نقدم بروتوكولات لثلاث طرق مختلفة لتجانس أربع مجموعات عضلية مختلفة من الأنسجة العضلية الهيكلية للفئران لقياس ومقارنة مستويات النترات والنتريت. علاوة على ذلك ، نقارن أوزان العينات المختلفة للتحقق مما إذا كان حجم عينة الأنسجة يؤثر على نتائج التجانس.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تحضير تجانس عضلات الهيكل العظمي للفئران لقياسات النترات والنتريت
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
كان يعتقد في السابق أن أيونات النترات (NO3-) هي منتجات نهائية خاملة لعملية التمثيل الغذائي لأكسيد النيتريك (NO). ومع ذلك ، أظهرت الدراسات السابقة أنه يمكن تحويل أيونات النترات مرة أخرى إلى NO في الثدييات من خلال آلية اختزال من خطوتين: يتم تقليل النترات إلى النتريت (NO2-) في الغالب عن طريق البكتيريا المتعايشة عن طريق الفم ، ثم يتم تقليل النتريت إلى NO بواسطة عدة آليات بما في ذلك عن طريق البروتينات المحتوية على الهيم أو الموليبدينوم. يساهم مسار النترات الاختزالي هذا في تعزيز مسارات الإشارات بدون وساطة ، لا سيما في نظام القلب والأوعية الدموية وأثناء ممارسة العضلات. يتم تحديد مستويات النترات في الجسم قبل هذا الاستخدام من خلال مصدرين مختلفين: عدم الأكسدة الذاتية وتناول النترات الغذائية ، بشكل أساسي من النباتات. لتوضيح دورة NO المعقدة في الظروف الفسيولوجية ، قمنا بفحص ديناميكيات مستقلباتها وأيونات النترات والنتريت ، والتي تكون مستقرة نسبيا مقارنة ب NO. في الدراسات السابقة ، تم تحديد العضلات الهيكلية كعضو تخزين رئيسي لأيونات النترات في الثدييات ، وكذلك مصدر مباشر ل NO أثناء التمرين. لذلك ، فإن إنشاء منهجية موثوقة لقياس مستويات النترات والنتريت في العضلات الهيكلية أمر مهم ويجب أن يكون مفيدا في توسيع نطاق تطبيقه ليشمل عينات الأنسجة الأخرى. يشرح هذا البحث بالتفصيل إعداد عينات العضلات الهيكلية ، باستخدام ثلاث طرق تجانس مختلفة ، لقياسات النترات والنتريت ويناقش القضايا المهمة المتعلقة بعمليات التجانس ، بما في ذلك حجم العينات. كما تمت مقارنة تركيزات النيترات والنتريت عبر أربع مجموعات عضلية مختلفة.
المقدمة
يلعب أكسيد النيتريك (NO) ، وهو جزيء إشارات غازي صغير ، دورا مهما في العمليات الفسيولوجية والفيزيولوجية المرضية1. لا يمكن إنتاج NO من L-arginine بواسطة إنزيمات داخلية من عائلة سينسيز أكسيد النيتريك (NOS) قبل الخضوع للأكسدة السريعة للنترات (NO 3-) ، وربما النتريت (NO 2-) في الدم والأنسجة 2,3. في الآونة الأخيرة ، ثبت أن هذه الأنيونات قد تم اختزالها مرة أخرى إلى NO في أنظمة الثدييات4. يتم تحويل النترات إلى نتريت ، بشكل رئيسي عن طريق اختزال النترات البكتيرية المتعايشة في تجويف الفم التي تعمل على الأيونات التي تفرزها الغدد ال....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على بروتوكول الحيوان من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان NIDDK (ASP K049-MMB-20). تم التعامل مع الحيوانات ومعالجتها وفقا للدليل الحالي لرعاية واستخدام المختبر المتاح مجانا على موقع AAALAC.
