التحليل الكمي لديناميكيات حافة الخلية أثناء انتشار الخلايا

Ernest Iu; Alexander Bogatch; Sergey  V. Plotnikov

doi:10.3791/62369

مقالة منهجية

التحليل الكمي لديناميكيات حافة الخلية أثناء انتشار الخلايا

DOI:

10.3791/62369

⸱

مايو 22, 2021

Ernest Iu^*¹ , Alexander Bogatch^*¹ , Sergey V. Plotnikov¹

¹Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto

^* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا البروتوكول، نقدم الإجراءات التجريبية للخلية التي تنشر المقايسة التي تقوم على المجهر الحي الخلية. نحن نقدم أداة حسابية مفتوحة المصدر للتجزئة غير المتحيزة للخلايا المسماة بالفلورسنت والتحليل الكمي لديناميكيات اللاميلبوديا أثناء انتشار الخلايا.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

انتشار الخلية هو عملية ديناميكية تعلق فيها الخلية المعلقة في الوسائط على الركيزة وتسطيح نفسها من شكل مدور إلى شكل رقيق ومنتشر. بعد مرفق ركيزة الخلية، تشكل الخلية ورقة رقيقة من اللاميليبوديا المنبثقة من جسم الخلية. في اللاميلبوديا ، يبوليمر أكتين كروي (G-actin) إلى شبكة أكتين خيوط كثيفة (F-actin) تدفع ضد غشاء البلازما ، وبالتالي توفير القوى الميكانيكية اللازمة للخلية للانتشار. وتجدر الإشارة إلى أن اللاعبين الجزيئيين الذين يتحكمون في بلمرة أكتين في اللاميلبوديا ضروريون للعديد من العمليات الخلوية الأخرى ، مثل هجرة الخلايا وداء الغدد الصماء.

منذ انتشار الخلايا تشكل lamellipodia المستمر التي تمتد على محيط الخلية بأكملها والتوسع باستمرار إلى الخارج، أصبحت المقايسات انتشار الخلايا أداة فعالة لتقييم حركية نتوءات اللاميليبوديال. وعلى الرغم من وضع عدة تطبيقات تقنية للتشتيت الذي ينشر الخلية، فإن هناك نقصا في وصف مفصل لسير العمل، الذي سيشمل بروتوكولا تدريجيا وأدوات حسابية لتحليل البيانات. هنا، نقوم بوصف الإجراءات التجريبية للخلية التي تنشر المقايسة وتقديم أداة مفتوحة المصدر للتحليل الكمي وغير المتحيز لديناميكيات حافة الخلية أثناء الانتشار. عندما يقترن التلاعب الدوائي و / أو تقنيات إسكات الجينات ، وهذا البروتوكول قابلة لشاشة واسعة النطاق من اللاعبين الجزيئية التي تنظم نتوءات lamellipodial.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نتوءات لاميليبوديال هي هياكل هيكلية خلوية بارزة تشكلت في الجزء الأمامي من الخلية المهاجرة. في lamellipodia، البلمرة من أكتين بمساعدة مجمع Arp2/3 وفورمين يخلق شبكة أكتين المتفرعة سريعة النمو التي تدفع ضد غشاء البلازما¹^،². دفع القوة التي ولدتها شبكة actin يدفع جسديا الخلية إلى الأمام¹^،³^،⁴^،⁵. استنفاد Arp2/3 معقدة أو تعطيل مسارات الإشارات الضرورية لproprorusions lamellipodial غالبا ما يضعف هجرة الخلايا⁶^، ⁷. على^....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. البذر الخلية

ملاحظة: تم تنفيذ بروتوكول نشر الخلية الموصوف باستخدام الخلايا الليفية الجنينية الماوس (MEFs) التعبير PH-Akt-GFP (علامة الفلورسنت لبرنامج تطبيق السلام₃/PI(3,4)P₂). تم إنشاء خط الخلية هذا عن طريق دمج بناء تعبير عن PH-Akt-GFP (أدجين #21218) من خلال تحرير الجينات بوساطة CRISPR. ومع ذلك، يمكن أيضا استخدام علامات الفلورسنت الأخرى التي يتم التعبير عنها بشكل عابر أو متكاملة في الجينوم في هذا المقايسة. للحصول على تجزئة الصورة المثلى، نوصي باستخدام علامات الفلورسنت التي يتم توزيعها بالتساوي في السيتوبلازم، على سبيل المثال، GFP السيتوسوليك.

