RESEARCH
Peer reviewed scientific video journal
Video encyclopedia of advanced research methods
Visualizing science through experiment videos
EDUCATION
Video textbooks for undergraduate courses
Visual demonstrations of key scientific experiments
BUSINESS
Video textbooks for business education
OTHERS
Interactive video based quizzes for formative assessments
Products
RESEARCH
JoVE Journal
Peer reviewed scientific video journal
JoVE Encyclopedia of Experiments
Video encyclopedia of advanced research methods
EDUCATION
JoVE Core
Video textbooks for undergraduates
JoVE Science Education
Visual demonstrations of key scientific experiments
JoVE Lab Manual
Videos of experiments for undergraduate lab courses
BUSINESS
JoVE Business
Video textbooks for business education
Solutions
Language
ar
Menu
Menu
Menu
Menu
A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Research Article
Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.
Erratum Notice
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Retraction Notice
The article Assisted Selection of Biomarkers by Linear Discriminant Analysis Effect Size (LEfSe) in Microbiome Data (10.3791/61715) has been retracted by the journal upon the authors' request due to a conflict regarding the data and methodology. View Retraction Notice
يتم وصف منصة استخراج الغاز والكروماتوغرافيا ذات الطور الصلب في مساحة الرأس هنا لتحديد وقياس كمية متطايرة سريعة وموثوقة وشبه آلية في ثمار الكشمش الأسود الناضجة. يمكن استخدام هذه التقنية لزيادة المعرفة حول رائحة الفاكهة واختيار الأصناف ذات النكهة المحسنة لغرض التربية.
هناك اهتمام متزايد بقياس المركبات العضوية المتطايرة (VOCs) المنبعثة من الثمار الناضجة لغرض تربية الأصناف أو الأصناف ذات الخصائص الحسية المحسنة وبالتالي زيادة قبول المستهلك. تم مؤخرا تطوير منصات استقلابية عالية الإنتاجية لتحديد مجموعة واسعة من المستقلبات في الأنسجة النباتية المختلفة ، بما في ذلك المركبات الرئيسية المسؤولة عن طعم الفاكهة وجودة الرائحة (volatilomics). يتم وصف طريقة تستخدم الاستخراج المجهري للطور الصلب (HS-SPME) إلى جانب كروماتوغرافيا الغاز - قياس الطيف الكتلي (GC-MS) هنا لتحديد وقياس كمية المركبات العضوية المتطايرة المنبعثة من ثمار الكشمش الأسود الناضجة ، وهو توت يحظى بتقدير كبير لنكهته وفوائده الصحية.
تم حصاد الثمار الناضجة لنباتات الكشمش الأسود (Ribes nigrum) وتجميدها مباشرة في النيتروجين السائل. بعد تجانس الأنسجة لإنتاج مسحوق ناعم ، تم إذابة العينات وخلطها على الفور بمحلول كلوريد الصوديوم. بعد الطرد المركزي ، تم نقل المادة الفائقة إلى قارورة زجاجية في مساحة الرأس تحتوي على كلوريد الصوديوم. ثم تم استخراج المركبات العضوية المتطايرة باستخدام ألياف الاستخراج المجهري للطور الصلب (SPME) وكروماتوغراف الغاز إلى جانب مطياف كتلة مصيدة الأيونات. تم إجراء القياس الكمي المتطاير على الكروماتوجرامات الأيونية الناتجة عن طريق دمج منطقة الذروة ، باستخدام أيون m / z محدد لكل VOC. تم تأكيد التعليق التوضيحي الصحيح للمركبات العضوية المتطايرة من خلال مقارنة أوقات الاحتفاظ وأطياف الكتلة للمعايير التجارية البحتة التي تعمل في ظل نفس ظروف العينات. تم تحديد أكثر من 60 مركبات عضوية متطايرة في ثمار الكشمش الأسود الناضجة المزروعة في مواقع أوروبية متناقضة. من بين المركبات العضوية المتطايرة المحددة ، يمكن استخدام مركبات الرائحة الرئيسية ، مثل التربينويدات والمتطايرة C6 ، كمؤشرات حيوية لجودة فاكهة الكشمش الأسود. بالإضافة إلى ذلك ، تتم مناقشة مزايا وعيوب الطريقة ، بما في ذلك التحسينات المحتملة. وعلاوة على ذلك، تم التشديد على استخدام الضوابط لتصحيح الدفعات والتقليل إلى أدنى حد من شدة الانجراف.
