Method Article

Confocal الليزر المسح المجهري القائم على التحليل الكمي من Aspergillus fumigatus كونيديا التوزيع في كامل جبل تطهيرها بصريا الرئة الماوس

DOI:

10.3791/62436

⸱

September 18th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Research Center for Molecular Mechanisms of Aging and Age-Related Diseases, Moscow Institute of Physics and Technology, 2Department of Immunology, Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, 3Institute of Biological Information Processing (IBI-7: Structural Biochemistry), Forschungszentrum Jülich

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن نصف طريقة التحليل الكمي لتوزيع أسبرجريلوس فوميديا (3 ميكرومتر في الحجم) في الشعب الهوائية للفئران. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة لتحليل الجسيمات الدقيقة وتوزيع الجسيمات النانوية في الشعب الهوائية في مختلف نماذج الحالة المرضية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أسبرجريلوس فوميديا هي مسببات الأمراض المحمولة جوا التي يمكن أن تخترق الشعب الهوائية البشرية. الأشخاص الذين يعانون من نقص المناعة دون حساسية يظهرون مقاومة وتسامحا مناعيا ، بينما في المرضى الذين يعانون من نقص المناعة ، يمكن أن تستعمر كونيديا الشعب الهوائية وتسبب اضطرابات تنفسية غازية شديدة. وتشارك خلايا مختلفة في مقصورات مجرى الهواء المختلفة في الاستجابة المناعية التي تمنع الغزو الفطري. ومع ذلك ، فإن الجوانب الزمنية للتخلص من مسببات الأمراض لا تزال غير مفهومة تماما. يسمح التصوير ثلاثي الأبعاد (ثلاثي الأبعاد) للأعضاء الكاملة التركيب التي تم تطهيرها بصريا ، وخاصة رئتي الفئران التجريبية ، بالكشف عن مسببات الأمراض المسماة بالفلورسنت في الشعب الهوائية في نقاط زمنية مختلفة بعد العدوى. في هذه الدراسة، ونحن نصف الإعداد التجريبي لإجراء تحليل كمي لتوزيع A. fumigatus كونيديا في الشعب الهوائية. باستخدام المجهر الليزر confocal الفلورسنت المسح الضوئي (CLSM)، تتبعنا موقع كونيديا المسمى الفلورسنت في فروع الشعب الهوائية ومقصورة الحويصلات الهوائية 6 ساعات بعد تطبيق البلعوم الأوروفاري إلى الفئران. وقد استخدم النهج الموصوف هنا في السابق للكشف عن موقع مسببات الأمراض الدقيق وتحديد الخلايا المتفاعلة مع مسببات الأمراض في مراحل مختلفة من الاستجابة المناعية. يمكن استخدام الإعداد التجريبي لتقدير حركية القضاء على مسببات الأمراض في حالات مرضية مختلفة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على أساس يومي ، يستنشق الناس مسببات الأمراض المحمولة جوا ، بما في ذلك جراثيم الفطريات الانتهازية Aspergillus fumigatus (A. fumigatus conidia) التي يمكن أن تخترق الجهاز التنفسي1. الجهاز التنفسي للثدييات هو نظام من الخطوط الجوية من مختلف الأجيال التي تتميز بهياكل مختلفة من جدران مجرى الهواء2،3،4. تتكون جدران القصبة الهوائية من عدة أنواع من الخلايا من بينها خلايا ciliated التي توفر إزالة المخاطية5. في الحويصلات الهوائية ، لا توجد خلايا ciliated ولا يمكن القضاء على مسببات الأمراض الفضائية السنفية المخترقة عن طريق إزالة المخ والخلايا6. وعلاوة على ذلك، كل جيل مجرى الهواء هو مكانة لتجمعات متعددة من الخلايا المناعية ومجموعات فرعية من هذه المجموعات السكانية هي فريدة من نوعها لبعض مقصورات مجرى الهواء. وهكذا، الضامة الحويصلات الموجودة في مقصورات السنف، في حين تصطف كل من القصبة الهوائية والممرات الهوائية موصل مع الخلايا التغصنية داخل الظهارة7،8.