ثقافة طبق 10 سم من الخلايا إلى التقاء 90٪.
بم....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف البروتوكول أعلاه الإجراءات التجريبية لتصوير الخلايا الحية للخلايا المنتشرة وأداة حسابية للتحليل الكمي لديناميكيات انتشار الخلايا. يمكن استخدام الأداة الحاسوبية في شكل منخفض أو عالي الإنتاجية لتحديد اللاعبين الجزيئيين الذين ينظمون آلات البلمرة actin على الحافة الرائدة للخلية.

يصور الشكل 1التمثيل التخطيطي للإجراءات التجريبية. تم إجراء فحص انتشار الخلية على الخلايا الليفية الجنين الماوس الخالدة التعبير بشكل ثابت عن مجال التماثل البشري pleckstrin (PH) من كيناز برو.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يسمح المقايسة المنتشرة للخلية الموصوفة بالتتبع المستمر للتغيرات المورفولوجية(على سبيل المثال ، حجم الخلية وشكلها) وحركات حافة الخلية(أي سرعة النتوء وتردد التراجع) ، وهي ميزات مفقودة في معظم بروتوكولات انتشار الخلايا¹⁹^،²⁴. في حين أن شائعة الاستخدام خلية نقطة النهاية نشر المقايسات تسمح لتحديد سرعة انتشار الخلية، تفشل هذه المقايسات لحل الديناميات الزمنية لحركات حافة الخلية. نقص المعلومات الزمنية يحد من القدرة على الكشف عن التغيرات في دورات النتوءات.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من خلال جائزة المحقق الجديد لصندوق كونوت ل S.P. ، المؤسسة الكندية للابتكار ، برنامج منح اكتشاف NSERC (المنح RGPIN-2015-05114 و RGPIN-2020-05881) ، صندوق الأبحاث المشتركة لجامعة مانشستر وجامعة تورنتو ، وبرنامج جامعة تورونتو XSeed.

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
0.05٪ تريبسين (0.05٪) ، 0.53 ملي مولار EDTA	Wisent Bioproducts	325-042-CL
10.0 سم طبق بتري ، بوليسترين ، معالج TC ، تنفيس	Starstedt	83.3902
15 مل أنبوب طرد مركزي PP عالي الوضوح ، قاع مخروطي ، مع غطاء لولبي مانع للتسرب ،	صقر	معقم 352097
1-بئر Chamlide CMS ل 22 مم × 22 مم Coverslip	Quorum Technologies	CM-S22-1
35 مم معالج TC سهل الإمساك بنمط ثقافة	الخلية Falcon	353001
أنبوب طرد مركزي 50 مل ، شفاف ، عش ختم التوصيل		602002
أطباق ثقافة الخلايا 6.0 سم معالجة لزيادة ارتباط الخلايا ،	معقم VWR	10861-658
Arp2 / 3 I ، كاميرا 182515			Millipore Sigma
، Prime 95B-25MM	القياسات
ثنائي ميثيل سلفوكسيد ، BioShop معقم		DMS666
DMEM ، 1x ، 4.5 جم / لتر جلوكوز ، مع L-Glutamine و Sodium Pyruvate و Phenol Red	Wisent Bioproducts	319-005 CL
DMEM / F-12 ، HEPES ، بدون فينول ريد	جيبكو	11039021
D-PBS ، 1X	Wisent Bioproducts	311-425 CL
مصل الأبقار الجنيني	Wisent Bioproducts	080-110
Fiji Software	ImageJ
HEPES (1 M)	Gibco	15630080
البلازما البشرية فيبرونيكتين منقى البروتين 1 مجم	Millipore Sigma	FC010
زيت الغمر	Cargille	16241
محلول L-Glutamine (200 ملم)	Wisent Bioproducts	609-065-EL
MEM محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية (100X)	Gibco	11140050
ذات غطاء صغير ، مربعة ، رقم 11/2 22 × 22 مم	VWR	CA48366-227-1
جسم مجهر ، Eclipse Ti2-E	نيكون
الهدف ، CFI Plan Apo Lambda 60X زيت	نيكون	MRD01605
البنسلين الستربتومايسين	سيجما	P4333
قرص الغزل ، Crest Light V2	CrestOptics
Spyder	Anaconda
Stage Top incubator	Tokai Hit
Statistics Software ،	Prism GraphPad
، علوم	المجهر	78326-42

مثبط مركب CK-666 الضوئيةأكواب ملاقط الإلكتروني 2

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mullins, R. D., Heuser, J. A., Pollard, T. D. The interaction of Arp2/3 complex with actin: Nucleation, high affinity pointed end capping, and formation of branching networks of filaments. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (11), 6181-6186 (1998).
Yang, C., Czech, L., Gerboth, S., Kojima, S., Scita, G., Svitkina, T.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Arp2 3

التحليل الكمي لديناميكيات حافة الخلية أثناء انتشار الخلايا

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة