يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

فحوصات هجرة الخلايا والتصاق الخلوي للتحقيق في تفاعل الخلية المضيفة بين الليشمانيا

1.1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/62461

⸱

أغسطس 4, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Host - Parasite Interaction and Epidemiology, Gonçalo Moniz Institute

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

ندرس هنا الآثار المترتبة على تفاعل الليشمانيا مع مضيف من خلال استكشاف هجرة الخلايا المتغصنة المصابة بالليشمانيا. يتم وصف تمايز الخلايا المتغصنة وإصابتها ، وتحليل الهجرة ، وتقييم مجمعات الالتصاق وديناميكيات الأكتين. يمكن تطبيق هذه الطريقة على دراسات هجرة الخلايا المضيفة الأخرى عند الإصابة بالليشمانيا أو أنواع الطفيليات الأخرى داخل الخلايا.

الملخص

الليشمانيا هو طفيلي أولي داخل الخلايا يسبب مجموعة واسعة من المظاهر السريرية ، بدءا من الآفات الجلدية الموضعية ذاتية الحل إلى شكل حشوي قاتل للغاية من المرض. ويقدر عدد المصابين حاليا بنحو 12 مليون شخص في جميع أنحاء العالم، ويواجه 350 مليون آخرون خطر الإصابة بالعدوى. من المعروف أن الخلايا المضيفة المصابة بطفيليات الليشمانيا ، مثل البلاعم أو الخلايا المتغصنة ، يمكن أن تهاجر إلى أنسجة مضيفة مختلفة ، ومع ذلك لا تزال كيف تساهم الهجرة في انتشار الطفيليات وتوجيهها لا تزال غير مفهومة جيدا. لذلك ، فإن تقييم قدرة هذه الطفيليات على تعديل استجابة الخلية المضيفة والالتصاق والهجرة سيسلط الضوء على الآليات المشاركة في انتشار المرض والحشوية. الهجرة الخلوية هي عملية معقدة تخضع فيها الخلايا للاستقطاب والنتوء ، مما يسمح لها بالهجرة. تتضمن هذه العملية ، التي تنظمها ديناميكيات الأنابيب الدقيقة القائمة على الأكتين والتوبولين ، عوامل مختلفة ، بما في ذلك تعديل الالتصاق الخلوي بالركيزة. تم التحقيق في عمليات الالتصاق والهجرة الخلوية باستخدام عدة نماذج. هنا ، نصف طريقة لتوصيف الجوانب المهاجرة للخلايا المضيفة أثناء عدوى الليشمانيا . يقدم هذا البروتوكول التفصيلي تمايز الخلايا المتغصنة وإصابتها ، وتحليل حركة الخلية المضيفة وهجرتها ، وتشكيل مجمعات الالتصاق وديناميكيات الأكتين. يهدف هذا البروتوكول في المختبر إلى توضيح الآليات المشاركة في انتشار الليشمانيا داخل الأنسجة المضيفة للفقاريات ويمكن أيضا تعديله وتطبيقه على دراسات هجرة الخلايا الأخرى.

المقدمة

داء الليشمانيات ، وهو مرض استوائي مهمل تسببه طفيليات أولية تنتمي إلى جنس الليشمانيا ، ينتج عنه مجموعة واسعة من المظاهر السريرية ، من الآفات الجلدية الموضعية ذاتية الشفاء إلى الأشكال الحشوية القاتلة للمرض. تشير التقديرات إلى أن ما يصل إلى مليون حالة جديدة من حالات داء الليشمانيات تنشأ سنويا، مع الإبلاغ عن إصابة 12 مليون شخص حاليا في جميع أنحاءالعالم. يتسبب داء الليشمانيات الحشوي (VL) ، الذي يمكن أن يكون قاتلا في أكثر من 95٪ من الحالات عند تركه دون علاج ، في وفاة أكثر من 50,000 سنويا ، مما يؤثر على الملايين في أمريكا الجنوبية وشرق إفريقيا وجنوب آسيا ومنطقة البحر الأبيض المتوسط2. ينتقل العامل المسبب الرئيسي ل VL في العالم الجديد ، Leishmania infantum ، إلى البشر عن طريق إناث ذبابة الرمل المصابة أثناء تغذية الدم3. يتم التعرف على هذه الطفيليات واستيعابها بواسطة الخلايا البلعمية ، على سبيل المثال ، الضامة والخلايا المتغصنة3،4،5. داخل هذه الخلايا ، تتمايز الطفيليات إلى أشكالها داخل الخلايا ، والمعروفة باسم amastigotes ، والتي ستتكاثر بعد ذلك وتنتقل عبر الجهاز اللمفاوي ومجرى الدم إلى الأنسجة المضيفة المختلفة6،7. ومع ذلك ، فإن الآليات التي تنتشر بها طفيليات الليشمانيا في مضيف الفقاريات ، وكذلك الدور الذي تلعبه هجرة الخلايا المضيفة في هذه العملية ، لا تزال غير واضحة.

هجرة الخلايا هي عملية معقدة تنفذها جميع الخلايا ذات النواة ، بما في ذلك الكريات البيض8. وفقا لنموذج ركوب الدراجات الكلاسيكي لهجرة الخلايا ، تتضمن هذه العملية العديد من الأحداث الجزيئية المتكاملة التي يمكن تقسيمها إلى خمس خطوات: نتوء رائد. التصاق الحافة الأمامية بجهات اتصال المصفوفة ؛ تقلص السيتوبلازم الخلوي. تحرير الحافة الخلفية للخلية من مواقع الاتصال ؛ وإعادة تدوير مستقبلات الغشاء من الجزء الخلفي إلى الأمامي منالخلية 9.