النكهة هي سمة جودة أساسية لأي فاكهة ، مما يؤثر على قبول المستهلك وبالتالي يؤثر بشكل كبير على قابلية التسويق. يتضمن إدراك النكهة مزيجا من أنظمة الذوق والشم ويعتمد كيميائيا على وجود وتركيز مجموعة واسعة من المركبات التي تتراكم في أجزاء نباتية صالحة للأكل ، أو في حالة المركبات العضوية المتطايرة ، تنبعث من الفاكهة الناضجة1,2. في حين ركزت التربية التقليدية على الصفات الزراعية مثل الغلة ومقاومة الآفات، فإن تحسين سمات جودة الفاكهة، بما في ذلك النكهة، قد أهمل منذ فترة طويلة بسبب التعقيد الوراثي وصعوبة النمط الظاهري الصحيح لهذه الخصائص، مما أدى إلى استياء المستهلك3،4. نجحت التطورات الحديثة في منصات الأيض في تحديد وقياس المركبات الرئيسية المسؤولة عن طعم الفاكهة ورائحتها5،6،7،8. وعلاوة على ذلك، فإن الجمع بين التنميط الأيضي والأدوات الجينومية أو النسخية يسمح بتوضيح علم الوراثة الكامن وراء نكهة الفاكهة، والتي بدورها ستساعد برامج التربية على تطوير أصناف جديدة ذات خصائص حسية محسنة2،4،9،10،11،12،13،14.
يحظى توت الكشمش الأسود (Ribes nigrum) بتقدير كبير لنكهته وخصائصه الغذائية ، حيث يتم زراعته على نطاق واسع في المناطق المعتدلة في أوروبا وآسيا ونيوزيلندا15. تتم معالجة معظم الإنتاج للمنتجات الغذائية والمشروبات ، والتي تحظى بشعبية كبيرة في بلدان الشمال الأوروبي ، ويرجع ذلك أساسا إلى الخصائص الحسية للتوت. اللون والنكهة المكثفة للفاكهة هي نتيجة لمزيج من الأنثوسيانين والسكريات والأحماض والمركبات العضوية المتطايرة الموجودة في الثمار الناضجة16،17،18. يعود تحليل المواد المتطايرة من الكشمش الأسود إلى 1960s19,20,21. في الآونة الأخيرة ، ركزت العديد من الدراسات على المركبات العضوية المتطايرة الكشمش الأسود ، وتحديد المركبات المهمة لإدراك رائحة الفاكهة وتقييم تأثير النمط الوراثي أو البيئة أو ظروف التخزين والمعالجة على محتوى المركبات العضوية المتطايرة 5،17،18،22،23.
نظرا لمزاياها العديدة ، فإن التقنية المفضلة للتنميط المتطاير عالي الإنتاجية هي HS-SPME / GC-MS24,25. يتم تركيب ألياف السيليكا ، المغلفة بمرحلة بوليمرية ، على جهاز حقنة ، مما يسمح بامتصاص المواد المتطايرة في الألياف حتى يتم الوصول إلى مرحلة التوازن. يحمي استخراج مساحة الرأس الألياف من المركبات غير المتطايرة الموجودة في المصفوفة24. ويمكن ل SPME أن تعزل بنجاح عددا كبيرا من المركبات العضوية المتطايرة الموجودة بتركيزات شديدة التباين (أجزاء في المليار إلى أجزاء في المليون)25. بالإضافة إلى ذلك ، فهي تقنية خالية من المذيبات تتطلب معالجة عينات محدودة. المزايا الأخرى ل HS-SPME هي سهولة التشغيل الآلي وتكلفته المنخفضة نسبيا.
