يظهر هنا بروتوكول شامل لإجراء تجارب مشبك قوة فائقة السرعة على محركات الميوسين -5 المعالجة ، والتي يمكن تمديدها بسهولة لدراسة فئات أخرى من المحركات العملية. يفصل البروتوكول جميع الخطوات اللازمة ، من إعداد الجهاز التجريبي إلى إعداد العينات والحصول على البيانات وتحليلها.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تشريح الخصائص الميكانيكية الأنزيمية للميوسينات العملية باستخدام التحليل الطيفي فائق السرعة لقوة المشبك
في هذه المقالة
إشعار تصحيح
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
ملخص
الملخص
التحليل الطيفي فائق السرعة بمشبك القوة (UFFCS) هو تقنية جزيء واحد تعتمد على ملاقط الليزر التي تسمح بالتحقيق في الميكانيكا الكيميائية لكل من الميوسين التقليدي وغير التقليدي تحت الحمل بدقة زمنية غير مسبوقة. على وجه الخصوص ، أظهرت إمكانية فحص محركات الميوسين تحت قوة ثابتة مباشرة بعد تكوين رابطة الأكتين والميوسين ، جنبا إلى جنب مع المعدل المرتفع لردود الفعل للقوة (200 كيلو هرتز) ، أن UFFCS أداة قيمة لدراسة الاعتماد على الحمل للديناميكيات السريعة مثل شوط عمل الميوسين. علاوة على ذلك ، يتيح UFFCS دراسة كيفية تأثر تفاعلات الميوسين والأكتين الإجرائية وغير العملية بكثافة واتجاه القوة المطبقة.
باتباع هذا البروتوكول ، سيكون من الممكن إجراء تجارب فائقة السرعة على محركات الميوسين -5 المعالجة وعلى مجموعة متنوعة من الميوسينات غير التقليدية. من خلال بعض التعديلات ، يمكن أيضا توسيع البروتوكول بسهولة لدراسة فئات أخرى من المحركات المعالجة مثل kinesins و dyneins. يتضمن البروتوكول جميع الخطوات اللازمة ، من إعداد الجهاز التجريبي إلى إعداد العينات وإجراءات المعايرة والحصول على البيانات وتحليلها.
المقدمة
في العقود الأخيرة ، كانت الملقط البصري أداة قيمة لتوضيح الكيمياء الميكانيكية لتفاعلات البروتين على مستوى الجزيء الواحد ، نظرا للإمكانية المذهلة للتلاعب المتزامن وقياس التغيرات التوافقية والحركية الأنزيمية 1,2. على وجه الخصوص ، فإن القدرة على تطبيق وقياس القوى في نطاق تلك التي تمارسها المحركات الجزيئية في الخلية ، جنبا إلى جنب مع القدرة على قياس التغيرات التوافقية دون النانومتر ، جعلت الملقط البصري أداة فريدة من نوعها أحادية الجزيء لكشف الخواص الميكانيكية الكيميائية للبروتينات الحركية وتنظيمها الميكانيكي.
التحليل الطيفي فائق السرعة (UFFCS) هو تقنية التحليل الطيفي للقوة أحادية الجزيء ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. الإعداد البصري
ملاحظة: يتكون الإعداد التجريبي من ملاقط بصرية مزدوجة مع ثبات تأشير نانومتر وتقلبات شدة ليزر < 1٪. في ظل هذه الظروف ، يتم ضمان استقرار الدمبل على مستوى النانومتر تحت صلابة المصيدة النموذجية (0.1 pN / nm) والتوتر (1 pN - بضع عشرات من pN). يوضح الشكل 2 مخططا مفصلا للإعداد البصري.
- ملاقط بصرية تصميم وبناء 9،10،11.
