Method Article

Confocal الليزر المسح المجهري القائم على التحليل الكمي من Aspergillus fumigatus كونيديا التوزيع في كامل جبل تطهيرها بصريا الرئة الماوس

DOI:

10.3791/62436

⸱

September 18th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Research Center for Molecular Mechanisms of Aging and Age-Related Diseases, Moscow Institute of Physics and Technology, 2Department of Immunology, Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, 3Institute of Biological Information Processing (IBI-7: Structural Biochemistry), Forschungszentrum Jülich

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن نصف طريقة التحليل الكمي لتوزيع أسبرجريلوس فوميديا (3 ميكرومتر في الحجم) في الشعب الهوائية للفئران. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة لتحليل الجسيمات الدقيقة وتوزيع الجسيمات النانوية في الشعب الهوائية في مختلف نماذج الحالة المرضية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أسبرجريلوس فوميديا هي مسببات الأمراض المحمولة جوا التي يمكن أن تخترق الشعب الهوائية البشرية. الأشخاص الذين يعانون من نقص المناعة دون حساسية يظهرون مقاومة وتسامحا مناعيا ، بينما في المرضى الذين يعانون من نقص المناعة ، يمكن أن تستعمر كونيديا الشعب الهوائية وتسبب اضطرابات تنفسية غازية شديدة. وتشارك خلايا مختلفة في مقصورات مجرى الهواء المختلفة في الاستجابة المناعية التي تمنع الغزو الفطري. ومع ذلك ، فإن الجوانب الزمنية للتخلص من مسببات الأمراض لا تزال غير مفهومة تماما. يسمح التصوير ثلاثي الأبعاد (ثلاثي الأبعاد) للأعضاء الكاملة التركيب التي تم تطهيرها بصريا ، وخاصة رئتي الفئران التجريبية ، بالكشف عن مسببات الأمراض المسماة بالفلورسنت في الشعب الهوائية في نقاط زمنية مختلفة بعد العدوى. في هذه الدراسة، ونحن نصف الإعداد التجريبي لإجراء تحليل كمي لتوزيع A. fumigatus كونيديا في الشعب الهوائية. باستخدام المجهر الليزر confocal الفلورسنت المسح الضوئي (CLSM)، تتبعنا موقع كونيديا المسمى الفلورسنت في فروع الشعب الهوائية ومقصورة الحويصلات الهوائية 6 ساعات بعد تطبيق البلعوم الأوروفاري إلى الفئران. وقد استخدم النهج الموصوف هنا في السابق للكشف عن موقع مسببات الأمراض الدقيق وتحديد الخلايا المتفاعلة مع مسببات الأمراض في مراحل مختلفة من الاستجابة المناعية. يمكن استخدام الإعداد التجريبي لتقدير حركية القضاء على مسببات الأمراض في حالات مرضية مختلفة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على أساس يومي ، يستنشق الناس مسببات الأمراض المحمولة جوا ، بما في ذلك جراثيم الفطريات الانتهازية Aspergillus fumigatus (A. fumigatus conidia) التي يمكن أن تخترق الجهاز التنفسي1. الجهاز التنفسي للثدييات هو نظام من الخطوط الجوية من مختلف الأجيال التي تتميز بهياكل مختلفة من جدران مجرى الهواء2،3،4. تتكون جدران القصبة الهوائية من عدة أنواع من الخلايا من بينها خلايا ciliated التي توفر إزالة المخاطية5. في الحويصلات الهوائية ، لا توجد خلايا ciliated ولا يمكن القضاء على مسببات الأمراض الفضائية السنفية المخترقة عن طريق إ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع الطرق المتعلقة بحيوانات المختبرات الموصوفة هنا من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) في معهد شيمياكين وأوفتشينيكوف للكيمياء العضوية الحيوية، الأكاديمية الروسية للعلوم (البروتوكول رقم 226/2017).

