توضح هذه المقالة عزل خلايا الصمام الأبهري للفأرة بواسطة إجراء كولاجيناز من خطوتين. خلايا صمام الماوس المعزولة مهمة لإجراء فحوصات مختلفة، مثل هذا المقايسة تكلس المختبر، والتحقيق في المسارات الجزيئية المؤدية إلى تمعدن الصمام الأبهري.
مقالة منهجية
توضح هذه المقالة عزل خلايا الصمام الأبهري للفأرة بواسطة إجراء كولاجيناز من خطوتين. خلايا صمام الماوس المعزولة مهمة لإجراء فحوصات مختلفة، مثل هذا المقايسة تكلس المختبر، والتحقيق في المسارات الجزيئية المؤدية إلى تمعدن الصمام الأبهري.
تكلس خلايا الصمام الأبهري هو السمة المميزة للتضيق الأبهري ويرتبط مع تليف أعتاب الصمام. تلعب الخلايا الخلالية للصمامات (VICs) دورا مهما في عملية تكلس تضيق الأبهر من خلال تفعيل برنامجها للتمايز إلى خلايا تشبه الأرومة العظمية. MOUSE VICs هي أداة جيدة في المختبر لتوضيح مسارات الإشارات التي تقود تمعدن خلية الصمام الأبهري. الطريقة الموصوفة هنا، التي استخدمها هؤلاء المؤلفون بنجاح، تشرح كيفية الحصول على خلايا معزولة حديثا. تم إجراء عملية كولاجيناز من خطوتين مع 1 ملغم/مل و4.5 ملغم/مل. الخطوة الأولى حاسمة لإزالة طبقة الخلية البطانية وتجنب أي تلوث. حضانة الكولاجين الثانية هي تسهيل هجرة VICs من الأنسجة إلى اللوحة. بالإضافة إلى ذلك ، تتم مناقشة إجراء تلطيخ immunofluorescence لتوصيف النمط الظاهري لخلايا صمام الماوس المعزولة. وعلاوة على ذلك، تم إجراء فحص تكلس في المختبر باستخدام إجراء قياس كاشف الكالسيوم وتلطيخ أحمر alizarin. استخدام الخلايا صمام الماوس الثقافة الأولية أمر ضروري لاختبار أهداف الدوائية الجديدة لمنع تمعدن الخلايا في المختبر.
مرض الصمام الأبهري المتكلس (CAVD) هو مرض القلب الصمامي الأكثر انتشارا في السكان الغربيين ، ويؤثر على ما يقرب من 2.5٪ من الأفراد المسنين الذين تزيد أعمارهم عن 65 عاما. CAVD يؤثر على أكثر من ستة ملايين أميركي ويرتبط مع التغيرات في الخصائص الميكانيكية للمنشورات التي تضعف تدفق الدم العادي من خلال1،2. حاليا، لا يوجد علاج دوائي لوقف تطور المرض أو لتنشيط الانحدار المعدني. العلاج الفعال الوحيد لعلاج CAVD هو استبدال الصمام الأبهري عن طريق الجراحة أو استبدال الصمام الأبهري عبر القسطرة3. ولذلك فمن الضروري التحقيق في الآليات الجزيئية المؤدية إلى تمعدن الصمام لتحديد أهداف دوا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
ملاحظة: تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية الموصوفة هنا من قبل كلية إيكان للطب في لجنة النواة المؤسسية والاستخدام في جبل سيناء.
1. إعداد قبل عزل خلية صمام من الفئران الكبار
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
وبما أن قطر الصمامات الأبهرية المورينية يبلغ عادة 1 مم، يجب تجميع ثلاثة صمامات على الأقل لجمع مليون خلية قابلة للحياة لإجراء عمليات تجريبية مختلفة. تظهر الخطوات المختلفة لعملية عزل مركز فيينا الدولي في الشكل 1 والشكل 2. كما أنه من الصعب كشط يدويا أنسجة صمام، فمن الأفضل استخدام الإجهاد القص التي أنشأتها دوامة لإزالة VECs. في الواقع ، أظهرت نتائج تلطيخ immunofluorescence CD31 عدم وجود تلوث الخلايا البطانية(الشكل 3D). بالإضافة إلى ذلك،.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
تقدم هذه المقالة بروتوكول مفصل عزل خلية صمام الماوس للثقافة الأساسية. تم تجميع ثلاثة صمامات الأبهر من الفئران البالغة من العمر 8 أسابيع للحصول على عدد كاف من الخلايا. وبالإضافة إلى ذلك، يصف هذا البروتوكول توصيف النمط الظاهري في مركز فيينا الدولي ومقايسة التمعدن في المختبر. تم تكييف هذه الطريقة من البروتوكول الموصوف سابقا من ماتيووآخرون.
أثناء عزل الصمامات الأبهرية ، يجب توخي الحذر لتجنب جميع مصادر العدوى المحتملة لحماية الخلايا من التلوث البكتيري أو ا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| مقص 3 مم | FS | 15000-00 | |
| مضاد لألفا للعضلات الملساء الأكتين الجسم المضاد | abcam | ||
| مضاد للماوس ، Alexa Fluor 488 | الخلية | المترافقة 4412 | |
| مجموعة كاشف Arsenazo-III | POINT SCIENTIFIC | C7529-500 | مجموعة لقياس تركيز الكالسيوم |
| Bonn Scissors | FST | 14184-09 | |
| هيدروكسيد الكالسيوم | SIGMA -Aldrich 31219 | 31219 | |
| CD31 | Novusbio | ||
| Collagenase type I & nbsp ؛ (125 وحدة / مجم) | 17018029 | Thermofisher Scientific | |
| 11965092 | DMEM | Tthermofisher | |
| ملقط غرايف فائق النعومة | FST | 11150-10 | |
| FBS | Gibco 16000044 | ||
| ملقط ناعم | FST Dumont | ||
| HCl | SIGMA-ALDRICH | H1758 | |
| HEPES 1M محلول | الخلايا الجذعية تقنيات | ||
| L-Glutamine 100x | Thermofisher Scientific | A2916801 | |
| Mycozap | Lanza | VZA-2011 | كاشف القضاء على الميكوبلازما |
| PBS 10x | SIGMA-ALDRICH | ||
| بينسيلين ستربتومايسين 100x | ثيرموفيشر علمي | 10378016 | |
| الصوديوم بيروفات 100 ملي مولار | ثيرموفيشر علمي | 11360070 | |
| ملقط نمط قياسي | مقص جراحي FST | 11000-12 | |
| - Sharp-Blunt | FST | 14008-14 | |
| Trypsin 0.05٪ | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| Vimentin | abcam |
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه
طلب إذن