تحليل استجابات الخلايا التائية CD4 الخاصة ب HBV وتحديد HLA-DR-CD4 المقيدة CD4 T-Cell Epitopes استنادا إلى مصفوفة الببتيد

Jianmei Xiao; Xing Wan; Haoliang Wang; Guohong Deng

doi:10.3791/62387

مقالة منهجية

تحليل استجابات الخلايا التائية CD4 الخاصة ب HBV وتحديد HLA-DR-CD4 المقيدة CD4 T-Cell Epitopes استنادا إلى مصفوفة الببتيد

DOI:

10.3791/62387

⸱

أكتوبر 20, 2021

Jianmei Xiao¹^,² , Xing Wan¹^,² , Haoliang Wang¹^,² , Guohong Deng¹^,²

¹Department of Infectious Diseases, Southwest Hospital, Third Military Medical University (Army Medial University), ²Chongqing Key Laboratory for Research of Infectious Diseases

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

واستنادا إلى مصفوفة الببتيد المشتقة من فيروس التهاب الكبد B، يمكن تقييم استجابات الخلايا التائية CD4 الخاصة بفيروس التهاب الكبد B بالتوازي مع تحديد الخلايا التائية CD4 الخاصة بفيروس التهاب الكبد B.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تلعب خلايا CD4 T أدوارا مهمة في مسببات الأمراض لالتهاب الكبد B المزمن. كمحتوى خلايا متعددة الاستخدامات، تم تصنيف خلايا CD4 T كفئات فرعية وظيفية متميزة استنادا إلى السيتوكينات التي يفرزونها: على سبيل المثال، IFN-γ لخلايا المساعد CD4 T 1، IL-4 و IL-13 لخلايا المساعد CD4 T 2، وIL-21 لخلايا المساعد الجريبي CD4 T، وIL-17 لخلايا المساعد CD4 T. تحليل فيروس التهاب الكبد B (HBV) محددة CD4 الخلايا التائية على أساس إفراز السيتوكين بعد تحفيز الببتيدات المشتقة من HBV يمكن أن توفر معلومات ليس فقط حول حجم HBV محددة CD4 استجابة الخلايا التائية ولكن أيضا حول المجموعات الفرعية الوظيفية من خلايا CD4 T الخاصة HBV. ويمكن للنهج الجديدة، مثل علم النسخ وتحليل علم الأيض، أن توفر معلومات وظيفية أكثر تفصيلا عن خلايا CD4 T الخاصة ب HBV. تتطلب هذه النهج عادة عزل خلايا CD4 T الخاصة ب HBV القابلة للتطبيق استنادا إلى متعددات الخلايا التائية المعقدة II ذات الهستيد الرئيسية بالببتيد ، في حين أن المعلومات حول epitopes CD4 T-cell الخاصة ب HBV محدودة حاليا. استنادا إلى مصفوفة الببتيد المشتقة من HBV ، تم تطوير طريقة لتقييم استجابات الخلايا التائية CD4 الخاصة ب HBV وتحديد الخلايا التائية CD4 الخاصة ب HBV في وقت واحد باستخدام عينات خلايا الدم الأحادية الطرفية من مرضى عدوى HBV المزمنة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حاليا، هناك 3 النهج الرئيسية لتحليل الخلايا التائية المستضد محددة. ويستند النهج الأول على التفاعل بين مستقبلات الخلايا التائية والببتيد (epitope). يمكن أن تكون الخلايا التائية الخاصة بالمضاد ملطخة مباشرة بمتعددات مجمع توافق الهستوباتية الرئيسية للببتيد (MHC). ميزة هذه الطريقة هي أنه يمكن الحصول على خلايا T مستضد محددة قابلة للحياة، ومناسبة لتحليل النسخ المصب / المستقلب. أحد قيود هذه الطريقة هو أنه لا يمكن أن يوفر معلومات حول استجابة الخلايا التائية الكاملة لمستضد معين ، لأنه يتطلب ببتيدات الظهارة المعتمدة في حين أن عدد الأسطح المحددة لمستضد معين محدود في الوقت الحالي. بالمقارنة مع فيروس التهاب الكبد B (HBV) محددة CD8 تي الخلية epitopes, وقد تم تحديد أقل HBV محددة CD4 تي الخلية epitopes¹^,², مما جعل هذه الطريقة أقل قابلية للتطبيق لتحليل خلايا CD4 T الخاصة HBV حاليا.

ويستند النهج الثاني على upregulation من سلسلة من علامات التنشيط الناجمة بعد تحفيز الببتيد مستضد³. وتشمل العلامات الشائعة الاستخدام CD69، CD25، OX40، CD40L، PD-L1، 4-1BB⁴. وقد استخدمت هذه الطريقة الآن لتحليل استجابات الخلايا التائية الخاصة بالمضاد في الأفراد الملقحين⁵^،6 ،^مرضىعدوى فيروس نقص المناعة البشرية⁷، وفيروس كورونافيروس الالتهاب الرئوي الحاد الوخيم 2 مرضى^{العدوى 8}^،⁹. على عكس المقايسة المستندة إلى الببتيد-MHC ، لا يتم تقييد هذه الطريقة عن طريق epitopes المعتمدة ويمكن الحصول على خلايا قابلة للحياة لتحليل المصب. وهناك قيود على هذا الأسلوب هو أنه لا يمكن توفير معلومات حول ملف تعريف السيتوكين من الخلايا التائية الخاصة مستضد. أيضا، التعبير عن هذه العلامات الناجمة عن التنشيط من قبل بعض الخلايا المنشطة مستضد غير محددة قد تسهم في إشارات الخلفية في التحليل، والتي يمكن أن تكون مشكلة خاصة عندما تكون الخلايا التائية المستهدفة مستضد محددة نادرة. حاليا، هناك تطبيق محدود من هذا الأسلوب على خلايا CD4 T CD4 الخاصة HBV⁴. ما إذا كان يمكن استخدام هذه الطريقة لتحليل خلايا CD4 T الخاصة ب HBV بطريقة موثوقة تحتاج إلى مزيد من التحقيق.

ويستند النهج الثالث على إفراز السيتوكين بعد تحفيز الببتيد مستضد. مثل التحليل القائم على علامة التنشيط الناجمة، لا يتم تقييد هذه الطريقة من قبل epitopes التحقق من صحتها. يمكن أن تكشف هذه الطريقة مباشرة عن ملف تعريف السيتوكين للخلايا التائية الخاصة بالمضاد. حساسية هذه الطريقة أقل من الطريقة القائمة على علامة التنشيط الناجمة لأنها تعتمد على إفراز السيتوكين من الخلايا التائية الخاصة بالمضاد وعدد السيتوكينات التي تم اختبارها عادة ما تكون محدودة. حاليا، يتم استخدام هذه الطريقة على نطاق واسع في تحليل الخلايا التائية الخاصة بفيروس التهاب الكبد B. كما السيتوكين إفراز خلايا T HBV محددة لا يكاد يمكن الكشف عنها عن طريق التحفيز المباشر الببتيد السابق فيفو¹⁰^,¹¹, يتم تحليل ملامح السيتوكين من الخلايا التائية HBV محددة عادة بعد 10 يوما في الببتيد المختبر حفز التوسع¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶. وقد استخدم ترتيب برك الببتيد في شكل مصفوفة لتسهيل تحديد epitopes مستضد محددة¹⁷^،¹⁸. مع الجمع بين مصفوفة الببتيد وتحليل إفراز السيتوكين، تم تطوير طريقة لتقييم استجابات الخلايا التائية CD4 الخاصة ب HBV وتحديد الخلايا التائية CD4 الخاصة ب HBV في وقت واحد¹⁶. في هذا البروتوكول، يتم وصف تفاصيل هذا الأسلوب. يتم اختيار مستضد HBV الأساسية كمثال على مظاهرة في هذا البروتوكول.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من كل مريض مدرج في الدراسة. يتوافق بروتوكول الدراسة مع المبادئ التوجيهية الأخلاقية لإعلان هلسنكي لعام 1975 كما هو مبين في موافقة مسبقة من لجنة الأخلاقيات الطبية في مستشفى ساوث ويست.

1. تصميم مصفوفة الببتيد المشتقة من HBV

تحميل تسلسل الأحماض الأمينية من مستضد HBV الأساسية من قواعد بيانات NCBI (جينبانك: AFY98989.1).
شراء مستضد HBV الأساسية المستمدة الببتيدات (لوحة من 35 15 مير الببتيدات متداخلة من قبل 10 بقايا, نقاء > 90٪, 4 ملغ/الببتيد) من مزود خدمة توليف الببتيد.
إعداد مصفوفة الببتيد مربع 6×6 مع كل موقف في المصفوفة التي تحتوي على الببتيد 1 فقط. هناك 12 برك الببتيد: 6 برك الببتيد الصف و 6 برك الببتيد العمود، 5-6 الببتيدات في كل بركة¹⁶. تمثل برك الببتيد الصف وبرك الببتيد العمود في المصفوفة تشكيلين منفصلين من مستضد HBV الأساسي.
ل3/4 من الببتيدات المشتراة، مزيج الببتيدات في نفس الصف / العمود من المصفوفة في 12 برك الببتيد منفصلة عن طريق حلها معا في كبريتيد ثنائي ميثيل (DMSO) (2 ميكروغرام / ميكرولتر لكل الببتيد). تخزين في -80 درجة مئوية لتحليل استجابات الخلايا التائية CD4 الخاصة ب HBV.
حل بقية الببتيدات بشكل منفصل (10 ميكروغرام / ميكرولتر) وتخزينها في -80 درجة مئوية لتحديد epitope.

