HPLC - درجة متساوية - مستقرة مع الإيثانول 2.5 لتر
سخان الكتلة الجافةJP Selecta7471200
DicloromethaneCarlo Erba412622الحذر. ثنائي كلورو الميثان RS - ل HPLC - درجة متساوية - مستقرة مع أميلين 2.5 لتر
ثنائي إيثيل الأثيركارلو إربا412672الحذر. ثنائي إيثيل الأثير RS - ل HPLC - درجة متساوية - غير مستقر 2.5 لتر
أسيتات إيثيلبانريك1313181211الحذر. أسيتات الإيثيل (Reag. USP, Ph. Eur.) للتحليل ، ACS ، ISO
الكحول الإيثيلي المطلقكارلو إربا4146072الحذر. الإيثانول المطلق اللامائي RPE - للتحليل - ACS - Reag. دكتوراه - ريج. USP 1 لتر
قمع زجاجيVidraFOCDURA.2133148 1217/1
أنبوب زجاجيVidraFOCVFOC.45066A-16125أنبوب زجاجي مع غطاء استرداد PTFE
ميثانولكارلو إربا412722الحذر. ميثانول RS - ل HPLC - GOLD - درجة التدرج الفائق 2.5 لتر
حمض الموليبداتوفوسفوريك هيدراتMerck51429-74-4الحذر.
كاشف رذاذ الموليبدينوم الأزرق ، 1.3٪سيجماM1942-100MLالحذر.
n-hexaneCarlo Erba446903الحذر. n-Hexane 99٪ RS - ATRASOL - لتحليل الآثار 2.5 L
n-nitroso-n-methylureaSigmaN4766CAUTION
منصة اهتزاز مداريةDDBiolab995018NB-205L حاضنة اهتزاز منضدة
الأثير البترولي (60-80 & ordm; ج)كارلو إربا427003الحذر. الأثير البترولي 60 - 80 درجة ؛ C RPE - للتحليل 2.5 لتر
بخاخVidraFOC712/1
كبريتات الصوديوم اللامائيةميرك238597
حمض الكبريتيك 95-97٪ميرك1007311000الحذر. حامض الكبريتيك 95-97٪
غرفة TLCMerckZ204226-1EAخزانات تطوير TLC مستطيلة ، L & Times كاملة ؛ ح & مقات; العرض 22 سم وأوقات; 22 سم وأمر;
10 سم لوحة TLCMerck1057210001TLC SilicaGel 60- 20x20 سم × 25 u
TLC سخان لوحةCAMAG223306CAMAG TLC Plat Heater III
TolueneCarlo Erba488551CAUTION. التولوين RPE - للتحليل - ISO - ACS - Reag.Ph.Eur. - Reag.USP 1 لتر
دوامةفيشر 10132562 IKA& nbsp ؛ Agitador IKA vó rtex 3
1-naphtholSigma-Aldrich102269427الحذر.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Watanabe, M., et al. Location of functional groups in mycobacterial meromycolate chains; the recognition of new structural principles in mycolic acids. Microbiology. 148 (6), 1881-1902 (2002).
  2. Global Health Organization World Health Organization. (2018) Global tuberculosis report. WHO. , (2019).
  3. Jackson, M. The Mycobacterial cell envelope-lipids. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), 1-36 (2014).
  4. Jankute, M., et al. The role of hydrophobicity in tuberculosis evolution and pathogenicity. Scientific Reports. 7 (1), 1315(2017).
  5. Reed, M. B., Gagneux, S., DeRiemer, K., Small, P. M., Barry, C. E. The W-Beijing lineage of Mycobacterium tuberculosis overproduces triglycerides and has the DosR dormancy regulon constitutively upregulated. Journal of Bacteriology. 189 (7), 2583-2589 (2007).
  6. Ly, A., Liu, J. Mycobacterial virulence factors: Surface-exposed lipids and secreted proteins. International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 3985(2020).