لكي تحدث هجرة الخلايا ، يجب تشكيل النتوءات ثم تثبيتها من خلال التعلق بالمصفوفة خارج الخلية. من بين أنواع المستقبلات المختلفة المشاركة في تعزيز هجرة الخلايا ، فإن الإنتجرينات ملحوظة. ينتج عن تنشيط الإنتجرين إشارات متعلقة بالترحيل ؛ ثم تحدث الإشارات داخل الخلايا عن طريق كيناز الالتصاق البؤري (FAK) وكينازات عائلة Src ، بالإضافة إلى جزيئات تالين وفينكولين وباكسيلين10،11،12. تؤدي فسفرة باكسيلين بواسطة الكينازات المنشطة ، بما في ذلك FAK ، إلى تجنيد جزيئات المستجيب ، والتي تنقل الإشارات الخارجية التي تحفز على هجرة الخلايا. لقد ثبت أن باكسيلين هو جزيء داخل الخلايا وهو أمر بالغ الأهمية للتصاق الخلايا ، وبلمرة الأكتين ، وعمليات هجرةالخلايا 13،14،15.

يلعب الهيكل الخلوي للأكتين دورا مركزيا في استقطاب وهجرة الخلايا البلعمية16. أثناء عملية هجرة الخلايا ، تستقر النتوءات المتكونة بسبب بلمرة الأكتين من خلال التصاق الخلية بالمصفوفة خارج الخلية. يمكن تعديل هذه العملية بواسطة مستقبلات الإنتجرين المرتبطة بالهيكل الخلوي للأكتين17،18،19. تنظم العديد من البروتينات المرتبطة بالأكتين معدل وتنظيم بلمرة الأكتين في النتوءات الخلوية20. أظهرت الدراسات أن RhoA و Rac و Cdc42 ينظمون إعادة تنظيم الأكتين بعد تحفيز الخلايا الملتصقة بواسطة العوامل خارج الخلية21،22. أثناء الهجرة ، يقع Rac1 و Cdc42 على الحافة الأمامية للخلية ، ويتحكم في امتداد الصفيحة والأحرف الخيطية ، على التوالي ، بينما ينظم RhoA ، الموجود في الجزء الخلفي من الخلية ، تقلص الهيكل الخلوي actomyosin15،23،24،25.

أظهرت الدراسات أن عدوى الليشمانيا تعدل وظائف الخلية المضيفة ، مثل الالتصاق بالركيزة الخلوية والهجرة26،27،28،29،30،31. توجد DCs غير الناضجة في الأنسجة المحيطية. عند التفاعل مع PAMPS ، يتم تنشيط هذه الخلايا وتهاجر إلى الغدد الليمفاوية المستنزفة ، مما يؤدي إلى عرض المستضد للخلايا التائية. أظهرت دراسة سابقة باستخدام نموذج الفأر أن عدوى L. amazonensis تثير انخفاضا في هجرة DCs إلى تصريف الغددالليمفاوية 29. كما ثبت أن تثبيط عملية الالتصاق قلل من هجرة التيار المستمر بعد الإصابة ب L. major30. ومع ذلك، فإن تأثير هجرة التيار المستمر على انتشار الطفيليات في المضيف، فضلا عن الآليات التي تنطوي عليها هذه العملية، لا تزال غير مفهومة جيدا.

نقدم هنا بروتوكولا مجمعا خطوة بخطوة لإجراء فحص الالتصاق والهجرة في المختبر الذي يتضمن DCs البشرية المصابة بالليشمانيا. لا تشمل هذه الطريقة تمايز وعدوى DCs فحسب ، بل تسمح أيضا بتحليل حركة الخلية المضيفة وهجرتها ، وتشكيل مجمعات الالتصاق ، وكذلك ديناميكيات الأكتين. يسمح البروتوكول الموصوف حاليا في المختبر للباحثين بإجراء مزيد من التحقيق في الآليات التي ينطوي عليها انتشار الليشمانيا داخل الأنسجة المضيفة للفقاريات ويمكن أيضا التلاعب بها وتطبيقها على دراسات هجرة الخلايا الأخرى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على الإجراءات المبينة هنا من قبل مجلس المراجعة المؤسسية لمعهد غونسالو مونيز (IGM-FIOCRUZ، البروتوكول رقم 2.751.345). تم الحصول على عينات دم من متبرعين متطوعين أصحاء. أجريت الإجراءات التجريبية على وفقا للمبادئ الأخلاقية في البحوث الحيوانية المعتمدة بموجب القانون البرازيلي 11.784/2008 وتمت الموافقة عليها وترخيصها من قبل اللجنة الأخلاقية لأبحاث التابعة لمعهد غونسالو مونيز (IGM-FIOCRUZ, البروتوكول رقم 014/2019).