1. جمع العضلات الهيكلية الفئران
- بينما يكون الجرذ تحت التخدير العميق (5٪ إيزوفلوران ، يؤكده رد الفعل الغائب لقرص الذيل / الساق) ، ابدأ التروية بمحلول ملحي يحتوي على الهيبارين عن طريق وضع إبرة 19 جم في قمة البطين الأيسر وعمل شق على الأذين الأيمن. اترك المحلول الملحي مع الهيبارين يتخلل الأعضاء الداخلية حتى يتدفق 1.5 لتر / كجم على الأقل عبر الأنسجة. في هذه المرحلة ، تموت الحيوانات من الاستنزاف وتكون الجثث جاهزة للمعالجة لجمع العينات.
....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
للحصول على نتائج تمثيلية ، تم استخدام أنسجة العضلات الهيكلية من 8 فئران Wistar (ذكور وإناث ، وزن 250 ± 50 جم). تم تحضير تجانس عضلات الهيكل العظمي للفئران (50 ملغ من عضلة الألوية القصوى لكل طريقة) بواسطة ثلاث أدوات تجانس مختلفة (الخالط الدوار ، الخالط الخرز ، والسحق). ثم تم تحديد محتويات النترات والنتريت لهذه التجانسات باستخدام محلل أكسيد النيتريك (NOA) (الشكل 4). كانت مستويات النترات (الشكل 4 أ) في تلك العينات الثلاث المتجانسة متشابهة جدا مع بعضها البعض ، حيث تر.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
لمراقبة التغيرات في مستقلبات NO والنترات والنتريت ، كدالة للتدخلات الفسيولوجية ، من الضروري قياس مستويات هذه الأيونات في الأعضاء المختلفة التي تعتبر حاسمة في عملية التمثيل الغذائي. نظرا لأن الهيموجلوبين في الدم سوف يتفاعل مع NO ومستقلباته ، فمن المهم أيضا إزالة الدم بسرعة من عينات الأنسجة قدر الإمكان. وهكذا تم رش الحيوانات بالمحلول الملحي قبل جمع أنسجة العضلات الهيكلية (الألوية ، TA ، EDL ، عضلة الساق) ، وتمت إزالة الأنسجة الضامة والدهون حول العضلات المستهدفة على الفور. بالنسبة لمحلول التجانس ، تم صياغة "محلول التوقف" خص.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم تضارب في المصالح. تم إدراج Alan N. Schechter كمخترع مشارك في العديد من براءات الاختراع الصادرة إلى المعاهد الوطنية للصحة لاستخدام أملاح النتريت لعلاج أمراض القلب والأوعية الدموية. يتلقى إتاوات بناء على ترخيص المعاهد الوطنية للصحة لبراءات الاختراع هذه للتطوير السريري ولكن دون تعويض آخر. لا تؤثر هذه الترتيبات على التزامه بسياسات مجلة JoVe.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من خلال منحة NIH / NIDDK الداخلية ZIA DK 0251041-14 إلى Alan N Schechter ، MD.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| gentleMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| لطيف MACS M أنبوب | Miltenyi Biotec | 130-093-236 | الطول: 87 مم ؛ قطر الدائرة: 30 مم |
| هيبارين الصوديوم | Hospira | NDC-0409-7620-13 | |
| Isoflurane | Baxter | NDC-10019-360-60 | |
| Methanol | Sigma | 646377 | |
| Minilys Bead homogenizer | Bertin Instruments | P000673-MLYS0-A | |
| NEM ؛ N-ethylmaleimide | Sigma | 4260 | |
| محلل أكسيد النيتريك | GE | Sievers NOA 280i | |
| NP-40 ؛ 4-Nonylphenyl polyethylene glycol | Sigma | 74385 | |
| فيريسيانيد البوتاسيوم ؛ K3Fe (CN) 6 | Sigma | 702587 | |
| Precellys طقم التحلل | يحتوي Bertin Instruments | P000911-LYSK0-A | على أنابيب 2 مل مع حبات سيراميك 2.8 مم (أكسيد الزركونيوم) للتجانس |
| طقم الطاحن | مجموعة كسارة |
المراجع
- Ignarro, L. J. Nitric oxide as a unique signaling molecule in the vascular system: a historical overview. Journal of Physiology and Pharmacology. 53 (4), Pt 1 503-514 (2002).
- Moncada, S., Higgs, A. The L-arginine-nitric oxide pathway. New....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