  7. Szulc-Kielbik, I., et al. Severe inhibition of lipooligosaccharide synthesis induces TLR2-dependent elimination of Mycobacterium marinum from THP1-derived macrophages. Microbial Cell Factories. 16 (1), 217(2017).
  8. Ren, H., et al. Identification of the lipooligosaccharide biosynthetic gene cluster from Mycobacterium marinum. Molecular Microbiology. 63 (5), 1345-1359 (2007).
  9. Roux, A. L., et al. The distinct fate of smooth and rough Mycobacterium abscessus variants inside macrophages. Open Biology. 6 (11), 160185(2016).
  10. Guallar-Garrido, S., Julián, E. Bacillus Calmette-Guérin (BCG) therapy for bladder cancer: An update. ImmunoTargets and Therapy. 9, 1-11 (2020).
  11. Bach-Griera, M., et al. Mycolicibacterium brumae is a safe and non-toxic immunomodulatory agent for cancer treatment. Vaccines. 8 (2), 2-17 (2020).
  12. Noguera-Ortega, E., et al. Nonpathogenic Mycobacterium brumae inhibits bladder cancer growth in vitro, ex vivo, and in vivo. European Urology Focus. 2 (1), 67-76 (2015).
  13. Noguera-Ortega, E., et al. Mycobacteria emulsified in olive oil-in-water trigger a robust immune response in bladder cancer treatment. Scientific Reports. 6, 27232(2016).
  14. Rodríguez-Güell, E., et al. The production of a new extracellular putative long-chain saturated polyester by smooth variants of Mycobacterium vaccae interferes with Th1-cytokine production. Antonie van Leeuwenhoek. 90, 93-108 (2006).
  15. Garcia-Vilanova, A., Chan, J., Torrelles, J. B. Underestimated manipulative roles of Mycobacterium tuberculosis cell envelope glycolipids during infection. Frontiers in Immunology. 10, (2019).
  16. Yang, L., et al. Changes in the major cell envelope components of Mycobacterium tuberculosis during in vitro growth. Glycobiology. 23 (8), 926-934 (2013).
  17. Guallar-Garrido, S., Campo-Pérez, V., Sánchez-Chardi, A., Luquin, M., Julián, E. Each mycobacterium requires a specific culture medium composition for triggering an optimized immunomodulatory and antitumoral effect. Microorganisms. 8 (5), 734(2020).
  18. Venkataswamy, M. M., et al. et al. In vitro culture medium influences the vaccine efficacy of Mycobacterium bovis BCG. Vaccine. 30 (6), 1038-1049 (2012).
  19. Secanella-Fandos, S., Luquin, M., Pérez-Trujillo, M., Julián, E. Revisited mycolic acid pattern of Mycobacterium confluentis using thin-layer chromatography. Journal of Chromatography B. 879, 2821-2826 (2011).
  20. Minnikin, D. E., et al. Analysis of mycobacteria mycolic acids. Topics in Lipid Research: From Structural Elucidation to Biological Function. , CPC Press. London, UK. 139-143 (1986).
  21. Minnikin, D. E., Hutchinson, I. G., Caldicott, A. B., Goodfellow, M. Thin-layer chromatography of methanolysates of mycolic acid-containing bacteria. Journal of Chromatography A. 188 (1), 221-233 (1980).
  22. Minnikin, D. E., Goodfellow, M. Lipid composition in the classification and identification of acid-fast bacteria. Society for Applied Bacteriology Symposium Series. 8, 189-256 (1980).
  23. Muñoz, M., et al. Occurrence of an antigenic triacyl trehalose in clinical isolates and reference strains of Mycobacterium tuberculosis. FEMS Microbiology Letters. 157 (2), 251-259 (1997).
  24. Daffé, M., Lacave, C., Lanéelle, M. A., Gillois, M., Lanéelle, G. Polyphthienoyl trehalose, glycolipids specific for virulent strains of the tubercle bacillus. European Journal of Biochemistry. 172 (3), 579-584 (1988).
  25. Singh, P., et al. Revisiting a protocol for extraction of mycobacterial lipids. International Journal of Mycobacteriology. 3 (3), 168-172 (2014).
  26. Camacho, L. R., et al. Analysis of the phthiocerol dimycocerosate locus of Mycobacterium tuberculosis. Evidence that this lipid is involved in the cell wall permeability barrier. Journal of Biological Chemistry. 276 (23), 19845-19854 (2001).
  27. Dhariwal, K. R., Chander, A., Venkitasubramanian, T. A. Alterations in lipid constituents during growth of Mycobacterium smegmatis CDC 46 and Mycobacterium phlei ATCC 354. Microbios. 16 (65-66), 169-182 (1976).
  28. Chandramouli, V., Venkitasubramanian, T. A. Effect of age on the lipids of mycobacteria. Indian Journal of Chest Diseases & Allied Sciences. 16, 199-207 (1982).
  29. Hameed, S., Sharma, S., Fatima, Z. Techniques to understand mycobacterial lipids and use of lipid-based nanoformulations for tuberculosis management. NanoBioMedicine. , Springer. Singapore. (2020).
  30. Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
  31. Pal, R., Hameed, S., Kumar, P., Singh, S., Fatima, Z. Comparative lipidome profile of sensitive and resistant Mycobacterium tuberculosis strain. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 1 (1), 189-197 (2015).
  32. Slayden, R. A., Barry, C. E. Analysis of the lipids of Mycobacterium tuberculosis. Mycobacterium tuberculosis Protocols. 54, 229-245 (2001).
  33. Ojha, A. K., et al. Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria. Molecular Microbiology. 69 (1), 164-174 (2008).
  34. Ojha, A. K., Trivelli, X., Guerardel, Y., Kremer, L., Hatfull, G. F. Enzymatic hydrolysis of trehalose dimycolate releases free mycolic acids during mycobacterial growth in biofilms. The Journal of Biological Chemistry. 285 (23), 17380-17389 (2010).
  35. Layre, E., et al. Mycolic acids constitute a scaffold for mycobacterial lipid antigens stimulating CD1-restricted T cells. Chemistry and Biology. 16 (1), 82-92 (2009).
  36. Llorens-Fons, M., et al. Trehalose polyphleates, external cell wall lipids in Mycobacterium abscessus, are associated with the formation of clumps with cording morphology, which have been associated with virulence. Frontiers in Microbiology. 8, (2017).
  37. Butler, W. R., Guthertz, L. S. Mycolic acid analysis by high-performance liquid chromatography for identification of mycobacterium species. Clinical Microbiology Reviews. 14 (4), 704-726 (2001).
  38. Teramoto, K., et al. Characterization of mycolic acids in total fatty acid methyl ester fractions from Mycobacterium species by high resolution MALDI-TOFMS. Mass Spectrometry. 4 (1), 0035(2015).
  39. Sartain, M. J., Dick, D. L., Rithner, C. D., Crick, D. C., Belisle, J. T. Lipidomic analyses of Mycobacterium tuberculosis based on accurate mass measurements and the novel "Mtb LipidDB". Journal of Lipid Research. 52 (5), 861-872 (2011).
  40. Li, M., Zhou, Z., Nie, H., Bai, Y., Liu, H. Recent advances of chromatography and mass spectrometry in lipidomics. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 399 (1), 243-249 (2011).
  41. Nahar, A., Baker, A. L., Nichols, D. S., Bowman, J. P., Britz, M. L. Application of Thin-Layer Chromatography-Flame Ionization Detection (TLC-FID) to total lipid quantitation in mycolic-acid synthesizing Rhodococcus and Williamsia species. International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1670(2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mycobacteria LipidsLipid ExtractionThin Layer ChromatographyMycolic Acid AnalysisMycobacterial Cell WallOrganic Solvent ExtractionOne Dimensional TLCTwo Dimensional TLCPhenolic GlycolipidsGlycopeptidolipids

Related Articles