2. عزل خلايا الدم المحيطي أحادية النوى (PBMCs)

عينة 5 مل من الدم الوريدي من مرضى عدوى فيروس التهاب الكبد B المزمن.
ملاحظة: ينبغي تقدير حجم الدم تقريبا وفقا لعدد من برك الببتيد بالإضافة إلى 1 التحكم الخلفية و 1 السيطرة الإيجابية. تحليل 1 تجمع الببتيد يحتاج 3 × 10⁵ PBMCs. في المتوسط، يمكن الحصول على 1 ×^{10 6} PBMCs من 1 مل من الدم.
عزل PBMCs من الدم باستخدام الطرد المركزي التدرج كثافة Ficoll (800 × غرام، 20 دقيقة) والتبريد PBMCs معزولة في النيتروجين السائل لاستخدامها في وقت لاحق.
استخدام ماصة باستور لجمع المحببات بين طبقة فيكول واضحة وطبقة خلايا الدم الحمراء. استخراج الحمض النووي الجينومي من الخلايا الحبيبية باستخدام عدة تنقية الحمض النووي الجينومي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
أرسل عينة الحمض النووي إلى مقدمي خدمات الكتابة الجينية لتحديد النمط الجيني HLA-DRB1.

3. في المختبر توسيع PBMCs باستخدام مصفوفة الببتيد HBV

تذوب PBMCs.
1. دافئ RPMI 1640 تكملها مع 1:10,000 البنزوناز (25 U/mL) إلى 37 °C في حمام مائي.
  ملاحظة: يساعد البنزوناز على الحد من تكتل الخلايا أثناء ذوبان الجليد. كل عينة سوف تتطلب 20 مل من RPMI 1640 مع البنزوناز. حساب المبلغ اللازم لإذابة جميع العينات، وإعداد aliquot منفصلة من وسائل الإعلام (37 درجة مئوية) مع 1:10،000 بنزوناسي (25 U/mL). لا تذوب أكثر من 5 عينات في وقت واحد.
2. إزالة عينات من النيتروجين السائل وتذوب بسرعة قوارير المجمدة في حمام مائي (37 درجة مئوية).
3. نقل تعليق الخلية المذاب إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل. إضافة 1 مل من بنزوناسي RPMI 1640 (37 درجة مئوية) دروبية إلى الأنبوب. أضف ببطء 6 مل من بنزوناسي RPMI 1640 (37 درجة مئوية) إلى أنبوب الطرد المركزي ، شطف cryovial مع آخر 2 مل من بنزوناسي RPMI 1640 (37 درجة مئوية) لاسترداد جميع الخلايا. تابع باقي العينات في أسرع وقت ممكن.
  ملاحظة: التخفيف البطيء للعينات المبردة هو المفتاح للحفاظ على صلاحية الخلايا المذابة.
4. الطرد المركزي (400 × غرام، 10 دقيقة)، وإزالة supernatant، وتخفيف بيليه عن طريق النقر على الأنبوب.
5. إعادة إنفاق بيليه بلطف في 1 مل من البنزينزونا الدافئة RPMI 1640. اخلط الخلايا برفق، وتصفية الخلايا من خلال مصفاة خلايا 70 ميكرومتر إذا لزم الأمر (أي إذا كان هناك أي كتلة مرئية).
6. Aliquot تعليق 10 ميكرولتر وتمييع في المالحة الفوسفات المخزنة بالفوسفات في دولبيكو (DPBS)، إضافة تريبان الأزرق (0.04٪)، وتحميل على مقياس الدم، والانتظار لمدة 1 دقيقة، وعدد الخلايا قابلة للحياة (خلايا واضحة).
