تمت الموافقة على الإجراءات المبينة هنا من قبل مجلس المراجعة المؤسسية لمعهد غونسالو مونيز (IGM-FIOCRUZ، البروتوكول رقم 2.751.345). تم الحصول على عينات دم من متبرعين متطوعين أصحاء. أجريت الإجراءات التجريبية على وفقا للمبادئ الأخلاقية في البحوث الحيوانية المعتمدة بموجب القانون البرازيلي 11.784/2008 وتمت الموافقة عليها وترخيصها من قبل اللجنة الأخلاقية لأبحاث التابعة لمعهد غونسالو مونيز (IGM-FIOCRUZ, البروتوكول رقم 014/2019).
1. عزل وتمايز الخلايا المتغصنة البشرية
- ماصة 10 مل من وسط تدرج الكثافة في أنابيب الطرد المركزي سعة 50 مل.
- قم بتسمية الأنابيب سعة 50 مل وفقا لعينة كل متبرع.
- اجمع ~ 50 مل من الدم الوريدي من متبرعين أصحاء وبعد جمعه ، اتبع الإجراءات الموضحة أدناه في خزانة التدفق.
- انقل الدم الذي تم جمعه بعناية إلى أنابيب الطرد المركزي وتخفيفه في محلول ملحي (0.9٪ كلوريد الصوديوم) بنسبة 1: 1 في درجة حرارة الغرفة.
- قم بتراكب الدم المخفف ببطء في الجزء العلوي من وسط تدرج الكثافة.
- أنابيب الطرد المركزي التي تحتوي على وسط تدرج الدم والكثافة عند 400 × جم لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: قم بإيقاف تشغيل الفرامل قبل الطرد المركزي لمنع اختلاط طبقات التدرج. بعد الطرد المركزي الأول ، اخفض درجة حرارة جهاز الطرد المركزي إلى 4 درجات مئوية.
- قم بإزالة الأنابيب بعناية من جهاز الطرد المركزي.
- تحديد حلقة خلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMC) في العينة (معطف بافي) ؛ قم بإزالة البلازما المتبقية برفق باستخدام ماصة.
ملاحظة: بعد الطرد المركزي ، ستتشكل طبقات التدرج التالية: كريات الدم الحمراء ، ووسط تدرج الكثافة ، وحلقة PBMC ، والبلازما. تقع حلقة PBMC بين وسط تدرج الكثافة وطبقات البلازما.
- انقل طبقة PBMC الشبيهة بالسحابة إلى أنبوب جديد ورفع الحجم إلى 30 مل باستخدام محلول ملحي.
- جهاز الطرد المركزي الأنابيب التي تحتوي على تعليق الخلية عند 250 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من المحلول الملحي.
- اجمع حصة لحساب الخلايا باستخدام طريقة استبعاد trypan blue. أولا ، قم بالتخفيف بنسبة 1: 1,000. بعد ذلك ، استخدم 10 ميكرولتر من الخلايا المخففة لتلوين التريبان الأزرق وعد الخلايا باستخدام غرفة نيوباور لتحديد صلاحية الخلية.
- جهاز الطرد المركزي مرة أخرى عند 200 × جم لمدة 10 دقائق تحت 4 درجات مئوية.
- أعد تعليق الحبيبات في المخزن المؤقت لنظام التشغيل Macs. استخدم 80 ميكرولتر من المخزن المؤقت لكل 1 × 107 خلايا.
ملاحظة: تكوين المخزن المؤقت لنظام MACS: قم بإعداد محلول يحتوي على محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، ودرجة الحموضة 7.2 ، و 0.5٪ ألبومين مصل البقر (BSA) ، و 2 ملي مولار EDTA. قم بتخفيف المحلول العازل بنسبة 1:20 بمحلول الشطف. احتفظ بالمخزن المؤقت باردا وخزنه في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية.
- أضف حبيبات CD14 الدقيقة إلى تعليق الخلية المعد في الخطوة 1.13. استخدم 20 ميكرولتر من ميكروبيدات CD14 لكل 1 × 107 خلايا.
ملاحظة: تستخدم حبيبات CD14 الدقيقة للاختيار الإيجابي للخلايا الوحيدة البشرية من PBMCs ، حيث ترتبط الخرزات بالخلايا الإيجابية CD14 التي يتم التعبير عنها في معظم الخلايا الوحيدة.
- تجانس المحلول الذي يحتوي على الحبيبات والميكروبيدات باستخدام ماصة. يحفظ على الجليد لمدة 15 دقيقة.
- جهاز الطرد المركزي للتعليق عند 300 × جم لمدة 10 دقائق تحت 4 درجات مئوية.
- إعادة تعليق الخلايا في المخزن المؤقت ل MACS. استخدم 1-2 مل ل 1 × 107 خلايا في خليط الميكروبيدات الخلية.
- جهاز الطرد المركزي للتعليق عند 300 × جم لمدة 10 دقائق تحت 4 درجات مئوية.
- قم بشفط المادة الطافية وإعادة تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت MACS.
ملاحظة: هذا هو الحد الأقصى لحجم تعليق الخلية الذي يمكن معالجته من خلال عمود واحد.
- قم بتجميع العمود المغناطيسي.
- اغسل العمود مرة واحدة عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لنظام التشغيل Macs. اسمح للمخزن المؤقت بالتدفق تحت الجاذبية عبر العمود.
ملاحظة: لا تدع العمود يجف ، لأن أي هواء يدخل يمكن أن يعيق العمود.
- أضف 500 ميكرولتر من محلول عينة الخلية من الخطوة 1.19 لكل عمود. اسمح لمحلول عينة الخلية بالتدفق تحت الجاذبية عبر العمود.
- اغسل العمود بإضافة 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت MACS (2x). أضف المخزن المؤقت الجديد فقط عندما يكون خزان العمود فارغا. تجنب التجفيف.
- ماصة 1 مل من MACS bufferعلى العمود وضعها في أنبوب جديد تحتها. اغسل الخلايا المصنفة مغناطيسيا على الفور عن طريق دفع المكبس بقوة في العمود.
- جهاز الطرد المركزي الخلايا المخصبة CD14 عند 300 × جم لمدة 10 دقائق تحت 4 درجات مئوية.
- عد الخلايا باستخدام غرفة نيوباوير.
- أعد تعليق الخلايا في 1 مل RPMI كامل مع إنترلوكين -4 (IL-4) (100 ميكرولتر / مل) + عامل تحفيز مستعمرة الخلايا المحببة والبلاعم (GM-CSF) (50 نانوغرام / مل).
ملاحظة: GM-CSF هو سيتوكين يفرزه البلاعم والخلايا التائية والخلايا البدينة والخلايا القاتلة الطبيعية والخلايا البطانية والخلايا الليفية التي تحفز تمايز وتكاثر أسلاف النخاع النخاعي في نخاع العظام. تستخدم GM-CSF و IL-4 للحث على تمايز الخلايا المتغصنة32.
- خلايا البذور في صفيحة 24 بئرا بتركيز 2 × 105 خلايا لكل بئر في 500 ميكرولتر من وسط RPMI الكامل الذي يحتوي على الخلايا وتحتضنها لمدة 7 أيام في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية.
2. زراعة الليشمانيا إنفانتوم
ملاحظة: تستخدم طفيليات الليشمانيا الرضيعة (MCAN/BR/89/BA262) في هذا الفحص. أصيب الهامستر بالوريد ب 20 ميكرولتر من المحلول الذي يحتوي على 1 × 106 لتر من بروماستيجوت إنفانتوم في محلول ملحي معقم. بعد 1 إلى 2 أشهر ، تم قتل واستعادة أشكال amastigote من الليشمانيا من طحالها وتمييزها إلى promastigotes33.
- تنمو L. infantum promastigotes المعزولة من طحال الهامستر المصاب سابقا في قارورة مزرعة خلية مائلة مقاس 25 سمتحتوي على 3 مل من وسط Novy-Nicolle-MacNeal (NNN) و 5 مل من الحد الأدنى من الوسط الأساسي المكمل (MEM).
ملاحظة: في هذا الفحص ، تم استكمال وسط MEM بمصل بقري الجنين بنسبة 10٪ و 24.5 نانومتر من هيمين البقر.
- احتضان عند 24 درجة مئوية لمدة 7 أيام في حاضنة BOD (الطلب على الأكسجين الحيوي).
- ماصة 100 ميكرولتر من مزرعة بروماستيجوت في قارورة جديدة لزراعة الخلايا مقاس 25 سم2 تحتوي على 5 مل من وسط MEM المكمل.
- احتضان استزراع البروماستيجوت عند 24 درجة مئوية في حاضنة BOD حتى تصل promastigotes إلى المرحلة الثابتة. قم بحساب البروماستيجوت المزروعة بشكل دوري عن طريق نقل كمية من معلق الطفيلي المخفف في محلول ملحي إلى غرفة نيوباور (أي مقياس الدم) لتحديد المرحلة الثابتة من النمو.
ملاحظة: لا ينصح باستخدام طفيليات الممر الأول بعد الزراعة في وسط NNN لتجنب الآثار المتبقية لدم الأرانب.
- نقل 1 × 105 من مزرعة مرحلة النمو الثابتة ل L. infantum promastigotes إلى قارورة ثقافة خلية جديدة مقاس 25 سم2 وأضف 5 مل من الوسط المكمل MEM.
- راقب نمو المزرعة بشكل دوري لمدة 7 أيام تقريبا باستخدام غرفة Neubauer حتى تتحقق المرحلة الثابتة. الطفيليات جاهزة الآن للاستخدام في إجراءات العدوى التجريبية.
ملاحظة: تعتبر مزارع Promastigote قابلة للحياة للعدوى لما يصل إلى 7 مقاطع في المختبر ؛ قد تؤدي الممرات الإضافية إلى فقدان الضراوة.
3. عدوى الخلايا المتغصنة البشرية
- داخل خزانة التدفق الصفحي البيولوجي ، انقل جميع المحتويات من قارورة زراعة الطفيليات إلى أنابيب الطرد المركزي سعة 50 مل.
- أضف محلول ملحي بارد إلى الحجم النهائي البالغ 40 مل.
- جهاز طرد مركزي عند 1,600 ×جم لمدة 10 دقائق تحت 4 درجات مئوية.
- تخلص من المادة الطافية بعد الطرد المركزي وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من محلول ملحي بارد (كرر الخطوات 3.3-3.4 ثلاث مرات).
- بعد غسل الخلايا لإزالة أي طفيليات غير قابلة للحياة ، أعد تعليق الحبيبات في 1 مل من محلول ملحي بارد.
- مرر المحتويات ببطء من خلال حقنة سعة 1 مل بإبرة 16 جم 5 مرات لفصل مجموعات الطفيليات.
- قم بإزالة حصة لتحديد تركيز الطفيلي في مقياس كثافة الدم (احسب متوسط عدد الطفيليات في 4 أرباع × عامل التخفيف × 104).
- اغسل الخلايا المتغصنة بإضافة 1 مل من المحلول الملحي وخلايا الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (3 مرات).
- احسب كمية L. infantum المطلوبة للعدوى التجريبية ؛ النسبة: 20 طفيليا لكل خلية.
- ضع الحجم المطلوب من L. infantum في كل بئر من ألواح زراعة الخلايا.
- احتضان الخلايا المتغصنة مع الطفيليات لمدة 4 ساعات في حاضنة عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
- بعد الخطوة 3.11 ، ألواح الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق تحت 4 درجات مئوية.
4. مقايسة الهجرة باستخدام إدراج ثقافة الخلايا
- بعد الإصابة ، اغسل الخلايا المتغصنة (المصابة أم لا) 3 مرات ب 1 مل من المحلول الملحي في درجة حرارة الغرفة لإزالة الطفيليات غير الداخلية. بعد كل غسلة، توضع ألواح الطرد المركزي على درجة حرارة 300 × جم لمدة 10 دقائق تحت 4 درجات مئوية.
- بمجرد إزالة الطفيليات غير الداخلية ، افصل الخلايا عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من كاشف تفكك الخلية في كل بئر واحتضانها لمدة 15 دقيقة. احتفظ بالخلايا في حاضنة عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
- قم بتجانس الخلايا باستخدام طرف ماصة سعة 1,000 ميكرولتر للسماح للخلايا بالارتخاء.
- انقل الخلايا المنفصلة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل.
- جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق تحت 4 درجات مئوية.
- أعد تعليق الحبيبات في 1 مل من وسط RPMI مع 10٪ FBS.
- مرر محتويات كل أنبوب ببطء من خلال حقنة سعة 1 مل بإبرة 25 جم 5 مرات لفصل الخلايا.
- قم بإزالة الكمية ، وقم بتخفيفها باستخدام المحاولات الزرقاء لتحديد تركيز الخلية باستخدام مقياس كثافة الدم (متوسط الخلايا القابلة للحياة في 4 أرباع × عامل التخفيف × 104).
- تحضير إدراج الصفيحة الدقيقة لزراعة الخلايا:
ملاحظة: يوصى بإدخالات زراعة الخلايا (غشاء بولي كربونات المسام 5.0 ميكرومتر) لمقايسات الهجرة باستخدام الخلايا المتغصنة والضامة والخلايا الوحيدة ، حيث تسمح هذه الإدخالات للخلايا البلعمية بالمرور عبر الأغشية.
- قم بإزالة الإدخالات بملاقط معقمة وضعها في آبار فارغة.
- أضف 600 ميكرولتر من وسط RPMI مع 10٪ FBS لكل بئر ؛ أضف الكيموكين الجاذب الكيميائي (شكل C-C) ligand 3 (CCL3) (1 ميكرولتر لكل 1 مل من الوسط).
ملاحظة: CCL3 هو كيموكين ينظم ترحيل التيار المستمر34.
- باستخدام ملاقط معقمة ، ضع الإدخالات في الآبار التي تحتوي على الوسط.
- أضف 2 × 105 خلايا شجيرية (مصابة أم لا) في 100 ميكرولتر من الوسط لكل إدخال.
- احتضن لمدة 4 ساعات للسماح للخلايا بالهجرة.
- بعد 4 ساعات ، أخرج الطبق واستنشق الوسط. أضف 100 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد واحتضنه لمدة 15 دقيقة.
- قم بإزالة بارافورمالدهيد وأضف 100 ميكرولتر من المحلول الملحي.
ملاحظة: يمكن الاحتفاظ بالألواح عند 4 درجات مئوية للتجميع لاحقا.
- اجمع المادة الطافية من الإدخالات أو من الآبار لحساب الخلايا غير المهاجرة أو تلك التي عبرت الغشاء ، على التوالي. احتضان مع بارافورمالدهيد 4٪ لمدة 15 دقيقة.
- تركيز الخلايا باستخدام تقنية الطرد المركزيالخلوي 35.
- أضف 10 ميكرولتر من وسط التثبيت مع DAPI إلى الأغشية وضع أغطية فوق الآبار.
- تجميع غشاء الإدراج.
ملاحظة: يمكن تنفيذ هذه الخطوة خارج خزانات السلامة البيولوجية.
- قم بإزالة أغشية الإدخال من الآبار.
- اكشط سطح الملحق بمسحة لإزالة أي خلايا لم تهاجر.
- باستخدام مشرط ، قم بإزالة الغشاء من الملحق.
- ضع الغشاء على شريحة ، بحيث تكون الخلايا متجهة لأعلى.
- أضف 10 ميكرولتر من وسط التركيب باستخدام DAPI إلى كل غشاء ثم ضع أغطية التراكب.
- غطي الألواح بورق الألمنيوم.
- احتضان الأطباق في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ، ثم احفظها في -20 درجة مئوية
- لتحليل هجرة الخلايا ، احسب عدد الخلايا لكل حقل (لا يقل عن 10 مجالات) باستخدام مجهر مضان بطول موجة إثارة ليزر يبلغ 405 نانومتر.
5. فحص الالتصاق وتقييم بلمرة الأكتين عن طريق التألق المناعي
ملاحظة: في هذا الاختبار ، استخدم لوحا من 24 بئرا مع أغطية.
- بعد إصابة الخلايا لمدة 4 ساعات ، اغسل كل بئر 3 مرات بمحلول ملحي معقم في درجة حرارة الغرفة لإزالة أي طفيليات غير داخلية.
- قم بالطرد المركزي للوحة عند 300 × جم لمدة 10 دقائق تحت 4 درجات مئوية. أضف 500 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد إلى كل بئر لمدة 15 دقيقة.
- قم بإزالة بارافورمالدهيد وأضف 1 مل من المحلول الملحي.
- قم بإعداد الحلول كما هو موضح في الجدول 1.
| الحلول الأولية | مركب كيميائي | مخفف | |
| محلول كلوريد الأمونيوم | 0,134 غرام من NH4Cl | 50 مل من PBS 1X | |
| سابونين 15٪ | 150 مجم من الصابونين | 1 مل دي PBS 1X | |
| الألبومين من مصل الأبقار (ABS) 10٪ | 1 غرام من ABS | 10 مل من PBS 1X | |
| الحلول الثانوية | العنصر 1 | العنصر 2 | العنصر 3 |
| سابونين 0,15٪ | 1 مل من الصابونين 15٪ | 100 مل من PBS 1X | - |
| برنامج تلفزيوني 1X / ABS 3٪ / سابونين 0,15٪ | 13,8 مل من PBS 1X | 6 مل من ABS 10٪ | 200 ميكرولتر من الصابونين 15٪ |
| PBS1X / ABS 0,3٪ / سابونين 0,15٪: | 19,2 مل من PBS 1X | 0,6 مل من ABS 10٪ | 200 ميكرولتر من الصابونين 15٪ |
| برنامج تلفزيوني 1X / ABS 1٪ / سابونين 0,15٪ | 17,8 مل من PBS 1X | 2 مل من ABS 10٪ | 200 ميكرولتر من الصابونين 15٪ |
الجدول 1: وصفات العازلة.
- التلوين المناعي
ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوات التالية تحت التحريض.
- اغسل الغطاء 3 مرات باستخدام 1x PBS لمدة 5 دقائق.
- أضف 500 ميكرولتر من محلول كلوريد الأمونيوم لكل بئر لمدة 10 دقائق.
- اغسل الغطاء 3 مرات باستخدام 1x PBS لمدة 5 دقائق.
- نفاذية الغشاء مع Saponin 0.15٪ لمدة 15 دقيقة.
- احتضان الخلايا بمحلول الحظر (PBS 1x / ABS 3٪ / Saponin 0.15٪) لمدة ساعة واحدة.
- اغسل الغطاء 3 مرات باستخدام PBS 1x / Saponin 0.15٪ لمدة 5 دقائق.
- تمييع الأجسام المضادة الأولية في PBS 1x / ABS 1٪ / Saponin 0.15٪ على النحو التالي: الأرانب المضادة ل FAK (pTyr397): تخفيف 1: 500 ، أرنب مضاد للباكسيلين (pTyr118): 1: 100 تخفيف. الماوس المضاد ل Rac1: تخفيف 1: 100. الأرانب المضادة ل CDC42: تخفيف 1: 200. أرنب مضاد ل RhoA: تخفيف 1: 200.
- احتضان الخلايا بالجسم المضاد الأولي المخفف في PBS 1x / ABS 1٪ / Saponin 0.15٪ لمدة ساعة واحدة.
ملاحظة: FAK و Paxillin هي جزيئات رئيسية تشارك في تكوين مجمعات الالتصاق13،14،15. عائلة Rho GTPase هي المسؤولة عن تنظيم الهيكل الخلوي للأكتين. يتحكم RAC1 و Cdc42 ، الموجودان على الحافة الأمامية للخلية ، في تكوين الصفيحة والأرجل ، على التوالي ؛ يقع RhoA في الجزء الخلفي من الخلية ويشارك في تقلص الهيكل الخلوي15 ، 23 ، 24 ، 25.
- اغسل الغطاء 3 مرات باستخدام 1x PBS / Saponin 0.15٪ لمدة 5 دقائق.
- تمييع الجسم المضاد الثانوي أو الفالودين على النحو التالي: مضاد للأرانب IgG ، Alexa Fluor 568: تخفيف 1: 500 ؛ مكافحة الماوس IgG ، Alexa Fluor 488: 1: 500 التخفيف ؛ مكافحة الماوس IgG ، Alexa Fluor 594: 1: 500 التخفيف ؛ فالودين أليكسا فلور 488: تخفيف 1: 1200.
- احتضان الخلايا بجسم مضاد ثانوي أو فالودين مخفف في 1x PBS / ABS 0.3٪ سابونين 0.15٪ لمدة 45 دقيقة.
ملاحظة: يجب إجراء حضانة الجسم المضاد الثانوي أو الفالودين في حالة عدم وجود ضوء. قم بتغطية الألواح بورق الألمنيوم للحماية من الضوء خلال الخطوات التالية.
- اغسل الغطاء 3 مرات باستخدام 1x PBS لمدة 5 دقائق.
- قم بإزالة أغطية الآبار.
- في حالة عدم وجود ضوء، أضف 10 ميكرولتر من وسط التركيب باستخدام DAPI على شرائح زجاجية مجهرية نظيفة.
- ضع أغطية بحيث تكون الخلايا متجهة لأسفل للسماح بالاتصال بين الخلايا ومحلول DAPI.
ملاحظة: قم بتغطية الشرائح بورق الألمنيوم للحماية من الضوء.
- احتضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- يحفظ في -20 درجة مئوية.
6. الفحص المجهري متحد البؤر ، والحصول على الصور ، والقياس الكمي باستخدام فيجي
ملاحظة: للحصول على / التقاط صور التألق المناعي ، استخدم مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر. يوصى باستخدام عدسة موضوعية 63x بالغمر بالزيت للحصول على الدقة المثلى.
- اسمح للأغطية بالوصول إلى درجة حرارة الغرفة، محمية من الضوء، لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الحصول على الصورة.
- نظف الأغطية بأنسجة ماصة.
- أضف قطرة من زيت الغمر إلى الهدف وضع كل شريحة تحت المجهر.
- حرك الهدف حتى يلامس الزيت الشريحة.
- مراقبة وضبط تركيز المجهر. حدد الهدف 63x مع الزيت.
- قم بتشغيل الليزر بأطوال موجية 488 نانومتر و 552 نانومتر و 405 نانومتر .
- حدد دقة الصورة: 1024 × 1024.
- انقر فوق الزر Live ، واضبط مكدس Z ، واضغط على Begin. كرر العملية ثم اضغط على إنهاء.
- بعد تحديد خيار الحد الأقصى للإقراض في قائمة الأداة ، انتظر حتى يتم الحصول على الصورة.
- احفظ التجربة.
- تصدير الصور بتنسيق .lif على جهاز كمبيوتر. استخدم برنامج تحليل الصور مفتوح المصدر من فيجي لتحليل الصور.
- حدد الصور المراد تحليلها وحدد صورة مكررة.
- لجعل الصورة بتدرج الرمادي، حدد صورة | ضبط | عتبة اللون. حدد 0 و255 (التشبع).
- حدد طريقة الحد: افتراضي.
- حدد لون الحد: B وW (أبيض وأسود).
- لا تحدد الخلفية الداكنة.
- حدد: العملية | ثنائي | الخيارات ثم حدد البيانات ذات الصلة المراد قياسها: المساحة ، الحد الأدنى ، الحد الأقصى ، القيمة الرمادية ، تكامل الكثافة.
- حدد أداة الأيدي الحرة في شريط أدوات فيجي وتتبع كل خلية يدويا بعناية.
- من القائمة تحليل ، حدد تعيين القياسات. تأكد من تحديد كثافة المنطقة المتكاملة ومتوسط القيمة الرمادية. كرر هذه العملية لكل خلية.
- حدد جميع البيانات في نافذة النتائج وانسخها ولصقها في ملف جدول بيانات.
- احسب التألق الكلي للخلية المصحح (CTCF): CTCF (تكامل الكثافة = مساحة الخلية المختارة × متوسط مضان قراءات الخلفية).
- افتح الملف الذي يحتوي على البيانات باستخدام برنامج التحليل الإحصائي لإجراء التحليل الإحصائي.
7. التحليل الإحصائي
- افتح مشروع جديد عند ظهور مربع حوار ترحيب.
- اختر نوع الرسم البياني والوسيط مع SD.
- قم بتطبيق القيم التي تم الحصول عليها من النتائج التجريبية على الجدول.
- حدد الإحصائيات الوصفية واختر عمود الخيار إحصائيات [جميع الاختبارات] لتحليل توزيع البيانات.
- إذا اتبعت البيانات توزيعا غاوسيا ، فاختر اختبار t لتحليل العينات عن طريق مقارنة زوجين. إذا كان التوزيع غير غاوسي ، فقم بتحليل البيانات باستخدام اختبار مان ويتني.
- اختر أفضل خيار رسم بياني للتمثيل الأمثل للبيانات.