ومع ذلك ، يمكن أن يكون نجاحها محدودا ، اعتمادا على الطبيعة الكيميائية للمركبات العضوية المتطايرة ، وبروتوكول الاستخراج (بما في ذلك الوقت ودرجة الحرارة وتركيز الملح) ، واستقرار العينة ، وتوافر أنسجة الفاكهة الكافية26,27. تقدم هذه الورقة بروتوكولا للمركبات العضوية المتطايرة ذات الكشمش الأسود المعزولة بواسطة HS-SPME وتحليلها بواسطة كروماتوغرافيا الغاز إلى جانب مطياف كتلة مصيدة الأيونات. تم تحقيق توازن بين كمية المواد النباتية وثبات العينة ومدة الاستخراج والكروماتوغرافيا لتكون قادرة على معالجة أعداد كبيرة من عينات الكشمش الأسود ، بعضها عرض في هذه الدراسة. وعلى وجه الخصوص، سيتم عرض ومناقشة ملامح المركبات العضوية المتطايرة و/أو كروماتوغرامات خمسة أصناف ("أنديغا" و"بن ترون" و"بن غيرن" و"بن تيران" و"تيهوب") كمثال على البيانات. علاوة على ذلك ، تم تطبيق نفس البروتوكول بنجاح لقياس المركبات العضوية المتطايرة في أنواع أخرى من توت الفاكهة مثل الفراولة (Fragaria x ananassa) ، والتوت (Rubusidaeus) ، والتوت الأزرق (Vaccinium spp).
1. حصاد الفاكهة
2. عينة الفاكهة وإعداد كاشف
3. إعداد عينة
4. الحصول على بيانات HS-SPME/GC-MS
5. تحليل كروماتوجرامات ملف تعريف GC-MS: تحديد المركبات العضوية المتطايرة وشبه الكمية
يعد التنميط عالي الإنتاجية للمركبات العضوية المتطايرة في مجموعة كبيرة من محاصيل الفاكهة المزروعة في ظل ظروف أو مواقع مختلفة أو تنتمي إلى أنماط وراثية متميزة أمرا ضروريا للتنميط الظاهري العطري الدقيق. هنا ، يتم تقديم منصة HS-SPME / GC-MS سريعة وشبه آلية للقياس الكمي النسبي للمركبات العضوية المتطايرة في أصناف الكشمش الأسود. واستند الكشف عن المركبات العضوية المتطايرة وتحديد هويتها إلى مكتبة وضعت لتحديد ملامح أنواع ثمار التوت (الجدول 1). ويبين الشكل 1 ألف صورة نموذجية متطايرة لفاكهة الكشمش الأسود الناضجة (كروماتوغرام أيون كلي) تم الحصول عليها بواسطة HS-SPME/GC-MS في الظروف المذكورة أعلاه. وفي المجموع، تم تحديد 63 مركبة عضوية متطايرة تنتمي إلى عدة فئات كيميائية، معظمها من الإسترات (27)، والألدهيدات (12)، والكحوليات (8)، والكيتونات (7)، والتربينات (5)، والفيورانات (3) (الجدول 1).
تم وصف مركبات التربينويد والإسترات ومركبات C6 بأنها تهيمن على فولاتيلوم الكشمش الأسود وأنها مهمة لرائحة الفاكهة الطازجة5,17. وبالاتفاق مع هذه الدراسات السابقة، فإن بعض القمم الأكثر وفرة التي لوحظت في الشكل 1 ألف تتوافق مع اثنين من أحاديات التربين (لينالول وتيربينيول) ومركبين من C6 ((E)-2-سداسي و (Z)-3-سداسي). وتبين أمثلة على أطياف الكتلة التي تم الحصول عليها من ملامح الكشمش الأسود ومقارنتها بأطياف المعايير التجارية البحتة بالنسبة للمعيارين (E)-2-hexenal و terpineol في الشكل 1B والشكل 1C، على التوالي.

الشكل 1: كروماتوغرام تمثيلي من فاكهة الكشمش الأسود الناضجة التي تم الحصول عليها بواسطة HS-SPME/GC-MS (من صنف "أنديغا"). (Z)-3-hexenal (وقت الاحتفاظ 14.33 دقيقة) ، (E) -2-سداسي (15.86 دقيقة) ، لينالول (21.65 دقيقة) ، وتيربينيول (24.01 دقيقة) يشار إلى القمم بالأرقام 1 و 2 و 3 و 4 ، على التوالي. (ب) الطيف الكتلي المقابل للذروة السداسية (E)-2 من شكل الكشمش الأسود ومقارنته بمعيار تجاري خالص. (ج) الطيف الكتلي المقابل لذروة التيربينول من شكل الكشمش الأسود ومقارنته بمعيار تجاري خالص. اختصار: HS-SPME/GC-MS = الاستخراج المجهري للمرحلة الصلبة في مساحة الرأس إلى جانب كروماتوغرافيا الغاز - قياس الطيف الكتلي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
في حين تم تصوير التربينات على أنها مؤشرات على نضارة فاكهة الكشمش الأسود، تعرف مركبات C6 باسم "المواد المتطايرة للأوراق الخضراء"، مما يضفي ملاحظات "خضراء" على رائحة الفاكهة والخضروات34. وبالتالي ، فإن القياس شبه الكمي لهذه المركبات العضوية المتطايرة المنبعثة من الثمار الناضجة من أنواع مختلفة من الكشمش الأسود يمكن أن يكون الخطوة الأولى في تحسين السمات المرتبطة بالنكهة. علاوة على ذلك ، نظرا لأن ظروف البيئة ونمو النبات تؤثر بشدة على محتوى المركبات العضوية المتطايرة للفاكهة ، وهو أحد العيوب الرئيسية لتربية الروائح ، كان أحد أهداف هذه الدراسة هو التحقق من صحة الفرضية القائلة بأن القياس شبه الكمي للمركبات العضوية المتطايرة المحددة في نفس الأصناف ("Ben Tron" و "Ben Gairn" و "Ben Tirran" و "Tihope") كان قابلا للتكرار في المواقع الأوروبية المتعارضة تماما مثل بولندا واسكتلندا. وكما هو متوقع، أظهر تحليل المكونات الرئيسية (PCA) لملامح المركبات العضوية المتطايرة لأربعة أصناف مختلفة من الكشمش الأسود أن البيئة تؤثر بقوة على المحتوى المتطاير، حيث يفصل المكون الرئيسي (PC) 1 العينات بناء على موقعها (الشكل 2). ومع ذلك ، يمكن ملاحظة تأثير النمط الوراثي مع PC2 ، حيث يتم فصل "Ben Tirran" بوضوح عن الأصناف المتبقية (الشكل 2).
يوضح الشكل 3 المحتوى النسبي للينالول و (E) -2-hexenal في أصناف الكشمش الأسود الأربعة التي تم تقييمها. وبالنسبة لكلا الموقعين، تم تطبيع محتوى المركبات العضوية المتطايرة إلى نفس عينة التحكم، التي أكد فيها شبه القياس الكمي أن محتوى لينالول كان أعلى عموما في بولندا منه في اسكتلندا، في حين أن (E)-2-hexenal يظهر الاتجاه المعاكس (الشكل 3). توضح هذه النتيجة التأثير البيئي على محتوى المركبات العضوية المتطايرة في ثمار الكشمش الأسود ، على الرغم من أن نسبة المتطايرين الموجودين في الأصناف الأربعة التي تم تقييمها كانت ثابتة ، حيث أظهرت أصناف "Ben Tirran" و "Ben Tron" أعلى كميات من linalool و (E) -2-hexenal ، على التوالي (الشكل 3). وتشير هذه النتائج مجتمعة إلى أن الطريقة المقترحة صالحة لمحتوى النمط الظاهري للمركبات العضوية المتطايرة، ويمكن استخدامها مع النهج الجينية لغرض تربية جودة الفاكهة.

الشكل 2: تقييم التباين بين ملامح المركبات العضوية المتطايرة في أصناف الكشمش الأسود الأربعة المزروعة في بولندا واسكتلندا. PC1 (البيئة) يفسر 46.2٪ من التباين ، في حين يساهم PC2 (النمط الوراثي) بنسبة 24.8٪ من التباين في مجموعة البيانات. الاختصارات: PCA = تحليل المكون الرئيسي; PC1 = المكون الرئيسي الأول؛ PC2 = المكون الرئيسي الثاني؛ المركبات العضوية المتطايرة = مركب عضوي متطاير. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: المحتوى النسبي لاثنين من المركبات العضوية المتطايرة التمثيلية في ملامح رائحة الكشمش الأسود - لينالول و (E) -2-سداسي ، التي يتم حصادها في اسكتلندا وبولندا. تم تقييم أربعة أصناف مختلفة من الكشمش الأسود ("بن غيرن" و "بن تيران" و "بن ترون" و "تيهوب"). تمثل الأشرطة القيم المتوسطة لنسختين متماثلتين بيولوجيتين ، وتمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري. تم إجراء مقارنات إحصائية بواسطة ANOVA أحادي الاتجاه متبوعا باختبار توكي اللاحق لتحديد الاختلافات الكبيرة في محتوى المركبات العضوية المتطايرة بين الأصناف والبلدان. بالنسبة لمحتويات المركبات العضوية المتطايرة التي تحتوي على نفس الأحرف الصغيرة (a ، ab ، b) ، لم تلاحظ أي اختلافات كبيرة عند P < 0.05. الاختصارات: المركبات العضوية المتطايرة = المركبات العضوية المتطايرة. ANOVA = تحليل التباين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الجدول 1: قائمة بالمركبات العضوية المتطايرة التي حددتها HS-SPME/GC-MS في ثمار الكشمش الأسود. يشار إلى وقت الاحتفاظ (دقيقة) ، أيون m / z المحدد لتحديد المركبات العضوية المتطايرة وشبه الكمية ، وصف الرائحة ، الفئة الكيميائية والصيغة ، ورقم CAS. الاختصارات: HS-SPME/GC-MS = الاستخراج المجهري للطور الصلب في مساحة الرأس إلى جانب كروماتوغرافيا الغاز - قياس الطيف الكتلي؛ المركبات العضوية المتطايرة = المركبات العضوية المتطايرة; KRI = مؤشر الاحتفاظ ب Kovats ؛ رقم سجل المستخلصات الكيميائية = رقم سجل خدمة المستخلصات الكيميائية. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.
ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
يتم وصف منصة استخراج الغاز والكروماتوغرافيا ذات الطور الصلب في مساحة الرأس هنا لتحديد وقياس كمية متطايرة سريعة وموثوقة وشبه آلية في ثمار الكشمش الأسود الناضجة. يمكن استخدام هذه التقنية لزيادة المعرفة حول رائحة الفاكهة واختيار الأصناف ذات النكهة المحسنة لغرض التربية.
يشكر المؤلفون الخدمات المركزية في Apoyo a la Investigación من جامعة ملقة على قياسات HS-SPME/GC-MS. ونعرب عن تقديرنا للمساعدة التي قدمتها سارة فرنانديز - بالاسيوس كامبوس في القياس الكمي المتقلب. كما نشكر أعضاء كونسورتيوم GoodBerry على توفير مواد الفاكهة.
| 10 مل برغي أعلى قوارير الفراغ | الحراري العلمي | 10-HSV | |
| 18 مم غطاء لولبي سيليكون / PTFE | Thermo Scientific | 18-MSC | |
| 5 مل أنبوب مع غطاء لولبي HDPE | VWR | 216-0153 | |
| الطرد | المركزي الحراري | العلمي 75002415 | |
| الميثانول ل HPLC | Merck | 34860-1L-R | |
| N-pentadecane (D32 ، 98٪) | مختبرات كامبريدج للنظائر | DLM-1283-1 | |
| كلوريد الصوديوم | Merck | S9888 | |
| SPME ألياف PDMS / DVB | Merck | 57345-U | |
| برطمانات طحن غير قابلة للصدأ ل TissueLyser | Qiagen | 69985 | |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | يمكن استبدالها بالهاون والمدقة أو المطحنة المبردة |
| تتبع GC كروماتوجراف الغاز-ITQ900 مطياف كتلة مصيدة الأيونات | Thermo Scientific | ||
| Triplus RSH autosampler مع جهاز SPME الآلي | Thermo Scientific | 1R77010-0450 | |
| Water for HPLC | Merck | 270733-1L | |
| Xcalibur 4.2 SP1 | Thermo Scientific | البرمجيات |