7. إضافة 9 مل من بنزوناسي RPMI 1640 (37 درجة مئوية) إلى الأنبوب، والطرد المركزي (400 × غرام، 10 دقيقة)، وإزالة supernatant، وتخفيف بيليه عن طريق النقر على الأنبوب.
ريسوسبند PBMCs في RPMI 1640 تكملها مع 25 MM HEPES, 2 mM L-الجلوتامين, 1 mM الصوديوم بيروفاتي, 100 U/mL البنسلين, 100 ميكروغرام / مل streptomycin, و 10٪ مصل AB الإنسان (متوسط الثقافة الكاملة). ضبط كثافة الخلية إلى 1.5 × 10⁶ خلايا / مل. لوحة PBMCs في لوحات 96 جيدا (أسفل شقة) في كثافة 3 × 10⁵ خلايا / جيدا.
إضافة مجمعات الببتيد المشتقة من HBV (2 ميكروغرام / مل لكل ببتيد واحد) إلى كل بئر. بالنسبة للتحكم في الخلفية والتحكم الإيجابي، أضف نفس كمية المذيبات (DMSO، 1 ميكرولتر/مل). إضافة 10 U/mL IL-2 و 10 نانوغرام/مل IL-7. حضانة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂.
في اليوم 3، تكملة الثقافة المتوسطة مع 50 U/mL من IL-2 و 10 نانوغرام / مل من IL-7.
ملاحظة: خلال اليوم 1 إلى اليوم 3، لن يلاحظ انتشار واضح للخلايا التائية. عادة ما ينخفض إجمالي عدد الخلايا بنسبة 1/3 إلى 1/2 ، بسبب وفاة الخلايا غير التائية مثل الخلايا B وخلايا NK وخلايا NKT والخلايا الأحادية.
في اليوم السابع، استبدل نصف الوسط الثقافي بوسط طازج يحتوي على الببتيدات (4 ميكروغرام/مل)، وIL-2 (100 U/mL)، وIL-7 (20 نانوغرام/مل).
ملاحظة: لتجنب إزعاج الخلايا في الجزء السفلي، ماصة حوالي 90 ميكرولتر من الثقافة المتوسطة بعناية من أعلى الوسط. وخلال اليوم الثالث إلى اليوم السابع، سيلاحظ انتشار قوي للخلايا التائية، وعادة ما تتجمع الخلايا التائية المنتشرة لتشكيل مجموعات.
في اليوم 10، بلطف ماصة خلية الثقافة في كل بئر 7-9 مرات لتصنيف مجموعات الخلايا، عد عدد الخلايا قابلة للحياة، ونقل 2×10⁵ خلايا في كل بئر إلى لوحة بئر 96 (القاع الجولة) لتحليل استجابة CD4 T-الخلية الخاصة HBV.
مواصلة زراعة بقية الخلايا لتحديد epitope في اليوم 12، وضبط حجم الثقافة المتوسطة إلى 100 ميكرولتر (التخلص من المتوسطة المفرطة)، وتكملة الثقافة مع 100 ميكرولتر من المتوسطة ثقافة كاملة جديدة تحتوي على الببتيدات (4 ميكروغرام / مل)، IL-2 (100 U/mL)، وIL-7 (20 نانوغرام / مل).
ملاحظة: خلال اليوم 7 إلى اليوم 10، تستمر الخلايا التائية في الانتشار بقوة. استبدل الوسط الموروث كما في الخطوة 3.5 إذا تحول الوسط إلى اللون الأصفر. بشكل عام، سوف يتجاوز عدد الخلايا 6×10⁵ في اليوم 10. كل بئر عادة ما يظهر عدد خلايا مماثلة، عد عدد الخلايا في 3 آبار واستخدام متوسط القيمة كتقدير لعدد الخلية لجميع الآبار.