1. A. تطبيق فوميداتوس كونيديا

  1. للحصول على المسمى الفلورسنت A. fumigatus كونيديا، إصلاح 5 × 108 كونيديا بإضافة 1 مل من 3٪ بارافورمالديهايد إلى بيليه كونيديا. احتضان في أنبوب اختبار 50 مل لمدة 2 ساعة على شاكر في درجة حرارة الغرفة.
  2. غسل كونيديا مع 20 مل من المالحة العازلة الفوسفات (PBS): الطرد المركزي في 1000 × ز لمدة 15 دقيقة، وإزالة بلطف supernatant، وإضافة برنام....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بعد البروتوكول أعلاه، تم الحصول على الصورة ثلاثية الأبعاد التي تظهر الشعب الهوائية وA. fumigatus كونيديا في فص الرئة من الماوس(الشكل 1A). Streptavidin (التي كانت تستخدم لتصور مجرى الهواء) وصفت القصبات الهوائية والشعب الهوائية15. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تصور السفن الكبيرة ، والتي يمكن تمييزها بسهولة عن الشعب الهوائية من خلال مورفولوجيا ، وpleura في قناة مجرى الهواء(الشكل 1A-C). وسمح إنشاء سطح مجرى الهواء وقناع إزال.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يسمح التصوير ثلاثي الأبعاد لكامل الأعضاء بالحصول على البيانات دون تشريح العينة ، وهو أمر ذو أهمية كبيرة للتحقيق في الجوانب المكانية للتوزيع التشريحي للمسبب الممرض في الكائن الحي. هناك العديد من التقنيات والتعديلات من الأنسجة البصرية المقاصة التي تساعد على التغلب على ضوء الليزر التشتت والسماح للتصوير كامل الجهاز15،16،18،19. وتتكون إحدى طرق إزالة الأنسجة المخصصة من جفاف الأنسجة القائم على الميثان.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ولا يبلغ المؤلفان عن أي تضارب في المصالح في هذا العمل.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكر المؤلفون البروفيسور سفين كرابمان (المستشفى الجامعي إرلانغن وFUA Erlangen-Nürnberg، ألمانيا) على توفير سلالة أسبرجيلوس فوميديا AfS150. يشكر المؤلفون المكتب الصحفي ل MIPT. V.B تعترف وزارة العلوم والتعليم العالي في الاتحاد الروسي (#075-00337-20-03، مشروع FSMG-2020-0003). تم دعم العمل المتعلق بالتصوير والتحديد الكمي ل A. fumigatus conidia من قبل RSF No 19-75-00082. تم دعم العمل المتعلق بتصوير الخطوط الجوية من قبل RFBR No 20-04-60311.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 594 NHS EsterThermoFisherA20004
Aspergillus fumigatus< / em> conidiaATCC46645السلالة AfS150 ، مشتق ATCC 46645
كحول البنزيلPanreac141081.161198.0-100
بنزوات البنزيلAcrosAC10586-001099 +٪
C57Bl / 6 فئرانPushchino Animal مركز التربية (روسيا)ذكر.
القسطرةVenisystemsG715-A0118G
غطاء تصوير الخليةغرفة سفلية زجاجيةEppendorf307420284 أو 8 غرفة آبار مع غطاء زجاجي قاع
جهاز طرد مركزيEppendorf5804Rيمكن استخدام أي جهاز طرد مركزي مزود 1000 جم يمكن استخدام
مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤرZEISS ZEISSLSM780
ثنائي ميثيل سلفوكسيدسيجما ألدريتش276855 99.9٪
حزمة معالجة الصور فيجيبرنامج مجانيFIJI
ملقطB. Braun AesculapBD557R
ملقطB. Braun AesculapBD321Rملقط ناعم
الرأس Bochem1727زجاجية ناعمة
DURAN242101304مع غطاء أرضي
محرر رسومات فوتوشوبAdobe IncPhotoshop CS
GraphPad SoftwareGraphPadPrism 8
Imaris Microscopy ImagingSoftware Oxford Instrumentsنسخة تجريبية مجانية متاحة https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial
IsofluraneKarizoo
NaHCO3Panreac141638
الهدفZEISS420640-9800-000  Plan-Apochromat ، 10 مرات ؛ (NA = 0.3)
بارافورمالدهايدسيجما ألدريتش158127
PBSPanecoP060 & Pi ؛
ماصةProLine722020من 5 إلى 50 & L
حليب مجففروثT145.2
خلاط عينةDynalMXIC1
مقصB. BraunBC257RBlunt
ShakerApexlabGS-2050-300 دورة في الدقيقة
SkalpelBochem12646
خيط حريريB. Braun3 USP
Streptavidin ، Alexa Fluor 488 ThermoFisherS11223
SPL Lifesciences5005050 مل
تريس (هيدروكسي ميثيل أمينوميثان)هيليكونH-1702-0.5  ؛ السيد 121.14; رقم سجل المستخلصات الكيميائية: 77-86-1
Triton X-100AmrescoAm-O694-0.1
برنامج مجهرZEN ZEISSZEN2012 SP5https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen.html
٪ مسنن زجاجة Adobe أنبوب اختبار

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. O'Gorman, C. M. Airborne Aspergillus fumigatus conidia: A risk factor for aspergillosis. Fungal Biology Reviews. 25 (3), 151-157 (2011).
  2. Hyde, D. M., et al. Asthma: A comparison of animal models using stereological methods. European Re....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Confocal Laser MicroscopyAspergillus Fumigatus ConidiaOptical ClearingMouse Lung ImagingQuantitative AnalysisAirway DistributionThree Dimensional ImagingSpectral UnmixingAirway MaskingImmune Response

Related Articles