الحجم التقريبي لل A. fumigatus كونيديا هو 2-3.5 ميكرومتر9. وبما أن قطر الشعب الهوائية الصغيرة في البشر وحتى في الفئران يتجاوز 3.5 ميكرومتر ، فقد اقترح أن كونيديا يمكن أن تخترق الفضاء الحويصلات2،10،11. في الواقع ، أظهر الفحص النسيجي النمو الفطري في الحويصلات الهوائية للمرضى الذين يعانون من داء الرشاشيات12. كما تم الكشف عن كونيديا في الحويصلات الهوائية من الفئران المصابة باستخدام التصوير الحي لشرائح الرئة سميكة13. في وقت واحد ، تم الكشف عن كونيديا في الجانب الإنارة من ظهارة الشعب الهوائية للفئران14.

ثلاثي الأبعاد (3D) التصوير من مسح بصريا كامل جبل الماوس الرئتين يسمح التحليل المورفومتري للخطوط الجوية15. على وجه الخصوص ، تم إجراء التحليل الكمي لتوزيع العصب الجنبي الحشوي باستخدام عينات الرئة الماوس مسح بصريا15. في الآونة الأخيرة ، حقق Amich وآخرون16 في النمو الفطري بعد تطبيق كونيديا داخل الجهاز الداخلي على الفئران المنقوصة المناعية باستخدام مجهر مضان خفيف الورقة لعينات الرئة الماوس مسحت بصريا. الموقع الدقيق للكونيديا يستريح في الشعب الهوائية في نقاط زمنية مختلفة بعد العدوى مهم لتحديد مجموعات الخلايا التي يمكن أن توفر ما يكفي من الدفاع المضاد للفطريات في مراحل معينة من الالتهاب. ومع ذلك ، نظرا للحجم الصغير نسبيا ، فإن الجوانب الزمنية للتبخير A. conidia التوزيع في الشعب الهوائية هي سيئة الخصائص.

هنا، نقدم إعداد تجريبي للتحليل الكمي لتوزيع A. fumigatus كونيديا في الشعب الهوائية للفئران المصابة. باستخدام المجهر الليزر confocal الفلورسنت المسح الضوئي (CLSM) من الرئتين تطهيرها بصريا من الفئران التي تلقت تطبيق البلعوم من الفلورسنت المسمى A. fumigatus كونيديا، نحصل على صور 3D وإجراء معالجة الصور. باستخدام التصوير ثلاثي الأبعاد لفص الرئة كامل الجبل ، أظهرنا سابقا توزيع A. fumigatus conidia في مجرى الهواء لإجراء الفئران بعد 72 ساعة من تطبيق كونيديا8.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع الطرق المتعلقة بحيوانات المختبرات الموصوفة هنا من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) في معهد شيمياكين وأوفتشينيكوف للكيمياء العضوية الحيوية، الأكاديمية الروسية للعلوم (البروتوكول رقم 226/2017).

1. A. تطبيق فوميداتوس كونيديا

  1. للحصول على المسمى الفلورسنت A. fumigatus كونيديا، إصلاح 5 × 108 كونيديا بإضافة 1 مل من 3٪ بارافورمالديهايد إلى بيليه كونيديا. احتضان في أنبوب اختبار 50 مل لمدة 2 ساعة على شاكر في درجة حرارة الغرفة.
  2. غسل كونيديا مع 20 مل من المالحة العازلة الفوسفات (PBS): الطرد المركزي في 1000 × ز لمدة 15 دقيقة، وإزالة بلطف supernatant، وإضافة برنامج تلفزيوني جديد في حجم 20 مل. كرر.
  3. حل كونيديا في 900 ميكرولتر من 0.1 M NaHCO3.
  4. حل إستر succinimidyl من صبغة الفلورسنت نانومتر 594 في 100 ميكرولتر من كبريتيد ثنائي ميثيل وإضافة إلى كونيديا.
  5. احتضان كونيديا مع صبغة لمدة 1 ساعة على شاكر في 150 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  6. غسل كونيديا مرتين مع 20 مل من برنامج تلفزيوني في الطرد المركزي في 1000 × ز لمدة 15 دقيقة.
  7. تمييع كونيديا إلى تركيز 1 × 108 كونيديا / مل في برنامج تلفزيوني وتخزينها في 4 درجة مئوية.
  8. تخدير الماوس مع بخار isoflurane 0.5-3٪. وضع الماوس على حامل، وإصلاح اللسان مع ملقط على نحو سلس، وعقد nares. تأخذ ماصة قناة واحدة وتطبيق 50 ميكرولتر من تعليق كونيديا إلى البلعوم الماوس. انتظر حتى يتم استنشاق التعليق.

2. إعداد العينة

  1. إعداد أنبوب اختبار 50 مل وملئه مع 15 مل من 2٪ بارافورمالديهايد الطازجة. ضع الأدوات الطبية (15 سم ملقط تشريح مسنن ، و 8 سم ملقط ذو رؤوس ناعمة ، ومقص 10 سم مع أطراف حادة) في محلول الإيثانول بنسبة 70٪.
  2. قتل الفأرة وفقا لبروتوكول IACUC. ثم ضع الماوس في الموضع الظهري وإصلاح كفوف الماوس بالإبر.
    ملاحظة: إذا كنت تستخدم خلع عنق الرحم للقتل الرحيم، فتأكد من سلامة القصبة الهوائية.
    1. علاج الماوس مع الإيثانول 70٪ باستخدام بخاخ.
    2. جعل متوسط قطع طولي في الجلد البطني من الكفوف الخلفية إلى الشقوق والذقن.
    3. فصل الجلد عن الأنسجة تحت الجلد باستخدام ملقط مسنن ومقص مغلق. إصلاح الأطراف العليا من الجلد مع الإبر.
    4. إجراء شق في جدار البطن وفصل الكبد من الحجاب الحاجز. اختر الحجاب الحاجز بعناية بمقص مغلق ثم اقطع الحجاب الحاجز.
    5. جعل قطع وسيطة من الصدر والأنسجة الضامة الرقبة حتى القصبة الهوائية مرئية.
  3. تشغيل خيط الحرير تحت القصبة الهوائية وجعل عقدة الجراحية باستخدام ملقطين اثنين.
    ملاحظة: بدلا من ذلك، استخدم خيط تنظيف الأسنان بدلا من الخيط الحريري.
    1. سحب بعناية الخيط وقطع الرئتين من النسيج الضام مع مقص. عقد مقص عمودي على الطاولة.
    2. وضع الرئتين في أنبوب اختبار 50 مل مع 2٪ بارافورمالديهايد. ترك الخيط ينتهي خارج الأنبوب، ووضع غطاء ضيق، وتسليم أنبوب لتغطية الرئتين مع paraformaldehyde. أمسك الرئتين بين عشية وضحاها عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  4. تشريح فصوص الرئة من القلب وبعضها البعض مع مشرط.
    1. وضع فصوص الرئة في لوحة بئر 24، مع كل فص في بئر منفصلة. اغسل فصوص الرئة في 1 مل من درجة الحموضة المالحة (TBS) العازلة من تريس 7.4، 5 مرات لمدة ساعة واحدة لكل منها على شاكر عند 150 دورة في الدقيقة.
    2. استبدال 1 مل من TBS مع 1 مل من العازلة حجب (1٪ تريتون X 100، 5٪ مسحوق الحليب في TBS) وترك العينة بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة على شاكر.
    3. استبدال العازلة حجب مع 1 مل من streptavidin-488-nm الفلوركروم المصاحبة المخفف 1:30 في TBS. ترك العينة لمدة 72 ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة على شاكر (150 دورة في الدقيقة).
  5. غسل العينة 5 مرات لمدة 1 ساعة لكل منهما في 1 مل من TBS في درجة حرارة الغرفة على شاكر (150 دورة في الدقيقة). نقل العينة إلى الآبار الجديدة وتغطيتها مع 2٪ paraformaldehyde بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية لما بعد التثبيت.

3. الماوس الرئة الفص الضوئي المقاصة

  1. ضع العينة في زجاجة 5 مل مليئة 3 مل من محلول الميثانول والمياه بنسبة 50٪ ووضعها على خلاط العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.
  2. استبدال 3 مل من الميثانول 50٪ مع 3 مل من الميثانول 100٪ ووضعها على خلاط عينة لمدة 2 ساعة. إعداد خليط 1:2 v/v من الكحول البنزيل والبنزيل بنزوات (BABB) في حجم إجمالي قدره 1 مل.
  3. نقل العينة إلى لوحة بئر 24 وتغطي مع 1 مل من خليط BABB لمدة 30 دقيقة على الأقل. لا تترك العينة في BABB لفترة طويلة. BABB يمكن أن تلحق الضرر لوحة بلاستيكية وجعل العينة جامدة جدا.
  4. وضع العينة في غرفة تغطية تصوير الخلية القاع. العينة جاهزة للتصوير.

4. الماوس تصوير فص الرئة مع CLSM

  1. تشغيل نظام المجهر. افتح برنامج المجهر. تشغيل ضوء الإرسال في علامة التبويب تحديد موقع. حدد الهدف 10x.
    ملاحظة: للحصول على تحليل أكثر تفصيلا، استخدم الهدف 20x، ولكنه يزيد من وقت التجربة وحجم ملف الصورة.
  2. وضع الغرفة مع العينة في حامل الشريحة الغطاء. وضع حامل على المرحلة XY على الهدف. مركز العينة باستخدام عناصر التحكم XY من المرحلة على رأس الهدف. استخدام ضوء انتقال والعين للعثور على العينة يدويا Z-الطائرة.
  3. قم بتبديل البرنامج إلى علامة التبويب اكتساب. حدد CLSM λ-الوضع. تشغيل الليزر 488 نانومتر و 561 نانومتر. حدد مرآة 488/561 نانومتر ديكهروي. تغيير النطاق الطيفي للكاشف إلى 490-695 نانومتر. ضبط طاقة الليزر إلى النطاق المناسب (10-50 ميكرو واط). ضبط كسب كاشف بين نطاق 750-900.
    ملاحظة: إعدادات كسب أعلى غير مرغوب فيه بسبب الضوضاء.
  4. تضييق الثقب إلى وحدة متجدد الهواء 1 عن طريق النقر على زر 1 الاتحاد الافريقي. تعيين دقة بكسل إلى 512 × 512 بكسل.
  5. قم بتشغيل وضع المكدس Z. بدء التصوير الحي. حدد المستوى البؤري الذي تكون فيه الصبغتان مرئيتين.
    ملاحظة: إذا لزم الأمر، ضبط قوة الليزر لتطبيع سطوع اثنين من الأصباغ الفلورية. استخدم وضع المعرض والقناة الواحدة لتجنب القص ولمضاهاة كثافة الفلورسينس بدقة.
  6. قم بتوسيع الجزء Z-المكدس ظهرت. استخدام عجلة التركيز والعثور على أدنى مستوى من العينة. استخدم الزر الأول في جزء المكدس Z. تحريك الطائرة المحورية صعودا للعثور على الحد العلوي للعينة وحفظ الموقف باستخدام الزر الأخير. تحقق من تمثيل عمق العينة في جزء المكدس Z.
    ملاحظة: تمثيل عمق العينة ستظهر في جزء المكدس Z بعد الأول و يتم اختيار المواضع الأخيرة.
  7. ضع الهدف باستخدام عجلة التركيز بالقرب من أسفل العينة ، من خلال النظر إلى جزء Z-stack. هذا هو ما يقرب من 20 ميكرومتر من الجزء السفلي من العينة.
  8. قم بإيقاف تشغيل وضع Z-stack ثم قم بتشغيل وضع فحص التجانب. الحصول على الصورة مع عدد مناسب من البلاط لحجم العينة. 5 × 5 البلاط هي نقطة انطلاق جيدة.
  9. ضبط عدد البلاط ووضع XY العينة حتى الرئة كلها يناسب داخل الصورة البلاط. إعادة فحص صحة مواضع المكدس Z مع موضع XY الذي تم الحصول عليه حديثا من مركز العينة.
  10. تشغيل كل من Z-المكدس و وضعي مسح Tile. تعيين Z الخطوة (في جزء المكدس Z) إلى 5 ميكرومتر. تعيين سرعة المسح الضوئي إلى 6. تشغيل وظيفة الحفظ التلقائي. تشغيل الخيار حفظ البلاط منفصلة على. اسم الملف. اضغط على الزر بدء التجربة.
  11. تحقق من أن التجربة لا تتجاوز الوقت المخصص على المجهر؛ إذا كان الأمر كذلك -- ضبط السرعة.
    ملاحظة: حجم الملف التقريبي هو أكثر من 10 غيغابايت; تأكد من أن هناك مساحة كافية على القرص الصلب.

5. الطيفية اللطاطة وخياطة

  1. استخدم البرنامج لمعالجة الصور الأولية. للحصول على الطيات الطيفية، حدد خيار Unmixing. حدد منطقتين المقابلة لstrptavidin / الخطوط الجوية وconidia للحصول على الأطياف من الصورة. انقر فوق بدء التشغيل في إعادة التشغيل.
    ملاحظة: بدلا من ذلك، استخدم الأطياف الموجودة لفلوروشرومس 488 و 594 نانومتر.
  2. افتح الملف لمعالجة الصور وحدد علامة التبويب معالجة. في قسم الأساليب، حدد الهندسية والخياطة. في المقطع المعلمة حدد الإخراج الجديد ووضع علامة على الخيار "تجانب الصمامات". استخدم الوضع المرجعي مع القناة المحددة المطابقة لفلورة مجرى الهواء. تطبيق خياطة بالنقر فوق تطبيق.

6. معالجة الصور: تقديم السطح

  1. افتح الصورة كعرض تجاوز ثلاثي الأبعاد. إنشاء سطح مجرى الهواء باستخدام خيار Surface للقناة التي تم استخدامها لتصور مجرى الهواء. اختر معلمة التجانس التي 10 ميكرومتر.
    ملاحظة: اختر قيمة العتبة التلقائية أيضا.
  2. فحص بصريا السطح. اختر العتبات لتقليل الإشارة الخارجة. إزالة أسطح الجنب والأوعية.
  3. إنشاء قناع لسطح مجرى الهواء باستخدام خيارات تحرير وقناع الكل. حدد قناة مجرى الهواء وتعيين Voxels خارج السطح إلى 0.001.
  4. حفظ الملف مع قناع مجرى الهواء كسلسلة TIFF إلى المجلد. حفظ الملف مع قناة كونيديا كسلسلة TIFF إلى مجلد منفصل.

7. معالجة الصور: تصحيح القناع

  1. افتح الملف باستخدام قناع مجرى الهواء في منصة مفتوحة المصدر لتحليل الصور البيولوجية17 كصورة 8 بت. جعل الصورة ثنائية بالنقر فوق عملية | | ثنائي جعل ثنائي.
    ملاحظة: إذا لزم الأمر، تصحيح القناع: إزالة الأسطح الزائدة باستخدام تحديد المضلع وحذف علامة التبويب. بدلا من ذلك، استخدم أداة تعبئة الفيضانات.
  2. رسم السطوح المفقودة باستخدام عدة مرات توسيع (3D): انقر فوق الإضافات | | العملية تمدد (3D). ملء الثقوب عن طريق النقر على عملية | | ثنائي ملء الثقوب. استخدم التحديد والإنتربول مدير عائد الاستثمار لملء الثقوب المتبقية في القناع يدويا. تطبيق العديد من الخيارات تآكل (3D) (الإضافات | | العملية تآكل (3D)) لإعادة دمج سمك القناع.
    ملاحظة: إنشاء وحدات الماكرو باستخدام الإضافات | خيارات وحدات الماكرو لتوسعات متعددة (3D) وتآكل (3D) يكرر.
    تأكد من أن عدد Erode (3D) يساوي عدد تطبيقات تمدد (3D).
  3. حفظ القناع في مجلد جديد كسلسلة TIFF.

8. كونيديا التحليل الكمي

  1. افتح التطبيق في منصة البرمجة والحوسبة الرقمية: https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/84525-conidia_counter.
  2. اضغط على الزر إضافة ملفات. حدد مجلد قناع مجرى الهواء والمجلد كونيديا.
  3. تعيين عتبة مخصصة بين 0 و 1. اضغط على الزر موافق.
  4. حفظ جدول الإخراج إلى ملف .xls المخصص.
  5. تحليل البيانات باستخدام برنامج للتحليل الإحصائي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بعد البروتوكول أعلاه، تم الحصول على الصورة ثلاثية الأبعاد التي تظهر الشعب الهوائية وA. fumigatus كونيديا في فص الرئة من الماوس(الشكل 1A). Streptavidin (التي كانت تستخدم لتصور مجرى الهواء) وصفت القصبات الهوائية والشعب الهوائية15. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تصور السفن الكبيرة ، والتي يمكن تمييزها بسهولة عن الشعب الهوائية من خلال مورفولوجيا ، وpleura في قناة مجرى الهواء(الشكل 1A-C). وسمح إنشاء سطح مجرى الهواء وقناع إزال...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يسمح التصوير ثلاثي الأبعاد لكامل الأعضاء بالحصول على البيانات دون تشريح العينة ، وهو أمر ذو أهمية كبيرة للتحقيق في الجوانب المكانية للتوزيع التشريحي للمسبب الممرض في الكائن الحي. هناك العديد من التقنيات والتعديلات من الأنسجة البصرية المقاصة التي تساعد على التغلب على ضوء الليزر التشتت والسماح للتصوير كامل الجهاز15،16،18،19. وتتكون إحدى طرق إزالة الأنسجة المخصصة من جفاف الأنسجة القائم على الميثان...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ولا يبلغ المؤلفان عن أي تضارب في المصالح في هذا العمل.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكر المؤلفون البروفيسور سفين كرابمان (المستشفى الجامعي إرلانغن وFUA Erlangen-Nürnberg، ألمانيا) على توفير سلالة أسبرجيلوس فوميديا AfS150. يشكر المؤلفون المكتب الصحفي ل MIPT. V.B تعترف وزارة العلوم والتعليم العالي في الاتحاد الروسي (#075-00337-20-03، مشروع FSMG-2020-0003). تم دعم العمل المتعلق بالتصوير والتحديد الكمي ل A. fumigatus conidia من قبل RSF No 19-75-00082. تم دعم العمل المتعلق بتصوير الخطوط الجوية من قبل RFBR No 20-04-60311.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 594 NHS EsterThermoFisherA20004
Aspergillus fumigatus< / em> conidiaATCC46645السلالة AfS150 ، مشتق ATCC 46645
كحول البنزيلPanreac141081.161198.0-100
بنزوات البنزيلAcrosAC10586-001099 +٪
C57Bl / 6 فئرانPushchino Animal مركز التربية (روسيا)ذكر.
القسطرةVenisystemsG715-A0118G
غطاء تصوير الخليةغرفة سفلية زجاجيةEppendorf307420284 أو 8 غرفة آبار مع غطاء زجاجي قاع
جهاز طرد مركزيEppendorf5804Rيمكن استخدام أي جهاز طرد مركزي مزود 1000 جم يمكن استخدام
مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤرZEISS ZEISSLSM780
ثنائي ميثيل سلفوكسيدسيجما ألدريتش276855 99.9٪
حزمة معالجة الصور فيجيبرنامج مجانيFIJI
ملقطB. Braun AesculapBD557R
ملقطB. Braun AesculapBD321Rملقط ناعم
الرأس Bochem1727زجاجية ناعمة
DURAN242101304مع غطاء أرضي
محرر رسومات فوتوشوبAdobe IncPhotoshop CS
GraphPad SoftwareGraphPadPrism 8
Imaris Microscopy ImagingSoftware Oxford Instrumentsنسخة تجريبية مجانية متاحة https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial
IsofluraneKarizoo
NaHCO3Panreac141638
الهدفZEISS420640-9800-000  Plan-Apochromat ، 10 مرات ؛ (NA = 0.3)
بارافورمالدهايدسيجما ألدريتش158127
PBSPanecoP060 & Pi ؛
ماصةProLine722020من 5 إلى 50 & L
حليب مجففروثT145.2
خلاط عينةDynalMXIC1
مقصB. BraunBC257RBlunt
ShakerApexlabGS-2050-300 دورة في الدقيقة
SkalpelBochem12646
خيط حريريB. Braun3 USP
Streptavidin ، Alexa Fluor 488 ThermoFisherS11223
SPL Lifesciences5005050 مل
تريس (هيدروكسي ميثيل أمينوميثان)هيليكونH-1702-0.5  ؛ السيد 121.14; رقم سجل المستخلصات الكيميائية: 77-86-1
Triton X-100AmrescoAm-O694-0.1
برنامج مجهرZEN ZEISSZEN2012 SP5https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen.html
٪ مسنن زجاجة Adobe أنبوب اختبار

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. O'Gorman, C. M. Airborne Aspergillus fumigatus conidia: A risk factor for aspergillosis. Fungal Biology Reviews. 25 (3), 151-157 (2011).
  2. Hyde, D. M., et al. Asthma: A comparison of animal models using stereological methods. European Respiratory Review. 15 (101), 122-135 (2006).
  3. Alanis, D. M., Chang, D. R., Akiyama, H., Krasnow, M. A., Chen, J. Two nested developmental waves demarcate a compartment boundary in the mouse lung. Nature Communications. 5, (2014).
  4. Kleinstreuer, C., Zhang, Z., Donohue, J. F. Targeted drug-aerosol delivery in the human respiratory system. Annual Review of Biomedical Engineering. 10, (2008).
  5. Bustamante-Marin, X. M., Ostrowski, L. E. Cilia and mucociliary clearance. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (4), (2017).
  6. Fröhlich, E., Salar-Behzadi, S. Toxicological assessment of inhaled nanoparticles: Role of in vivo, ex vivo, in vitro, and in Silico Studies. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 4795-4822 (2014).
  7. Patel, V. I., Metcalf, J. P. Airway macrophage and dendritic cell subsets in the resting human lung. Critical Reviews in Immunology. 38 (4), 303-331 (2018).
  8. Bogorodskiy, A. O., et al. Murine intraepithelial dendritic cells interact with phagocytic cells during Aspergillus fumigatus-Induced Inflammation. Frontiers in Immunology. 11, (2020).
  9. Kwon-Chung, K. J., Sugui, J. A. Aspergillus fumigatus-what makes the species a ubiquitous fuman fungal pathogen. PLoS Pathogens. 9 (12), 1-4 (2013).
  10. Overton, N., Gago, S., Bowyer, P. Immunogenetics of chronic and allergic aspergillosis. Immunogenetics of Fungal Diseases. , 153-171 (2017).
  11. Thiesse, J., et al. Lung structure phenotype variation in inbred mouse strains revealed through in vivo micro-CT imaging. Journal of Applied Physiology. 109 (6), 1960-1968 (2010).
  12. Tochigi, N., et al. Histopathological implications of Aspergillus infection in lung. Mediators of Inflammation. 2013, (2013).
  13. Bruns, S., et al. Production of extracellular traps against aspergillus fumigatus in vitro and in infected lung tissue is dependent on invading neutrophils and influenced by hydrophobin rodA. PLoS Pathogens. 6 (4), 1-18 (2010).
  14. Shevchenko, M. A., et al. Aspergillus fumigatus infection-induced neutrophil recruitment and location in the conducting airway of immunocompetent, neutropenic, and immunosuppressed mice. Journal of Immunology Research. 2018, 5379085(2018).
  15. Scott, G. D., Blum, E. D., Fryer, A. D., Jacoby, D. B. Tissue optical clearing, three-dimensional imaging, and computer morphometry in whole mouse lungs and human airways. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 1 (51), 43-55 (2014).
  16. Amich, J., et al. Three-dimensional light sheet fluorescence microscopy of lungs to dissect local host immune-aspergillus fumigatus interactions. mBio. 11 (1), (2020).
  17. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  18. Li, W., Germain, R. N., Gerner, M. Y. High-dimensional cell-level analysis of tissues with Ce3D multiplex volume imaging. Nat Protoc. 14 (6), 1708-1733 (2019).
  19. Ertürk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. J Vis Exp. (89), e51382(2014).
  20. Kuhn, C. Biotin stores in rodent lungs: Localization to Clara and type II alveolar cells. Experimental Lung Research. 14 (4), 527-536 (1988).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Confocal Laser MicroscopyAspergillus Fumigatus ConidiaOptical ClearingMouse Lung ImagingQuantitative AnalysisAirway DistributionThree Dimensional ImagingSpectral UnmixingAirway MaskingImmune Response

Related Articles