- ضع جميع مكونات الإعداد على طاولة بصرية وفقا للمخطط في الشكل 2. لاحظ أن الجدول البصري يتضمن عوازل نشطة لتقليل الاهتزازات الميكانيكية. بالإضافة إلى ذل....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تتكون البيانات التمثيلية في سجلات الموقف بمرور الوقت كما هو موضح في الشكل 4. في سجل الموقف ، يمكن رؤية نوعين من الإزاحة. أولا ، عندما لا يتفاعل محرك الميوسين مع خيوط الأكتين ، تتحرك الحبيبات المحبوسة بسرعة ثابتة مقابل قوة السحب اللزجة للمحلول مما يدل على إزاحة خطية تتأرجح داخل نطاق التذبذب الذي حدده المشغل في موجة مثلثة3 (غير مرئية في الشكل 4 بسبب المقياس الزمني الطويل). ثانيا، بمجرد تفاعل محرك الميوسين مع الفتيلة، تنتقل .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
على الرغم من أن تقنيات الجزيء الواحد ، مثل الفحص ثلاثي الخرز ، تمثل تحديا تقنيا وإنتاجية منخفضة ، إلا أن UFFCS يحسن اكتشاف التفاعلات الجزيئية بفضل نسبة الإشارة إلى الضوضاء العالية للبيانات. يسمح UFFCS بدراسة الاعتماد على الحمل للبروتينات الحركية ، مع المزايا الرئيسية لتطبيق القوة بسرعة كبيرة عند ربط المحرك بالخيوط لاستكشاف الأحداث المبكرة والسريعة جدا في إنتاج القوة وحالات الربط الضعيفة تحت القوة الخاضعة للرقابة ؛ الحفاظ على ثبات القوة طوال فترة التشغيل والتحقق من الاعتماد الحركي مع التحكم الكامل في اتجاه القوة. فيما يتع.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من قبل برنامج البحث والابتكار Horizon 2020 التابع للاتحاد الأوروبي بموجب اتفاقية المنحة رقم 871124 Laserlab-Europe ، من قبل وزارة الجامعات والبحوث الإيطالية (FIRB "Futuro in Ricerca" 2013 Grant No. RBFR13V4M2) ، ومن قبل Ente Cassa di Risparmio di Firenze. تم دعم A.V. Kashchuk من قبل زمالة متعددة التخصصات لبرنامج علوم الحدود البشرية LT008 / 2020-C.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| حبات اللاتكس الأليفاتية | ThermoFisher | A37362 | 1.0-& قطر م ، 2٪ (وزن / حجم) |
| أسيتون | سيجما | 32201 | |
| عازلة بلمرة الأكتين | الهيكل الخلوي | BSA02 | 10X |
| AODs (عاكسات صوتية بصرية) | AA Opto Electronic | DTS-XY 250 | عاكسات شعاع |
| الليزر ATP | Sigma | A7699 | |
| Biotinylated-BSA | ThermoFisher | 29130 | |
| BSA | سيجما | B4287 | |
| كالمودولين من دماغ الخنازير (CaM) | ميرك ميليبور | 208783 | |
| كاتالاز من كبد البقر | سيجما | C40 | |
| مكثف | أوليمبوس | أوليمبوس U-AAC ، أبلانات ، أكرومات | NA 1.4 ، غمر الزيت |
| الكرياتين فوسفات ملح رباعي هيدرات | سيجما | 27920 | |
| الكرياتين فوسفوكيناز من عضلات الأرنب | Sigma | C3755 | |
| DDs | AA Opto Electronic | AA. دس. XX | مركب رقمي ثنائي القناة |
| DL-Dithiothreitol (DTT) / td> | Sigma | 43819 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| G-actin بروتين | الهيكل الخلوي | AKL99 | |
| Glucose | Sigma | G7528 | |
| Glucose Oxidase من Aspergillus niger | Sigma | G7141 | |
| HaloTag succinimidyl ester O2 ligand | Promega | P1691 | |
| شحم سيليكون عالي الفراغ الثقيل | Merck Millipore | 107921 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| KH2PO4 / K2HPO4 | Sigma | P5379 / P8281 | |
| Labview | National Instruments | الإصدار 8.1 | الحصول على البيانات |
| Labview وحدة FPGA | الصكوك | الوطنية الإصدار 8.1 | Fast Force-Clamp |
| Matlab | MathWorks | 2016 | تحليل البيانات |
| MgCl2 | Fluka | 63020 | |
| المجهر الهدف | نيكون | Plan-Apo 60X | NA 1.2 ، WD 0.2 مم ، الماء imm. |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| Nitrocellulose | Sigma | N8267 | 0.45 حجم المسام |
| محلول أسيتات البنتيل | Sigma | 46022 | |
| الإيثانول النقي | سيجما | 2860 | |
| QPDs UDT | DLS-20 | D موقف كاشف | |
| الرودامين BSA | المجسات الجزيئية | A23016 | |
| الرودامين فالويدين | & nbsp ؛ Sigma | P1951 | |
| حبات السيليكا | Bangslabs | SS04N | 1.21 مم ، 10٪ مواد صلبة |
| أزيد الصوديوم | ؛ سيجما | S2002 | |
| بروتين ستربتافيدين | سيجما | 189730 |
المراجع
- Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles. Optical Angular Momentum. 11 (5), 196-198 (2016).
- Capitanio, M., Pavone, F. S.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
تصحيح
Formal Correction: Erratum: Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy
Posted by JoVE Editors on 8/25/2021. Citeable Link.
An erratum was issued for: Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy. The title was updated.
The title was updated from:
Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy
to:
Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy
