يصف هذا البروتوكول طريقة مفصلة لإعداد وتلطيخ التألق المناعي للحوامل المسطحة لشبكية العين لدى الفئران وتحليلها. يتم وصف استخدام تصوير الأوعية الدموية قاع العين بالفلوريسين (FFA) لجراء الفئران ومعالجة الصور بالتفصيل أيضا.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
مراقبة النمو الديناميكي لأوعية الشبكية في نموذج فأر اعتلال الشبكية الناجم عن الأكسجين
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يستخدم اعتلال الشبكية الناجم عن الأكسجين (OIR) على نطاق واسع لدراسة نمو الأوعية غير الطبيعي في أمراض الشبكية الإقفارية، بما في ذلك اعتلال الشبكية الخداجي (ROP)، واعتلال الشبكية السكري التكاثري (PDR)، وانسداد الوريد الشبكي (RVO). معظم دراسات OIR تلاحظ الأوعية الدموية الجديدة في شبكية العين في نقاط زمنية محددة. ومع ذلك ، فإن نمو الأوعية الديناميكي في الفئران الحية على طول مسار زمني ، وهو أمر ضروري لفهم أمراض الأوعية المرتبطة ب OIR ، لم تتم دراسته بشكل كاف. هنا ، نصف بروتوكولا خطوة بخطوة لتحريض نموذج الماوس OIR ، مع تسليط الضوء على المزالق المحتملة ، وتوفير طريقة محسنة لتحديد مناطق طمس الأوعية (VO) والأوعية الدموية الجديدة (NV) بسرعة باستخدام تلطيخ التألق المناعي. الأهم من ذلك ، قمنا بمراقبة إعادة نمو الأوعية في الفئران الحية من P15 إلى P25 عن طريق إجراء تصوير الأوعية الدموية قاع العين بالفلوريسين (FFA) في نموذج فأر OIR. يسمح لنا تطبيق FFA على نموذج الماوس OIR بمراقبة عملية إعادة التشكيل أثناء إعادة نمو السفينة.
المقدمة
عادة ما تمتد الأوعية الدموية الجديدة في الشبكية (RNV)، والتي تعرف بأنها حالة تنشأ فيها أوعية مرضية جديدة من الأوردة الشبكية الموجودة، على طول السطح الداخلي للشبكية وتنمو في الجسم الزجاجي (أو الفضاء تحت الشبكية في ظل بعض الظروف)1. وهو سمة مميزة وسمة مشتركة للعديد من اعتلالات الشبكية الإقفارية، بما في ذلك اعتلال الشبكية الخداجي (ROP)، وانسداد الوريد الشبكي (RVO)، واعتلال الشبكية السكري التكاثري (PDR)2.
أشارت العديد من الملاحظات السريرية والتجريبية إلى أن نقص التروية هو السبب الرئيسي لتوسع الأوعية الدموية الجديدة في الشبكية 3,4. في شرطة ع....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على جميع الإجراءات التي تنطوي على استخدام الفئران من قبل لجنة أخلاقيات التجارب الحيوانية التابعة لمركز تشونغشان للعيون ، جامعة صن يات صن ، الصين (الرقم المعتمد: 2020-082) ، ووفقا للمبادئ التوجيهية المعتمدة للجنة رعاية واستخدام الحيوانات التابعة لمركز تشونغشان للعيون وبيان جمعية البحوث في الرؤية وطب العيون (ARVO) لاستخدام الحيوانات في أبحاث العيون والرؤية.
1. تحريض نموذج OIR الماوس
- استخدم الفئران ذات المعدل المنخفض من التشوه الخلقي للعينين ، على سبيل المثال ، الفئران C57BL / 6J ، وتزاوجها بنسبة ذكور / إناث = 1: 2. احصل على الجراء المولودة في نفس اليوم وابدأ في تحفيز نموذج OIR في P7. سجل وزن الجسم من الجراء الماوس بدقة ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
في نموذج الماوس OIR ، فإن النتيجة الأكثر أهمية وأساسية هي التحديد الكمي لمنطقة VO و NV. بعد العيش في بيئة فرط التأكسج لمدة 5 أيام من P7 ، أظهرت شبكية العين المركزية للجراء أكبر منطقة غير تروية. تحت تحفيز نقص الأكسجة في 5 أيام أخرى ، تم إنتاج الأوعية الدموية الجديدة في الشبكية تدريجيا والتي تألقت بشكل مكثف أكثر من الأوعية الطبيعية المحيطة. بعد P17 ، تراجعت إشارة التألق للأوعية الدموية الجديدة المرضية بسرعة مع إعادة تشكيل شبكية العين (الشكل 5A). من خلال التحكم في حجم القمامة وزيادة وزن الجراء .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تتأثر قابلية الفئران ل OIR بالعديد من العوامل. لا يمكن مقارنة الجراء من خلفية وراثية مختلفة وسلالات. في الفئران البيضاء BALB / c ، تنمو الأوعية مرة أخرى في منطقة VO بسرعة مع انخفاض كبير في خصلات الأوعية الدموية الجديدة38 ، والتي تجلب بعض الصعوبات للبحث. في الفئران C57BL / 6 ، هناك زيادة في تلف المستقبلات الضوئية بالمقارنة مع سلالة الماوس BALB / cJ39,40. وينطبق الشيء نفسه على أنواع مختلفة من الفئران المعدلة وراثيا41،.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
نشكر جميع الأعضاء من مختبرنا ومختبر العيون في مركز تشونغشان لطب العيون على مساعدتهم التقنية. كما نشكر البروفيسور تشونكياو ليو على الدعم التجريبي. تم دعم هذا العمل من خلال منح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (NSFC: 81670872; بكين، الصين)، ومؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة قوانغدونغ، الصين (المنحة رقم 2019A1515011347)، ومشروع بناء مستشفى رفيع المستوى من مختبر الدولة الرئيسي لطب العيون في مركز تشونغشان لطب العيون (المنحة رقم 303020103؛ قوانغتشو ، مقاطعة قوانغدونغ ، الصين).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 1 مل حقنة معقمة | Solarbio | YA0550 | لإعداد حوامل الشبكية المسطحة والحقن داخل الصفاق |
| 1 & مرات ؛ محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) Transgen | Biotech | FG701-01 | لتحضير حوامل الشبكية المسطحة |
| 2 مل أنبوب الطرد المركزي | الدقيق Corning | MCT-200-C | لتحضير حوامل الشبكية المسطحة |
| 48 ألواح آبار متعددة معالجة بتقنية TC | بشكل جيد Corning | 3548 | لتحضير حوامل الشبكية المسطحة |
| شرائح مجهر لاصقة | متنوعة | لإعداد حوامل الشبكية المسطحة | |
| Adobe Photoshop CC 2019 | شركة أدوبي | لتحليل الصور | |
| غاز ثاني أكسيد الكربون | مختلف | للتضحية | |
| غطاء الشريحة | متنوعة | لتحضير حوامل الشبكية المسطحة | |
| ملقط منحني | الدقة العالمية | 14127 | لتحضير حوامل الشبكية المسطحة محلول |
| تلطيخ DAPI | Abcam | ab228549 | لوضع العلامات على النواة على حوامل الشبكية المسطحة |
| تشريح المجهر | Olmpus | SZ61 | لإعداد حوامل مسطحة الشبكية |
| الفلورسين الصوديوم | Sigma-Aldrich | F6377 | ل in vivo< / em> تصوير |
| المجهر الفلوريسن | Zeiss | AxioImager.Z2 | للحصول على صور مضان من حوامل الشبكية المسطحة |
| Fluoromount-G وسائط تصاعد | SouthernBiotech | 0100-01 | لإعداد حوامل شبكية العين المسطحة |
| هيدروكسي بروبيل ميثيل السليلوز | مايا | 89161 | ل in vivo< / em> تصوير |
| Isolectin B4 594 الجسم المضاد | Invitrogen | I21413 | على حوامل الشبكية المسطحة |
| الفئران C57 / BL6J | GemPharmatech بمقاطعة | لتحريض نموذج OIR | |
| دقيق مقص مستقيم | العالم أدوات الدقة | 503242 | لإعداد حوامل شبكية العين المسطحة |
| رقم 4 ملقط مستقيم | World Precision Instruments | ؛ 501978-6 | لتحضير حوامل الشبكية المسطحة |
| مصل الحمار العادي | Abcam | ab7475 | لتحضير حوامل الشبكية المسطحة |
| O2< / sub> مستشعر | مختلف | لمراقبة مستوى O2< / sub> | |
| OxyCycler | Biospherix | A84XOV | لتحريض نموذج |
| OIR Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148-1KG | لتثبيت الأنسجة |
| الصوديوم البنتوباربيتال | مختلف | للتخدير | |
| الجير الصودا | مختلف | لامتصاص ثاني أكسيد الكربون <الزائد >2< / فرعي > في غرفة الأكسجين | |
| SPECTRALIS HRA + OCT | هايدلبرغ | HC00500002 | ل in vivo < / em > تصوير |
| SPSS Statistics 22.0 | IBM | للتحليل الإحصائي | |
| Tansference decloring shaker | Kylin-Bell | ZD-2008 | لتحضير حوامل الشبكية المسطحة |
| طبق زراعة الأنسجة (مرفق منخفض) | Corning | 3261-20EA | لتحضير حوامل الشبكية المسطحة نقل |
| ماصات | مختلفة | لإعداد حوامل الشبكية المسطحة Triton | |
| X-100 | Sigma-Aldrich | & nbsp ؛ SLBW6818 | لإعداد حوامل شبكية العين المسطحة |
| تروبيكاميد | متنوعة | ل in vivo< em> تصوير | |
| ZEN برنامج التصوير | ZEISS | للحصول على الصور وتصديرها |
المراجع
- Vavvas, D. G., Miller, J. W. Chapter 26 - Basic Mechanisms of Pathological Retinal and Choroidal Angiogenesis. Retina (Fifth Edition). 1, 562-578 (2013).
- Selvam, S., Kumar, T., Fruttiger, M. Retinal vasculature development in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 1-19 (20....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