1. عزل وتمايز الخلايا المتغصنة البشرية

  1. ماصة 10 مل من وسط تدرج الكثافة في أنابيب الطرد المركزي سعة 50 مل.
  2. قم بتسمية الأنابيب سعة 50 مل وفقا لعينة كل متبرع.
  3. اجمع ~ 50 مل من الدم الوريدي من متبرعين أصحاء وبعد جمعه ، اتبع الإجراءات الموضحة أدناه في خزانة التدفق.
  4. انقل الدم الذي تم جمعه بعناية إلى أنابيب الطرد المركزي وتخفيفه في محلول ملحي (0.9٪ كلوريد الصوديوم) بنسبة 1: 1 في درجة حرارة الغرفة.
  5. قم بتراكب الدم المخفف ببطء في الجزء العلوي من وسط تدرج الكثافة.
  6. أنابيب الطرد المركزي التي تحتوي على وسط تدرج الدم والكثافة عند 400 × جم لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: قم بإيقاف تشغيل الفرامل قبل الطرد المركزي لمنع اختلاط طبقات التدرج. بعد الطرد المركزي الأول ، اخفض درجة حرارة جهاز الطرد المركزي إلى 4 درجات مئوية.
  7. قم بإزالة الأنابيب بعناية من جهاز الطرد المركزي.
  8. تحديد حلقة خلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMC) في العينة (معطف بافي) ؛ قم بإزالة البلازما المتبقية برفق باستخدام ماصة.
    ملاحظة: بعد الطرد المركزي ، ستتشكل طبقات التدرج التالية: كريات الدم الحمراء ، ووسط تدرج الكثافة ، وحلقة PBMC ، والبلازما. تقع حلقة PBMC بين وسط تدرج الكثافة وطبقات البلازما.
  9. انقل طبقة PBMC الشبيهة بالسحابة إلى أنبوب جديد ورفع الحجم إلى 30 مل باستخدام محلول ملحي.
  10. جهاز الطرد المركزي الأنابيب التي تحتوي على تعليق الخلية عند 250 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من المحلول الملحي.
  11. اجمع حصة لحساب الخلايا باستخدام طريقة استبعاد trypan blue. أولا ، قم بالتخفيف بنسبة 1: 1,000. بعد ذلك ، استخدم 10 ميكرولتر من الخلايا المخففة لتلوين التريبان الأزرق وعد الخلايا باستخدام غرفة نيوباور لتحديد صلاحية الخلية.
  12. جهاز الطرد المركزي مرة أخرى عند 200 × جم لمدة 10 دقائق تحت 4 درجات مئوية.
  13. أعد تعليق الحبيبات في المخزن المؤقت لنظام التشغيل Macs. استخدم 80 ميكرولتر من المخزن المؤقت لكل 1 × 107 خلايا.
    ملاحظة: تكوين المخزن المؤقت لنظام MACS: قم بإعداد محلول يحتوي على محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، ودرجة الحموضة 7.2 ، و 0.5٪ ألبومين مصل البقر (BSA) ، و 2 ملي مولار EDTA. قم بتخفيف المحلول العازل بنسبة 1:20 بمحلول الشطف. احتفظ بالمخزن المؤقت باردا وخزنه في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية.
  14. أضف حبيبات CD14 الدقيقة إلى تعليق الخلية المعد في الخطوة 1.13. استخدم 20 ميكرولتر من ميكروبيدات CD14 لكل 1 × 107 خلايا.
    ملاحظة: تستخدم حبيبات CD14 الدقيقة للاختيار الإيجابي للخلايا الوحيدة البشرية من PBMCs ، حيث ترتبط الخرزات بالخلايا الإيجابية CD14 التي يتم التعبير عنها في معظم الخلايا الوحيدة.
  15. تجانس المحلول الذي يحتوي على الحبيبات والميكروبيدات باستخدام ماصة. يحفظ على الجليد لمدة 15 دقيقة.
  16. جهاز الطرد المركزي للتعليق عند 300 × جم لمدة 10 دقائق تحت 4 درجات مئوية.
  17. إعادة تعليق الخلايا في المخزن المؤقت ل MACS. استخدم 1-2 مل ل 1 × 107 خلايا في خليط الميكروبيدات الخلية.
  18. جهاز الطرد المركزي للتعليق عند 300 × جم لمدة 10 دقائق تحت 4 درجات مئوية.
  19. قم بشفط المادة الطافية وإعادة تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت MACS.
    ملاحظة: هذا هو الحد الأقصى لحجم تعليق الخلية الذي يمكن معالجته من خلال عمود واحد.
  20. قم بتجميع العمود المغناطيسي.
  21. اغسل العمود مرة واحدة عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لنظام التشغيل Macs. اسمح للمخزن المؤقت بالتدفق تحت الجاذبية عبر العمود.
    ملاحظة: لا تدع العمود يجف ، لأن أي هواء يدخل يمكن أن يعيق العمود.
  22. أضف 500 ميكرولتر من محلول عينة الخلية من الخطوة 1.19 لكل عمود. اسمح لمحلول عينة الخلية بالتدفق تحت الجاذبية عبر العمود.
  23. اغسل العمود بإضافة 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت MACS (2x). أضف المخزن المؤقت الجديد فقط عندما يكون خزان العمود فارغا. تجنب التجفيف.
  24. ماصة 1 مل من MACS bufferعلى العمود وضعها في أنبوب جديد تحتها. اغسل الخلايا المصنفة مغناطيسيا على الفور عن طريق دفع المكبس بقوة في العمود.
  25. جهاز الطرد المركزي الخلايا المخصبة CD14 عند 300 × جم لمدة 10 دقائق تحت 4 درجات مئوية.
  26. عد الخلايا باستخدام غرفة نيوباوير.
  27. أعد تعليق الخلايا في 1 مل RPMI كامل مع إنترلوكين -4 (IL-4) (100 ميكرولتر / مل) + عامل تحفيز مستعمرة الخلايا المحببة والبلاعم (GM-CSF) (50 نانوغرام / مل).
    ملاحظة: GM-CSF هو سيتوكين يفرزه البلاعم والخلايا التائية والخلايا البدينة والخلايا القاتلة الطبيعية والخلايا البطانية والخلايا الليفية التي تحفز تمايز وتكاثر أسلاف النخاع النخاعي في نخاع العظام. تستخدم GM-CSF و IL-4 للحث على تمايز الخلايا المتغصنة32.
  28. خلايا البذور في صفيحة 24 بئرا بتركيز 2 × 105 خلايا لكل بئر في 500 ميكرولتر من وسط RPMI الكامل الذي يحتوي على الخلايا وتحتضنها لمدة 7 أيام في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية.

2. زراعة الليشمانيا إنفانتوم

ملاحظة: تستخدم طفيليات الليشمانيا الرضيعة (MCAN/BR/89/BA262) في هذا الفحص. أصيب الهامستر بالوريد ب 20 ميكرولتر من المحلول الذي يحتوي على 1 × 106 لتر من بروماستيجوت إنفانتوم في محلول ملحي معقم. بعد 1 إلى 2 أشهر ، تم قتل واستعادة أشكال amastigote من الليشمانيا من طحالها وتمييزها إلى promastigotes33.

  1. تنمو L. infantum promastigotes المعزولة من طحال الهامستر المصاب سابقا في قارورة مزرعة خلية مائلة مقاس 25 سمتحتوي على 3 مل من وسط Novy-Nicolle-MacNeal (NNN) و 5 مل من الحد الأدنى من الوسط الأساسي المكمل (MEM).
    ملاحظة: في هذا الفحص ، تم استكمال وسط MEM بمصل بقري الجنين بنسبة 10٪ و 24.5 نانومتر من هيمين البقر.
  2. احتضان عند 24 درجة مئوية لمدة 7 أيام في حاضنة BOD (الطلب على الأكسجين الحيوي).
  3. ماصة 100 ميكرولتر من مزرعة بروماستيجوت في قارورة جديدة لزراعة الخلايا مقاس 25 سم2 تحتوي على 5 مل من وسط MEM المكمل.
  4. احتضان استزراع البروماستيجوت عند 24 درجة مئوية في حاضنة BOD حتى تصل promastigotes إلى المرحلة الثابتة. قم بحساب البروماستيجوت المزروعة بشكل دوري عن طريق نقل كمية من معلق الطفيلي المخفف في محلول ملحي إلى غرفة نيوباور (أي مقياس الدم) لتحديد المرحلة الثابتة من النمو.
    ملاحظة: لا ينصح باستخدام طفيليات الممر الأول بعد الزراعة في وسط NNN لتجنب الآثار المتبقية لدم الأرانب.
  5. نقل 1 × 105 من مزرعة مرحلة النمو الثابتة ل L. infantum promastigotes إلى قارورة ثقافة خلية جديدة مقاس 25 سم2 وأضف 5 مل من الوسط المكمل MEM.
  6. راقب نمو المزرعة بشكل دوري لمدة 7 أيام تقريبا باستخدام غرفة Neubauer حتى تتحقق المرحلة الثابتة. الطفيليات جاهزة الآن للاستخدام في إجراءات العدوى التجريبية.
    ملاحظة: تعتبر مزارع Promastigote قابلة للحياة للعدوى لما يصل إلى 7 مقاطع في المختبر ؛ قد تؤدي الممرات الإضافية إلى فقدان الضراوة.

3. عدوى الخلايا المتغصنة البشرية

  1. داخل خزانة التدفق الصفحي البيولوجي ، انقل جميع المحتويات من قارورة زراعة الطفيليات إلى أنابيب الطرد المركزي سعة 50 مل.
  2. أضف محلول ملحي بارد إلى الحجم النهائي البالغ 40 مل.
  3. جهاز طرد مركزي عند 1,600 ×جم لمدة 10 دقائق تحت 4 درجات مئوية.
  4. تخلص من المادة الطافية بعد الطرد المركزي وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من محلول ملحي بارد (كرر الخطوات 3.3-3.4 ثلاث مرات).
  5. بعد غسل الخلايا لإزالة أي طفيليات غير قابلة للحياة ، أعد تعليق الحبيبات في 1 مل من محلول ملحي بارد.
  6. مرر المحتويات ببطء من خلال حقنة سعة 1 مل بإبرة 16 جم 5 مرات لفصل مجموعات الطفيليات.
  7. قم بإزالة حصة لتحديد تركيز الطفيلي في مقياس كثافة الدم (احسب متوسط عدد الطفيليات في 4 أرباع × عامل التخفيف × 104).
  8. اغسل الخلايا المتغصنة بإضافة 1 مل من المحلول الملحي وخلايا الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (3 مرات).
  9. احسب كمية L. infantum المطلوبة للعدوى التجريبية ؛ النسبة: 20 طفيليا لكل خلية.
  10. ضع الحجم المطلوب من L. infantum في كل بئر من ألواح زراعة الخلايا.
  11. احتضان الخلايا المتغصنة مع الطفيليات لمدة 4 ساعات في حاضنة عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
  12. بعد الخطوة 3.11 ، ألواح الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق تحت 4 درجات مئوية.

4. مقايسة الهجرة باستخدام إدراج ثقافة الخلايا

  1. بعد الإصابة ، اغسل الخلايا المتغصنة (المصابة أم لا) 3 مرات ب 1 مل من المحلول الملحي في درجة حرارة الغرفة لإزالة الطفيليات غير الداخلية. بعد كل غسلة، توضع ألواح الطرد المركزي على درجة حرارة 300 × جم لمدة 10 دقائق تحت 4 درجات مئوية.
  2. بمجرد إزالة الطفيليات غير الداخلية ، افصل الخلايا عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من كاشف تفكك الخلية في كل بئر واحتضانها لمدة 15 دقيقة. احتفظ بالخلايا في حاضنة عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
  3. قم بتجانس الخلايا باستخدام طرف ماصة سعة 1,000 ميكرولتر للسماح للخلايا بالارتخاء.
  4. انقل الخلايا المنفصلة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل.
  5. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق تحت 4 درجات مئوية.
  6. أعد تعليق الحبيبات في 1 مل من وسط RPMI مع 10٪ FBS.
  7. مرر محتويات كل أنبوب ببطء من خلال حقنة سعة 1 مل بإبرة 25 جم 5 مرات لفصل الخلايا.
  8. قم بإزالة الكمية ، وقم بتخفيفها باستخدام المحاولات الزرقاء لتحديد تركيز الخلية باستخدام مقياس كثافة الدم (متوسط الخلايا القابلة للحياة في 4 أرباع × عامل التخفيف × 104).
  9. تحضير إدراج الصفيحة الدقيقة لزراعة الخلايا:
    ملاحظة: يوصى بإدخالات زراعة الخلايا (غشاء بولي كربونات المسام 5.0 ميكرومتر) لمقايسات الهجرة باستخدام الخلايا المتغصنة والضامة والخلايا الوحيدة ، حيث تسمح هذه الإدخالات للخلايا البلعمية بالمرور عبر الأغشية.
    1. قم بإزالة الإدخالات بملاقط معقمة وضعها في آبار فارغة.
    2. أضف 600 ميكرولتر من وسط RPMI مع 10٪ FBS لكل بئر ؛ أضف الكيموكين الجاذب الكيميائي (شكل C-C) ligand 3 (CCL3) (1 ميكرولتر لكل 1 مل من الوسط).
      ملاحظة: CCL3 هو كيموكين ينظم ترحيل التيار المستمر34.
    3. باستخدام ملاقط معقمة ، ضع الإدخالات في الآبار التي تحتوي على الوسط.
  10. أضف 2 × 105 خلايا شجيرية (مصابة أم لا) في 100 ميكرولتر من الوسط لكل إدخال.
  11. احتضن لمدة 4 ساعات للسماح للخلايا بالهجرة.
  12. بعد 4 ساعات ، أخرج الطبق واستنشق الوسط. أضف 100 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد واحتضنه لمدة 15 دقيقة.
  13. قم بإزالة بارافورمالدهيد وأضف 100 ميكرولتر من المحلول الملحي.
    ملاحظة: يمكن الاحتفاظ بالألواح عند 4 درجات مئوية للتجميع لاحقا.
  14. اجمع المادة الطافية من الإدخالات أو من الآبار لحساب الخلايا غير المهاجرة أو تلك التي عبرت الغشاء ، على التوالي. احتضان مع بارافورمالدهيد 4٪ لمدة 15 دقيقة.
  15. تركيز الخلايا باستخدام تقنية الطرد المركزيالخلوي 35.
  16. أضف 10 ميكرولتر من وسط التثبيت مع DAPI إلى الأغشية وضع أغطية فوق الآبار.
  17. تجميع غشاء الإدراج.
    ملاحظة: يمكن تنفيذ هذه الخطوة خارج خزانات السلامة البيولوجية.
    1. قم بإزالة أغشية الإدخال من الآبار.
    2. اكشط سطح الملحق بمسحة لإزالة أي خلايا لم تهاجر.
    3. باستخدام مشرط ، قم بإزالة الغشاء من الملحق.
    4. ضع الغشاء على شريحة ، بحيث تكون الخلايا متجهة لأعلى.
    5. أضف 10 ميكرولتر من وسط التركيب باستخدام DAPI إلى كل غشاء ثم ضع أغطية التراكب.
    6. غطي الألواح بورق الألمنيوم.
    7. احتضان الأطباق في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ، ثم احفظها في -20 درجة مئوية
  18. لتحليل هجرة الخلايا ، احسب عدد الخلايا لكل حقل (لا يقل عن 10 مجالات) باستخدام مجهر مضان بطول موجة إثارة ليزر يبلغ 405 نانومتر.

5. فحص الالتصاق وتقييم بلمرة الأكتين عن طريق التألق المناعي

ملاحظة: في هذا الاختبار ، استخدم لوحا من 24 بئرا مع أغطية.

  1. بعد إصابة الخلايا لمدة 4 ساعات ، اغسل كل بئر 3 مرات بمحلول ملحي معقم في درجة حرارة الغرفة لإزالة أي طفيليات غير داخلية.
  2. قم بالطرد المركزي للوحة عند 300 × جم لمدة 10 دقائق تحت 4 درجات مئوية. أضف 500 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد إلى كل بئر لمدة 15 دقيقة.
  3. قم بإزالة بارافورمالدهيد وأضف 1 مل من المحلول الملحي.
  4. قم بإعداد الحلول كما هو موضح في الجدول 1.
الحلول الأوليةمركب كيميائيمخفف
محلول كلوريد الأمونيوم0,134 غرام من NH4Cl50 مل من PBS 1X
سابونين 15٪150 مجم من الصابونين1 مل دي PBS 1X
الألبومين من مصل الأبقار (ABS) 10٪1 غرام من ABS10 مل من PBS 1X
الحلول الثانويةالعنصر 1العنصر 2العنصر 3
سابونين 0,15٪1 مل من الصابونين 15٪100 مل من PBS 1X-
برنامج تلفزيوني 1X / ABS 3٪ / سابونين 0,15٪13,8 مل من PBS 1X6 مل من ABS 10٪200 ميكرولتر من الصابونين 15٪
PBS1X / ABS 0,3٪ / سابونين 0,15٪:19,2 مل من PBS 1X0,6 مل من ABS 10٪200 ميكرولتر من الصابونين 15٪
برنامج تلفزيوني 1X / ABS 1٪ / سابونين 0,15٪17,8 مل من PBS 1X2 مل من ABS 10٪200 ميكرولتر من الصابونين 15٪

الجدول 1: وصفات العازلة.

  1. التلوين المناعي
    ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوات التالية تحت التحريض.
    1. اغسل الغطاء 3 مرات باستخدام 1x PBS لمدة 5 دقائق.
    2. أضف 500 ميكرولتر من محلول كلوريد الأمونيوم لكل بئر لمدة 10 دقائق.
    3. اغسل الغطاء 3 مرات باستخدام 1x PBS لمدة 5 دقائق.
    4. نفاذية الغشاء مع Saponin 0.15٪ لمدة 15 دقيقة.
    5. احتضان الخلايا بمحلول الحظر (PBS 1x / ABS 3٪ / Saponin 0.15٪) لمدة ساعة واحدة.
    6. اغسل الغطاء 3 مرات باستخدام PBS 1x / Saponin 0.15٪ لمدة 5 دقائق.
    7. تمييع الأجسام المضادة الأولية في PBS 1x / ABS 1٪ / Saponin 0.15٪ على النحو التالي: الأرانب المضادة ل FAK (pTyr397): تخفيف 1: 500 ، أرنب مضاد للباكسيلين (pTyr118): 1: 100 تخفيف. الماوس المضاد ل Rac1: تخفيف 1: 100. الأرانب المضادة ل CDC42: تخفيف 1: 200. أرنب مضاد ل RhoA: تخفيف 1: 200.
    8. احتضان الخلايا بالجسم المضاد الأولي المخفف في PBS 1x / ABS 1٪ / Saponin 0.15٪ لمدة ساعة واحدة.
      ملاحظة: FAK و Paxillin هي جزيئات رئيسية تشارك في تكوين مجمعات الالتصاق13،14،15. عائلة Rho GTPase هي المسؤولة عن تنظيم الهيكل الخلوي للأكتين. يتحكم RAC1 و Cdc42 ، الموجودان على الحافة الأمامية للخلية ، في تكوين الصفيحة والأرجل ، على التوالي ؛ يقع RhoA في الجزء الخلفي من الخلية ويشارك في تقلص الهيكل الخلوي15 ، 23 ، 24 ، 25.
    9. اغسل الغطاء 3 مرات باستخدام 1x PBS / Saponin 0.15٪ لمدة 5 دقائق.
    10. تمييع الجسم المضاد الثانوي أو الفالودين على النحو التالي: مضاد للأرانب IgG ، Alexa Fluor 568: تخفيف 1: 500 ؛ مكافحة الماوس IgG ، Alexa Fluor 488: 1: 500 التخفيف ؛ مكافحة الماوس IgG ، Alexa Fluor 594: 1: 500 التخفيف ؛ فالودين أليكسا فلور 488: تخفيف 1: 1200.
    11. احتضان الخلايا بجسم مضاد ثانوي أو فالودين مخفف في 1x PBS / ABS 0.3٪ سابونين 0.15٪ لمدة 45 دقيقة.
      ملاحظة: يجب إجراء حضانة الجسم المضاد الثانوي أو الفالودين في حالة عدم وجود ضوء. قم بتغطية الألواح بورق الألمنيوم للحماية من الضوء خلال الخطوات التالية.
    12. اغسل الغطاء 3 مرات باستخدام 1x PBS لمدة 5 دقائق.
    13. قم بإزالة أغطية الآبار.
    14. في حالة عدم وجود ضوء، أضف 10 ميكرولتر من وسط التركيب باستخدام DAPI على شرائح زجاجية مجهرية نظيفة.
    15. ضع أغطية بحيث تكون الخلايا متجهة لأسفل للسماح بالاتصال بين الخلايا ومحلول DAPI.
      ملاحظة: قم بتغطية الشرائح بورق الألمنيوم للحماية من الضوء.
    16. احتضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    17. يحفظ في -20 درجة مئوية.

6. الفحص المجهري متحد البؤر ، والحصول على الصور ، والقياس الكمي باستخدام فيجي

ملاحظة: للحصول على / التقاط صور التألق المناعي ، استخدم مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر. يوصى باستخدام عدسة موضوعية 63x بالغمر بالزيت للحصول على الدقة المثلى.

  1. اسمح للأغطية بالوصول إلى درجة حرارة الغرفة، محمية من الضوء، لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الحصول على الصورة.
  2. نظف الأغطية بأنسجة ماصة.
  3. أضف قطرة من زيت الغمر إلى الهدف وضع كل شريحة تحت المجهر.
  4. حرك الهدف حتى يلامس الزيت الشريحة.
  5. مراقبة وضبط تركيز المجهر. حدد الهدف 63x مع الزيت.
  6. قم بتشغيل الليزر بأطوال موجية 488 نانومتر و 552 نانومتر و 405 نانومتر .
  7. حدد دقة الصورة: 1024 × 1024.
  8. انقر فوق الزر Live ، واضبط مكدس Z ، واضغط على Begin. كرر العملية ثم اضغط على إنهاء.
  9. بعد تحديد خيار الحد الأقصى للإقراض في قائمة الأداة ، انتظر حتى يتم الحصول على الصورة.
  10. احفظ التجربة.
  11. تصدير الصور بتنسيق .lif على جهاز كمبيوتر. استخدم برنامج تحليل الصور مفتوح المصدر من فيجي لتحليل الصور.
  12. حدد الصور المراد تحليلها وحدد صورة مكررة.
  13. لجعل الصورة بتدرج الرمادي، حدد صورة | ضبط | عتبة اللون. حدد 0 و255 (التشبع).
  14. حدد طريقة الحد: افتراضي.
  15. حدد لون الحد: B وW (أبيض وأسود).
  16. لا تحدد الخلفية الداكنة.
  17. حدد: العملية | ثنائي | الخيارات ثم حدد البيانات ذات الصلة المراد قياسها: المساحة ، الحد الأدنى ، الحد الأقصى ، القيمة الرمادية ، تكامل الكثافة.
  18. حدد أداة الأيدي الحرة في شريط أدوات فيجي وتتبع كل خلية يدويا بعناية.
  19. من القائمة تحليل ، حدد تعيين القياسات. تأكد من تحديد كثافة المنطقة المتكاملة ومتوسط القيمة الرمادية. كرر هذه العملية لكل خلية.
  20. حدد جميع البيانات في نافذة النتائج وانسخها ولصقها في ملف جدول بيانات.
  21. احسب التألق الكلي للخلية المصحح (CTCF): CTCF (تكامل الكثافة = مساحة الخلية المختارة × متوسط مضان قراءات الخلفية).
  22. افتح الملف الذي يحتوي على البيانات باستخدام برنامج التحليل الإحصائي لإجراء التحليل الإحصائي.

7. التحليل الإحصائي

  1. افتح مشروع جديد عند ظهور مربع حوار ترحيب.
  2. اختر نوع الرسم البياني والوسيط مع SD.
  3. قم بتطبيق القيم التي تم الحصول عليها من النتائج التجريبية على الجدول.
  4. حدد الإحصائيات الوصفية واختر عمود الخيار إحصائيات [جميع الاختبارات] لتحليل توزيع البيانات.
  5. إذا اتبعت البيانات توزيعا غاوسيا ، فاختر اختبار t لتحليل العينات عن طريق مقارنة زوجين. إذا كان التوزيع غير غاوسي ، فقم بتحليل البيانات باستخدام اختبار مان ويتني.
  6. اختر أفضل خيار رسم بياني للتمثيل الأمثل للبيانات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يتيح هذا البروتوكول الموصوف هنا تقييم هجرة الخلايا والآليات المرتبطة بها ، مثل ديناميكيات الأكتين والالتصاق ، وبالتالي توفير أداة لتحديد هجرة الخلايا المضيفة المصابة بالليشمانيا داخل مضيف الفقاريات. توضح النتائج المقدمة هنا أن هذا الاختبار في المختبر يوفر مؤشرات سريعة ومتسقة للتغيرات في الالتصاق الخلوي والهجرة وديناميكيات الأكتين قبل التجارب في الجسم الحي .

أولا ، تم زراعة الخلايا بنجاح باتباع التقنيات المعقمة والبروتوكولات المعملية. سمحت لنا البيانات التي تم إنشاؤها...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تسمح الطريقة الموضحة هنا لتقييم هجرة الخلايا باستخدام نظام إدراج غشاء زراعة الخلايا للباحثين بدراسة الاستجابة المهاجرة للخلايا في بيئة ثنائية الأبعاد. في هذه التقنية ، تعتبر بعض الخطوات حرجة. أولا ، يعد التمايز بين DCs البشرية والعدوى بالليشمانيا أمرا حاسما لأن معدل العدوى يعتمد على المتبرع. سيسمح استخدام أكثر من متبرع واحد لكل تجربة ومزارع الليشمانيا الصحية بنتائج أكثر اتساقا. من الأهمية بمكان أيضا الحفاظ على الطفيليات في المضيفة ، مما يفضل اختيار السلالات الخبيثة والح...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة باهيا لدعم الأبحاث (Fapesb) ، المنحة رقم 9092/2015. يقر المؤلفون ب CNPq و Capes و Fapesb للحصول على الدعم المالي عبر المنح الدراسية. يود المؤلفون أن يشكروا أندريس ك. والتر على التحليل النقدي ومراجعة اللغة الإنجليزية والمساعدة في تحرير المخطوطات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
16 إبرة قياسDescarpack353101
24 لوحة ثقافة خليةجيدة JET-BIOFILJ011024
25 إبرةقياس Descarpack353601
الألبومين من مصل الأبقارSigma AldrichA2153-100G
كلوريد الأمونيومSigma AldrichA-0171
IgG المضاد للفأر ، Alexa Fluor 488InvitrogenA32723
IgG المضاد للفأر ، Alexa Fluor 594InvitrogenA11032
IgG المضاد للأرانب ، Alexa Fluor 568InvitrogenA11011
CD14 MicroBeadsMACS Myltenyi Biotec130-050-201
قارورة ثقافة الخلية 25 سم 2< / sup>SPL70125
CelltripperCorning25-056-CI
مجهر متحد البؤرLeicaTCS SP8
دوائر Coverslip 13 ممPerfecta10210013CE
الملقطVWR82027-406
EDTASigma AldrichE6758
أنبوب الصقرKASVIK19-0051
مصل الأبقار الجنينgibco16000044
المجهر الفلوريأوليمبوس  BX51
شريحة زجاجية  25,4x76,2mmPerfecta200
Hemin bovineSigma AldrichH2250
HemocytometerPerfecta7302HD
Histopaque® 1077Sigma Aldrich10771
MACS bufferMACS Myltenyi Biotec130-091-221
الحد الأدنى الأساسي ماوس41090093جيبكو
مضاد ل Rac1BD610650
بارافورمالدهايدسيجما ألدريتش158127
فالودين أليكسا فلور 488InvitrogenA12379
فوسفات مخزن محلول ملحيThermoFisherAM9624
إدراج غشاء البولي كربونات Transwell - حجم المسام 5.0 & mCorning3421
ProLong Gold DAPI kitInvitrogenP36931
Rabbit anti-Cdc42InvitrogenPA1-092X
Rabbit anti-FAK (pTyr397)InvitrogenRC222574
Rabbit Anti-paxilin (pTyr118)InvitrogenQF221230
Rabbit anti-RhoAInvitrogenOSR00266W
المؤتلف البشري CCL3R & D Systems270-LD-010
المؤتلف البشري GM-CSFPeproTech300-03
المؤتلف البشري IL-4PeproTech200-04
المؤتلف البشري M-CSFPeproTech300-25
RPMI 1640 متوسطGibco21870076
SaponinSigma Aldrich47036 & ndash; 50G & ndash; إف
حقنة 3 ملديسكارباك324201
تريبان بلوجيبكو15250061
تشريح متوسط

المراجع

  1. Burza, S., Croft, S. L., Boelaert, M. Leishmaniasis. The Lancet. 392 (10151), 951-970 (2018).
  2. Bi, K., Chen, Y., Zhao, S., Kuang, Y., John Wu, C. H. Current Visceral Leishmaniasis Research: A Research Review to Inspire Future Study. BioMed Research International. 2018, (2018).
  3. Serafim, T. D., Iniguez, E., Oliveira, F. Leishmania infantum. Trends in Parasitology. 36 (1), 80-81 (2020).
  4. Van Assche, T., Deschacht, M., da Luz, R. A. I., Maes, L., Cos, P. Leishmania-macrophage interactions: Insights into the redox biology. Free Radical Biology and Medicine. 51 (2), 337-351 (2011).
  5. Podinovskaia, M., Descoteaux, A. Leishmania and the macrophage: A multifaceted interaction. Future Microbiology. 10 (1), 111-129 (2015).
  6. Antoine, J. C., Prina, E., Jouanne, C., Bongrand, P. Parasitophorous vacuoles of Leishmania amazonensis-infected macrophages maintain an acidic pH. Infection and Immunity. 58 (3), (1990).
  7. Antoine, J. C., Prina, E., Lang, T., Courret, N. The biogenesis and properties of the parasitophorous vacuoles that harbour Leishmania in murine macrophages. Trends in Microbiology. 6 (10), 392-401 (1998).
  8. Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: A multiscale tuning model. Journal of Cell Biology. 188 (1), 11-19 (2010).
  9. Sheetz, M. P., Felsenfeld, D., Galbraith, C. G., Choquet, D. Cell migration as a five-step cycle. Biochemical Society symposium. 65, 233-243 (1999).
  10. Yano, H., et al. Roles played by a subset of integrin signaling molecules in cadherin-based cell-cell adhesion. Journal of Cell Biology. 166 (2), 283-295 (2004).
  11. Mitra, S. K., Hanson, D. A., Schlaepfer, D. D. Focal adhesion kinase: In command and control of cell motility. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (1), 56-68 (2005).
  12. Deramaudt, T. B., et al. Altering FAK-Paxillin Interactions Reduces Adhesion, Migration and Invasion Processes. PLoS One. 9 (3), (2014).
  13. Turner, C. E. Paxillin and focal adhesion signalling. Nature Cell Biology. 2 (12), (2000).
  14. Linder, S., Aepfelbacher, M. Podosomes: Adhesion hot spots of invasive cells. Trends in Cell Biology. 13 (7), 376-385 (2003).
  15. Huveneers, S., Danen, E. H. J. Adhesion signaling - Crosstalk between integrins, Src and Rho. Journal of Cell Science. 122 (8), 1059-1069 (2009).
  16. Jones, G. E. Cellular signaling in macrophage migration and chemotaxis. Journal of Leukocyte Biology. 68 (5), 593-602 (2000).
  17. De Fougerolles, A. R., Koteliansky, V. E. Regulation of monocyte gene expression by the extracellular matrix and its functional implications. Immunological Reviews. 186 (1), 208-220 (2002).
  18. Cortesio, C. L., Boateng, L. R., Piazza, T. M., Bennin, D. a, Huttenlocher, A. Calpain-mediated proteolysis of paxillin negatively regulates focal adhesion dynamics and cell migration. The Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 9998-10006 (2011).
  19. Verkhovsky, A. B., et al. Orientational order of the lamellipodial actin network as demonstrated in living motile cells. Molecular Biology of the Cell. 14 (11), 4667-4675 (2003).
  20. Ridley, A. J., et al. Cell Migration: Integrating signals from front to back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).
  21. Hall, A. Small GTP-binding proteins, and the regulation of the actin cytoskeleton. Annual Review of Cell Biology. 10, 31-54 (1994).
  22. Machesky, L. M., Hall, A. Rho: A connection between membrane receptor signalling and the cytoskeleton. Trends in Cell Biology. 6 (8), 304-310 (1996).
  23. Ridley, A. J., Hall, A. The small GTP-binding protein rho regulates the assembly of focal adhesions and actin stress fibers in response to growth factors. Cell. 70 (3), 389-399 (1992).
  24. DeMali, K. A., Burridge, K. Coupling membrane protrusion and cell adhesion. Journal of Cell Science. 116 (12), 2389-2397 (2003).
  25. López-Colomé, A. M., Lee-Rivera, I., Benavides-Hidalgo, R., López, E. Paxillin: A crossroad in pathological cell migration. Journal of Hematology and Oncology. 10 (1), (2017).
  26. Carvalhal, D. G. F., et al. The modelling of mononuclear phagocyte-connective tissue adhesion in vitro: Application to disclose a specific inhibitory effect of Leishmania infection. Experimental Parasitology. 107 (3-4), 189-199 (2004).
  27. Pinheiro, N. F., et al. Leishmania infection impairs β1-integrin function and chemokine receptor expression in mononuclear phagocytes. Infection and Immunity. 74 (7), 3912-3921 (2006).
  28. de Menezes, J. P. B., et al. Leishmania infection inhibits macrophage motility by altering F-actin dynamics and the expression of adhesion complex proteins. Cellular Microbiology. 19 (3), (2017).
  29. Hermida, M. D. R., Doria, P. G., Taguchi, A. M. P., Mengel, J. O., dos-Santos, W. L. C. Leishmania amazonensis infection impairs dendritic cell migration from the inflammatory site to the draining lymph node. BMC Infectious Diseases. 14 (1), 450(2014).
  30. Ballet, R., et al. Blocking junctional adhesion molecule c enhances dendritic cell migration and boosts the immune responses against Leishmania major. PLoS Pathogens. 10 (12), (2014).
  31. Rocha, M. I., et al. Leishmania infantum enhances migration of macrophages via a phosphoinositide 3-Kinase î-dependent pathway. ACS Infectious Diseases. 6 (7), 1643-1649 (2020).
  32. Hiasa, M., et al. GM-CSF and IL-4 induce dendritic cell differentiation and disrupt osteoclastogenesis through M-CSF receptor shedding by up-regulation of TNF-α converting enzyme (TACE). Blood. 114 (20), 4517-4526 (2009).
  33. de Melo, C. V. B., et al. Phenotypical characterization of spleen remodeling in murine experimental visceral leishmaniasis. Frontiers in Immunology. 11, 653(2020).
  34. Gibaldi, D., et al. CCL3/macrophage inflammatory protein-1α is dually involved in parasite persistence and induction of a TNF- and IFNγ-enriched inflammatory milieu in Trypanosoma cruzi-induced chronic cardiomyopathy. Frontiers in Immunology. 11, 306(2020).
  35. Finger, P. T., Papp, C., Latkany, P., Kurli, M., Iacob, C. E. Anterior chamber paracentesis cytology (cytospin technique) for the diagnosis of intraocular lymphoma. British Journal of Ophthalmology. 90 (6), 690-692 (2006).
  36. Zhang, C., Barrios, M. P., Alani, R. M., Cabodi, M., Wong, J. Y. A microfluidic Transwell to study chemotaxis. Experimental Cell Research. 342 (2), 159-165 (2016).
  37. Glynn, S. A., O'Sullivan, D., Eustace, A. J., Clynes, M., O'Donovan, N. The 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase inhibitors, simvastatin, lovastatin and mevastatin inhibit proliferation and invasion of melanoma cells. BMC Cancer. 8, (2008).
  38. van de Merbel, A. F., vander Horst, G., Buijs, J. T., vander Pluijm, G. Protocols for migration and invasion studies in prostate cancer. Methods in Molecular Biology. 1786, 67-79 (2018).
  39. Omar Zaki, S. S., Kanesan, L., Leong, M. Y. D., Vidyadaran, S. The influence of serum-supplemented culture media in a transwell migration assay. Cell Biology International. 43 (10), 1201-1204 (2019).
  40. Borovikov, I. S. Izuchenie strukturnykh izmeneniǐ sokratitel'nykh belkov myshechnogo volokna s pomoshch'iu poliarizatsionnoǐ ul'trafioletovoǐ fluorestsentnoǐ mikroskopii. VIII. Vliianie glutaral'degida i falloidina na konformatsiiu F-aktina. Tsitologiya. 26 (11), 1262-1266 (1984).
  41. Cooper, J. A. Effects of cytochalasin and phalloidin on actin. The Journal of Cell Biology. 105 (4), 1473-1478 (1987).
  42. Allen, W. E., Jones, G. E., Pollard, J. W., Ridley, A. J. Rho, Rac and Cdc42 regulate actin organization and cell adhesion in macrophages. Journal of Cell Science. 110, 707-720 (1997).
  43. Lichtman, J. W., Conchello, J. A. Fluorescence microscopy. Nature Methods. 2 (12), 910-919 (2005).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

عدوى الليشمانياالخلايا التغصنيةهجرة الخلايا البلعميةديناميكيات الأكتينمعقدات الالتصاقمقايسة في المختبرانتشار الطفيليات

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.