4. تحليل استجابات CD4 T-Cell الخاصة ب HBV عن طريق قياس التدفق الخلوي

تحفيز PBMCs مع برك الببتيد
1. للخلايا المنقولة إلى لوحة البئر 96 (القاع المستدير)، اغسل 3 مرات في طبق (550 × غرام، 3 دقائق). استخدام 200 ميكرولتر من المتوسطة لكل غسل (RPMI 1640 لأول 2 يغسل، وسط ثقافة كاملة لغسل الماضي). تجاهل الحشرات الخارقة.
  ملاحظة: إزالة السيتوكينات المتبقية في الثقافة عن طريق الغسيل المتكرر يمكن أن تقلل بشكل فعال من الخلفية في تحليل قياس الخلايا التدفق داخل الخلايا.
2. لكل بئر من الخلايا التي يتم تحفيزها مع بركة ببتيد محددة ، أضف 200 ميكرولتر من متوسط الثقافة الكاملة المكملة بنفس برك الببتيد (2 ميكروغرام / مل لكل ببتيد واحد). للحصول على بئر التحكم في الخلفية، أضف وسيط ثقافة كاملة مكملا ب 1 ميكرولتر/مل من DMSO. كذلك من السيطرة الإيجابية, إضافة ثقافة كاملة المتوسطة تستكمل مع 1 ميكرولتر / مل من DMSO, 150 نانوغرام / مل من phorbol 12-myristate 13-خلات (PMA), و 1 ميكرومول / لتر من أيونوميسين.
  ملاحظة: جرعة عالية من DMSO سوف تمنع إفراز السيتوكين من الخلايا التائية (الأكثر أهمية ل TNF-α). لا ينصح بجرعة DMSO أعلى من 5 ميكرولتر / مل. عموما، جرعة DMSO في تجربتنا لا تتجاوز 1 ميكرولتر / مل.
3. حضانة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂ لمدة 6 ساعة.
4. بعد 1 ساعة من الحضانة، أضف Monensin (1.37 ميكروغرام/مل) إلى الثقافة.
قياس التدفق الخلوي
1. بعد 6 ساعة من الحضانة. إزالة supernatant بعد الطرد المركزي (550 × غرام، 3 دقائق)، وغسل الخلايا مرة واحدة مع 200 ميكروغرام من DPBS (550 × غرام، 3 دقائق)، وعلامات سطح وصمة عار (CD3، CD4، وCD8) وعلامة الجدوى (باستخدام صبغة الجدوى قابلة للإصلاح) في ثلاجة 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
2. يغسل مرة واحدة مع 200 ميكرولتر من DPBS (550 × غرام، 3 دقائق). تثبيت الخلايا و permeabilize، وصمة عار السيتوكينات داخل الخلايا (TNF-α وIFN-γ) في ثلاجة 4 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة.
3. بعد الغسل النهائي في تلطيخ داخل الخلايا، إعادة الإنفاق الخلايا في 150 ميكرولتر من تدفق التخزين المؤقت للخلايا (DPBS + 0.5٪ BSA).
4. الحصول على بيانات قياس التدفق الخلوي على مقياس التدفق الخلوي.
تحليل نتائج قياس التدفق الخلوي
1. تعريف إيجابي جيدا: النظر في كذلك إيجابية إذا كان لديه تردد السيتوكين إفراز الخلايا التائية مرتين على الأقل من التحكم في الخلفية جيدا (الشكل 1).
2. وفقا للصيغة التالية، حساب معدل الاستجابة لكل السيتوكين تحليل(الشكل 2):
  
  ملاحظة: تجمع الببتيد الصف وبرك الببتيد العمود في المصفوفة تمثل تشكيلين متميزين من مستضد HBV الأساسية، لذلك ينبغي تقسيم معدل الاستجابة النهائية من قبل 2.

5. تحديد HBV محددة HLA-DR المقيد CD4 تي الخلية Epitopes

تذوب وتحافظ على خطوط الخلايا الليمفاوية B (BLCLs) في قارورة T-75 (5-20 ×10⁶ خلايا ، 20 مل من متوسط الثقافة الكامل).
ملاحظة: لضمان الحالة الجيدة للBLCLs، يجب أن تبدأ هذه الخطوة قبل أسبوعين من ذوبان الجليد من PBMCs المرضى. وفقا لنتيجة الإبادة الجماعية ، يجب على المرضى مشاركة نفس أليل HLA-DRB1 مثل BLCLs.
فحص الببتيدات المرشحة لتحديد الهوية (الشكل 3)
1. وفقا لنتائج معدل استجابة الخلايا التائية في اليوم 10 ، قم بفحص برك الببتيد 2 مع أعلى معدل استجابة (تجمع الببتيد الصف 1 وتجمع الببتيد عمود واحد).
2. تعيين الببتيد في تلك برك 2 كبتيد مرشح إذا كان تجمع الببتيد الأخرى التي تحتوي على هذا الببتيد يظهر أيضا نتيجة إيجابية في تحليل استجابة الخلايا التائية. استخدام PBMCs الموسعة مع تجمع الببتيد الأخرى لتحديد epitope في وقت لاحق.
النابض BLCLs مع الببتيد
1. في اليوم 12، عد عدد BLCLs قابلة للحياة، ونقل الخلايا إلى أنابيب الطرد المركزي 15 مل، والطرد المركزي (350 × غرام، 10 دقيقة) وإزالة supernatant. Resuspend بيليه الخلية في المتوسط ثقافة كاملة، وaliquot BLCLs إلى لوحة 96 جيدا (القاع الجولة) في 4×10⁴ خلايا / جيدا في 80 ميكرولتر متوسطة الثقافة الكاملة.
2. إضافة الببتيد واحد (10 ميكروغرام / مل)، واحتضان في 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂ لمدة 2 ساعة. تعيين 2 التحكم الخلفية: الببتيد النابض مع HLA-DR حجب (المعالجة المسبقة مع المضادة HLA-DR (10 ميكروغرام / مل) لمدة 1 ساعة)؛ DMSO (1 ميكرولتر / مل) النابض. الحجم النهائي للوسط الثقافي الكامل في كل بئر هو 100 ميكرولتر.
3. أضف المتومايسين C (100 ميكروغرام/مل)، واحتضن عند 37 درجة مئوية و5٪ CO₂ لمدة ساعة واحدة.
4. غسل 3 مرات مع 200 ميكرولتر من RPMI 1640 (550 × غرام، 3 دقائق) في لوحة لإزالة الببتيد غير النابض والميتاميسين C. للغسيل الأول، تكمل ثقافة الحضانة مع 100 ميكرولتر من RPMI 1640.
5. Resuspend الخلايا في 120 ميكرولتر من المتوسطة ثقافة كاملة.
تحفيز PBMCs مع الببتيد نبض BLCLs.
1. في اليوم 12، نقل PBMCs إلى لوحة 96 جيدا (القاع الجولة).
2. إزالة supernatant بعد الطرد المركزي (550 × غرام، 3 دقائق) في لوحة، وغسل مرتين مع 200 ميكروغرام من RPMI 1640 (550 × غرام، 3 دقائق) في لوحة.
  ملاحظة: إزالة السيتوكينات والببتيدات المتبقية في الثقافة عن طريق الغسيل المتكرر هي الخطوة الرئيسية لتقليل الخلفية في تحليل قياس الخلايا التدفق داخل الخلايا. خاصة بالنسبة للببتيدات المتبقية ، فإنه سيتم ربط BLCLs وزيادة كبيرة في الخلفية.
3. إعادة الإنفاق PBMCs في كل بئر مع 210 ميكرولتر من المتوسطة ثقافة كاملة.
4. لبخير PBMCs التي تم اختيارها لتحديد epitope، مزيج aliquot (70 ميكرولتر لكل منهما) مع الببتيد نبض BLCLs (3 آبار، بما في ذلك 2 عناصر التحكم الخلفية).
  ملاحظة: في اليوم 12، سيصل عدد برك الببتيد الموسعة PBMCs عادة إلى ما يزيد عن 5-7×10⁵ لكل بئر، وبالتالي فإن نسبة PBMCs/BLCLs حوالي 6/1 إلى 4/1.
5. حضانة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂ لمدة 6 ساعة.
6. بعد 1 ساعة من الحضانة، أضف Monensin (1.37 ميكروغرام/مل) إلى الثقافة. الحجم النهائي للوسط الثقافي الكامل في كل بئر هو 200 ميكرولتر.
قياس التدفق الخلوي
1. كرر نفس العمليات كما في الخطوة 4.2.
تحليل نتائج قياس التدفق الخلوي
1. تحقق من الببتيد باعتباره HLA-DR المقيد CD4 T-cells epitope إذا أظهرت PBMCs المحتضنة مع هذه الببتيد نبض BLCLs تردد السيتوكين إفراز خلايا CD4 T مرتين على الأقل من PBMCs المحتضنة مع عناصر التحكم الخلفية (الببتيد النابض مع HLA-DR قبل حجب; DMSO النابض) (الشكل 4).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم حساب وتيرة السيتوكين إفراز خلايا CD4 T كمجموع كل من المنتجين واحد والمنتجين مزدوجة. كما هو موضح في الشكل 1، فإن وتيرة TNF-α التي تفرز خلايا CD4 T وتواتر الخلايا التائية CD4 γ التي تفرزها IFN في التحكم في الخلفية (DMSO) هي 0.154٪ و 0.013٪ على التوالي. تردد TNF-α إفراز خلايا CD4 T وتواتر IFN-γ إفراز خلايا CD4 T محددة لتجمع الببتيد Core11 هي 0.206 و 0.017 على التوالي، لذلك تعتبر كل من TNF-α إفراز CD4 استجابة الخلية التائية وIFN-γ إفراز CD4 T-الخلية استجابة لهذا التجمع الببتيد سلبية. تردد TN...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وترد الخطوات الأكثر أهمية في هذا البروتوكول على النحو التالي: 1) ما يكفي من مركبات PBMCs ذات الجدوى العالية لبدء توسيع PBMCs؛ (2) الخطوات الأكثر أهمية في هذا البروتوكول؛ (2) الخطوات التي يمكن أن تكون ذات جدوى عالية لبدء توسعات PBMCs؛ (2) الخطوات الأكثر أهمية في هذا البروتوكول. 2) البيئة المناسبة لتوسيع PBMCs؛ و 3) إزالة كاملة من برك الببتيد المتبقية في ثقافة PBMCs قبل تحديد epitope.

كل التحليل في هذا البروتوكول يعتمد على الانتشار القوي للخلايا التائية CD4. وبشكل عام، فإن عدد مركبات ثنائي الفين...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81930061) ومؤسسة تشونغتشينغ للعلوم الطبيعية (cstc2019jcyj-bshX0039 وcstc2019jcyj-zdxmX0004) والمفتاح الصيني
مشروع متخصص في الأمراض المعدية (2018ZX10723203).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
الألبومين البقري V (BSA)	Beyotime	ST023
APC مترافق ضد إنسان TNF- & ألفا ؛	eBioscience	17-7349-82	حافظ على الحماية من الضوء
Benzonase Nuclease	Sigma-Aldrich	E1014	الحد من كتل الخلايا
B خطوط الخلايا الأرومية الليمفاوية B (BLCLs)	مركز فريد هاتشينسون لأبحاث السرطان		HLA-DRB1 * 0803
خطوط الخلايا الأرومية الليمفاوية المتماثلة الزيجوت B (BLCLs)	مركز فريد هاتشينسون لأبحاث السرطان		HLA-DRB1 * 1202 متماثل الزيجوت
قارورة زراعة الخلية (T75) لوحة	الخلايا 430641		Corning
(96 بئر ، قاع مسطح)	Corning	3599	ذات القاع
المسطح (96 بئر ، قاع مستدير)	Corning	3799	مصفاة خلية مستديرة
	القاع Corning	CLS431751	حجم المسام 70 ؛ مو م ، أبيض ،
أنبوب طرد مركزي معقم (15 مل)	المعقم	KIRGEN	KG2611
(50 مل) جهاز	معقم		430829 Corning
Eppendorf	5804R		المبرد
حراري	مبرد ST16R
،	Thermo	Legend Micro 21R
مجموعة Cytofix / Cytoperm (مجموعة عازلة عامل النسخ)	BD Biosciences	562574	تحضير المحلول قبل الاستخدام
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650	يحفظ في درجة حرارة الغرفة لمنع التبلور
Dulbecco ' s محلول ملحي			تحضير ddH_{2< / sub>O (1000 مل) يحتوي على كلوريد الصوديوم (8000 مجم) ، KCl (200 مجم) ، KH2PO4 (200 مجم) ، و Na2HPO4.7H2O (2160 ؛ مجم). اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4. تعقيم من خلال الأوتوكلاف.}
نصائح مرشح Ficoll-Paque Premium	GE	Healthcare 17-5442-03
(0.5-10)	معقمة	Kirgen	KG5131
(100-1000)	معقمة	Kirgen	KG5333
(1-200)	Kirgen	KG5233	معقم
مترافق مع FITC مضاد للإنسان CD4	BioLegend	300506	يحافظ على الحماية من الضوء
صبغة قابلة للإصلاح eFluor780	eBioscience	65-0865-14	حافظ على الحماية من الضوء
مثبط نقل البروتين GolgiStop (يحتوي على Monensin)	BD Biosciences	554724	مثبط نقل البروتين
الدم	العلامة التجارية	718620
HBV الببتيدات المشتقة من المستضد	الأساسي Chinaالببتيدات
HEPES	Gibco	15630080	100 مل
مصل بشري AB	Gemini Bio-Products	100-51	100 مل
Ionomycin	Sigma-Aldrich	I0634
KCl	Sangon Biotech	A100395-0500
KH2PO4	Sangon Biotech	A100781-0500
LSRFortessa مقياس التدفق الخلوي	BD
L-glutamine	Gibco	25030081	100 مل
أنبوب الطرد المركزي الدقيق (1.5 مل) التعقيم	المعقم من Corning	MCT-150-C	قبل استخدام
الهزازات Microplate	الصناعات	العلمية MicroPlate Genie
Mitomycin C	Roche	10107409001
Na2HPO4.7H2O	Sangon Biotech	A100348-0500
NaCl	Sangon Biotech	A100241-0500
أنابيب PCR (0.2 مل) Kirgen		KG2331
PE / Cy7 مترافق مضاد للإنسان CD8	BioLegend	300914	يحافظ على الحماية من الضوء
المترافق PE المضاد للإنسان IFN- & جاما ؛	eBioscience	12-7319-42	حافظ على الحماية من الضوء
البنسلين ستربتومايسين	جيبكو	15140122	100 مل
PerCP-Cy5.5 المترافق المضاد للإنسان CD3	eBioscience	45-0037-42	يحفظ محميا من الضوء
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma-Aldrich	P1585
المؤتلف البشري IL-2	PeproTech	200-02
المؤتلف البشري IL-7	PeproTech	200-07
RPMI متوسط 1640	جيبكو	C11875500BT	500 مل
بيروفات الصوديوم ، 100 ملي	جيبكو	15360070
تريبان بلو داين (0.4٪)	جيبكو	15250-061
Ultra-LEAF منقى مضاد للإنسان HLA-DR	BioLegend	307648
Wizard الحمض النووي الجينومي طقم تنقية	Promega	A1125

IHW09126 IHW09121 زراعة لوحة ثقافة الخلية أنبوب الطرد المركزي طرد مركزي ، جهاز طرد مركزي ، جهاز طرد مركزي مبرد مخزن بالفوسفات نصائح مرشح نصائح مرشح مقياس

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Desmond, C. P., Bartholomeusz, A., Gaudieri, S., Revill, P. A., Lewin, S. R. A systematic review of T-cell epitopes in hepatitis B virus: identification, genotypic variation and relevance to antiviral therapeutics. Antiviral Therapy. 13, 161-175 (2008).
Mizukoshi, E., et al. Cellular immune responses to the hepatitis B virus polymerase. Journal of Immunology. 173, Baltimore, Md. 5863-5871 (2004).
Wölfl, M., Kuball, J., Eyrich, M., Schlegel, P. G., Greenberg, P. D. Use of CD137 to study the full repertoire of CD8+ T cells without the need to know epitope specificities. Cytometry Part A. 73, 1043-1049 (2008).
Reiss, S., et al. Comparative analysis of activation induced marker (AIM) assays for sensitive identification of antigen-specific CD4 T cells. PLoS One. 12, 0186998(2017).
Herati, R. S., et al. Successive annual influenza vaccination induces a recurrent oligoclonotypic memory response in circulating T follicular helper cells. Science Immunology. 2, (2017).
Bowyer, G., et al. Activation-induced Markers Detect Vaccine-Specific CD4+ T Cell Responses Not Measured by Assays Conventionally Used in Clinical Trials. Vaccines. 6, (2018).
Morou, A., et al. Altered differentiation is central to HIV-specific CD4(+) T cell dysfunction in progressive disease. Nature Immunology. 20, 1059-1070 (2019).
Grifoni, A., et al. Targets of T Cell Responses to SARS-CoV-2 Coronavirus in Humans with COVID-19 Disease and Unexposed Individuals. Cell. 181, 1489-1501 (2020).
Meckiff, B. J., et al. Imbalance of Regulatory and Cytotoxic SARS-CoV-2-Reactive CD4+ T Cells in COVID-19. Cell. , (2020).
Boni, C., et al. Characterization of hepatitis B virus (HBV)-specific T-cell dysfunction in chronic HBV infection. Journal of Virology. 81, 4215-4225 (2007).
Chang, J. J., et al. Reduced hepatitis B virus (HBV)-specific CD4+ T-cell responses in human immunodeficiency virus type 1-HBV-coinfected individuals receiving HBV-active antiretroviral therapy. Journal of Virology. 79, 3038-3051 (2005).
Boni, C., et al. Restored Function of HBV-Specific T Cells After Long-term Effective Therapy With Nucleos(t)ide Analogues. Gastroenterology. 143, 963-973 (2012).
Kennedy, P. T., et al. Preserved T-cell function in children and young adults with immune-tolerant chronic hepatitis B. Gastroenterology. 143, 637-645 (2012).
de Niet, A., et al. Restoration of T cell function in chronic hepatitis B patients upon treatment with interferon based combination therapy. Journal of Hepatology. 64, 539-546 (2016).
Rinker, F., et al. Hepatitis B virus-specific T cell responses after stopping nucleos(t)ide analogue therapy in HBeAg-negative chronic hepatitis B. Journal of Hepatology. 69, 584-593 (2018).
Wang, H., et al. TNF-α/IFN-γ profile of HBV-specific CD4 T cells is associated with liver damage and viral clearance in chronic HBV infection. Journal of Hepatology. 72, 45-56 (2020).
Hoffmeister, B., et al. Mapping T cell epitopes by flow cytometry. Methods. 29, 270-281 (2003).
Anthony, D. D., Lehmann, P. V. T-cell epitope mapping using the ELISPOT approach. Methods. 29, 260-269 (2003).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

T CD4 B HLA DR B

تحليل استجابات الخلايا التائية CD4 الخاصة ب HBV وتحديد HLA-DR-CD4 المقيدة CD4 T-Cell Epitopes استنادا إلى مصفوفة الببتيد

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة