مقالة منهجية

الكشف عن الأجسام المضادة المحايدة للسارس-CoV-2 باستخدام التصوير الفلوري عالي الإنتاجية للعدوى بالفيروس الزائف

DOI:

10.3791/62486

⸱

يونيو 5, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Ottawa Hospital Research Institute, 2Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, University of Ottawa

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يحدد البروتوكول الموصوف هنا طريقة سريعة وفعالة لقياس تحييد الأجسام المضادة ضد بروتين ارتفاع السارس-CoV-2 من خلال تقييم قدرة عينات المصل النقاهة على منع العدوى عن طريق فيروس التهاب الفم الفلوري الأخضر المعزز المسمى بالبروتين المركبات الزائف مع ارتفاع الجليكوبروتين.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ومع استمرار تطور جائحة COVID-19 الناجمة عن الفيروس التاجي للمتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة 2 (سارس-كوف-2)، أصبح من الواضح أن وجود أجسام مضادة لتحييد الفيروس قد يوفر الحماية من العدوى في المستقبل. وهكذا، ومع استمرار إنشاء وترجمة لقاحات فعالة من نوع COVID-19 بسرعة لم يسبق لها مثيل، فإن تطوير أساليب سريعة وفعالة لقياس تحييد الأجسام المضادة ضد السارس-CoV-2 سيصبح ذا أهمية متزايدة لتحديد الحماية طويلة الأجل من العدوى لكل من الأفراد المصابين سابقا والمحصنين. تصف هذه الورقة بروتوكولا عالي الإنتاجية باستخدام فيروس التهاب الفم الحويصلات (VSV) الزائف مع بروتين ارتفاع السارس-CoV-2 لقياس وجود الأجسام المضادة المحايدة في مصل النقاهة من المرضى الذين تعافوا مؤخرا من COVID-19. إن استخدام فيروس زائف التكرار يلغي الحاجة إلى مرفق احتواء من المستوى 3 مطلوب للتعامل مع السارس-CoV-2، مما يجعل هذا البروتوكول في متناول أي مختبر من مستوى الاحتواء 2 تقريبا. استخدام شكل 96 جيدا يسمح للعديد من العينات ليتم تشغيلها في نفس الوقت مع وقت تحول قصير من 24 ساعة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في ديسمبر 2019 ، تم تحديد فيروس كورونا الجديد ، والذي نعرفه الآن باسم SARS-CoV-2 ، العامل المسبب لمرض الفيروس التاجي 2019 (COVID-19)1. سارس-كوف-2 هو فيروس بيتاكورونا ينتمي إلى عائلة كورونافيريداي. هذه الفيروسات المغلفة تضم جينوم الحمض النووي الريبي كبير إيجابي الإحساس وهي مسؤولة عن التهابات الجهاز التنفسي والأمعاء في كل من البشر والحيوانات2. وحتى مايو 2021، تم الإبلاغ عن أكثر من 157 مليون حالة إصابة ب COVID-19 على مستوى العالم وأكثر من 3.2 مليون حالة وفاة3. أصبح تطوير لقاح فعال الهدف الرئيسي للباحثين في جميع أنحاء العالم مع ما لا يقل عن 77 لقاحا قبل السريري قيد التحقيق و90 يخضع حاليا لتجارب سريرية4.

الفيروسات التاجية ترميز أربعة بروتينات الهيكلية بما في ذلك البروتين ارتفاع (S), nucleocapsid (N), بروتين المغلف (E), وبروتين الغشاء (M). دخول سارس-CoV-2 يتطلب التفاعل بين المجال مستقبلات ملزمة (RBD) من S مع مستقبلات المضيف, أنزيم تحويل الأنجيوتنسين الإنسان 2 (hACE2), وانصهار الغشاء اللاحقة بعد انشقاق بروتيوليتيك بواسطة بروتياز سيرين الخلوية المضيفة, transmembrane protease سيرين 2 (TMPRSS2)5,6,7,8,9,10 . وقد تم الإبلاغ سابقا عن المناعية الفكاهية للبروتين S من السارس-CoV وقد ثبت الآن أيضا للسارس-CoV-211,12,13. في الواقع ، تم الكشف عن تحييد استجابات الأجسام المضادة ضد S في مصل النقاهة من مرضى السارس -CoV بعد 24 شهرا من العدوى14، مما يسلط الضوء على دورهم الحاسم في الاستجابة المناعية على المدى الطويل. وقد تم تحديد البروتين S كهدف لقاح واعدة، وبالتالي أصبح عنصرا رئيسيا في معظم اللقاحات قيد التطوير15،16.

وفي حين أن الكشف السريع عن تحييد الأجسام المضادة جانب حاسم من جوانب تطوير اللقاح، فإنه قد يلقي الضوء أيضا على معدل العدوى والمراقبة المصلية الوبائية في المناطق المتضررة17. النسخ المتماثل المختصة VSV الزائفة مع السارس-CoV-2 S glycoprotein, بدلا من البروتين البروتيني VSV البرية من نوع, لدراسة عدوى السارس-CoV-2 في إعدادات مستوى السلامة البيولوجية 2 تبرعت بلطف من قبل ويلان وزملاء العمل18. سيتم استخدام VSV التعبير عن ارتفاع (VSV-S) لتحديد استجابة الأجسام المضادة تحييد ضد بروتين ارتفاع السارس-CoV-2. كما VSV-S المستخدمة هنا يعبر أيضا عن تعزيز البروتين الفلوري الأخضر (eGFP), قد يتم الكشف عن بؤر eGFP في غضون 24 ساعة لقياس العدوى, في حين أن تشكيل البلاك يمكن أن يستغرق 48 إلى 72 ساعة. ملخص هنا هو بروتوكول بسيط وفعال لتحديد قدرة مصل المريض النقاهة لتحييد العدوى VSV-S-eGFP. ويمكن أيضا تكييف هذه الطريقة بسهولة لاستجواب العلاجات المحتملة الأخرى التي تهدف إلى تعطيل التفاعل الفيروسي المضيف للبروتين سارس-CoV-2 S.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. خلايا الطلاء (اليوم 1) لإنتاج وتحديد كمي من الفيروس الزائف سارس-CoV-2

  1. التحضير زراعة الأنسجة
    1. دافئ 1x دولبيكو الفوسفات العازلة المالحة (DPBS); دولبيكو النسر المعدل المتوسط (DMEM) التي تحتوي على 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS) و 1٪ البنسلين / العقدية (اختياري)؛ و 0.25٪ من حمض التتراكسيتيك تريبسين-إيثيلينديامين (EDTA) إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 15 دقيقة تقريبا.
    2. تطهير غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة مع الإيثانول 70٪، ووضع أطباق زراعة الأنسجة، ماصة باستور، وماصة المصلية في غطاء محرك السيارة ثقافة الأنسجة حسب الحاجة. إزالة برنامج تلفزيوني، DMEM، والتريبسين من حمام الماء، وتطهير مع الإيثانول 70٪ قبل وضعها في غطاء محرك السيارة ثقافة الأنسجة.
  2. طلاء والحفاظ على الخلايا
    1. تنمو خلايا Vero E6 في DMEM (التي تحتوي على 10٪ FBS) في قوارير زراعة الأنسجة T75 أو أطباق زراعة الأنسجة 15 سم في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2. مرور الخلايا حسب الحاجة عندما تكون الخلايا التقاء 80-90٪.
    2. غسل الخلايا بإضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني 1x إلى كل طبق وهزاز بلطف 4-5 مرات; يستنشق برنامج تلفزيوني. إضافة 3 مل من تريبسين-EDTA إلى كل طبق، صخرة لوحة لضمان تغطية السطح بأكمله. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 5 دقائق تقريبا، أو حتى الخلايا قد انفصلت.
    3. إضافة 7 مل من DMEM (التي تحتوي على 10٪ FBS) لتعطيل تريبسين، وإعادة إنفاق الخلايا عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا عدة مرات. تدور أسفل الخلايا لإزالة التريبسين باستخدام جهاز طرد مركزي benchtop في 500 × ز لمدة 5 دقائق، يستنشق وسائل الإعلام دون إزعاج بيليه الخلية، وإعادة إنفاق الخلايا في 10 مل من DMEM (التي تحتوي على 10٪ FBS). إذا كانت الخلايا مطلوبة للتجارب المستقبلية، ضع 1 مل في طبق جديد يحتوي على 15 مل من DMEM الطازج (يحتوي على 10٪ FBS).
    4. عد الخلايا باستخدام عداد الخلايا الآلي أو مقياس الدم، وإضافة ما يقرب من 1 × 107 خلايا إلى كل لوحة 15 سم، واحتضان في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 حتى أنها التقاء 100٪ (1-2 أيام).

2. VSV-S-EGFP إعداد الفيروس الزائف

  1. عدوى
    1. تصيب الخلايا في تعدد العدوى (MOI) 0.01 مع VSV-S-eGFP فيروس الأسهم في 12 مل من DMEM خالية من المصل لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2، هزاز لوحات في بعض الأحيان. استبدال inoculum مع DMEM جديدة (تحتوي على 2٪ FBS و 20 MM HEPES، درجة الحموضة 7.7)، والانتقال إلى حاضنة تعيين إلى 34 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
      ملاحظة: يلزم وجود درجة حرارة 34 درجة مئوية لنشر VSV-S-eGFP في زراعة الخلايا.
    2. جمع الخلايا الفائقة عند ملاحظة تأثير الاعتلال الخلوي واسعة النطاق (CPE) وانفصال الخلية، ما يقرب من 48 ساعة بعد العدوى. استخدام المجهر الفلورسنت لتصور التعبير واسعة من eGFP من قبل الخلايا المصابة ابتداء من 24 ساعة بعد العدوى.
  2. مجموعة
    1. طرد مركزي للناطجات باستخدام جهاز طرد مركزي على سطح المقعد لمدة 5 دقائق عند 1000 × غرام عند 4 درجات مئوية لإزالة حطام الخلية. Aliquot العملاقة لتجنب عدة دورات تجميد ذوبان الجليد، وتخزينها في -80 درجة مئوية.

3. تأليه VSV-S-eGFP الزائفة

  1. تخفيف المسلسل لتحديد التيتر الفيروسية
    1. لوحة Vero E6 الخلايا على لوحات 6-جيدا في كثافة البذر من 6 × 105 خلايا لكل بئر في DMEM (مع 10٪ FBS), واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
      ملاحظة: يمكن أيضا استخدام خلايا Vero التي تفرط في التعبير عن TMPRSS2 و hACE2.
    2. إعداد سلسلة تخفيف تسلسلي 10 أضعاف من فيروس VSV-S-eGFP في DMEM الخالية من المصل البارد عن طريق وضع 900 ميكرولتر من الوسائط في سبعة أنابيب الطرد المركزي الدقيق. أنابيب التسمية من 1 إلى 7. إضافة 100 ميكرولتر من المخزون الفيروسي إلى الأنبوب الأول ودوامة لفترة وجيزة. نقل 100 ميكرولتر من الفيروس المخفف من الأنبوب 1 إلى الأنبوب 2 ودوامة لفترة وجيزة؛ يستمر حتى الأنبوب 7.
    3. يستنشق الوسط من جميع آبار لوحة 6-well التي تحتوي على خلايا Vero E6 ، ويستبدل ب 500 ميكرولتر من التخفيفات10-2 إلى 10-7. احتضان لوحات لمدة 45 دقيقة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2،هزاز بلطف كل 15 دقيقة.
    4. أسبيرات inoculum واستبدال مع تراكب تحتوي على خليط 1:1 من 2x DMEM و 6٪ كاربوكسي ميثيل السليلوز (CMC)، والتركيز النهائي من 3٪ CMC، تكملها مع 10٪ FBS؛ حضانة في 34 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 48 ساعة.
      ملاحظة: قم بتدفئة خليط التراكب مسبقا في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة أثناء خطوة العدوى. ويمكن استخدام خليط 1:1 من 1٪ agarose مع 2x DMEM تكملها مع 10٪ FBS بدلا من CMC. لتراكب مع agarose، يغلي 1٪ agarose (في DH2O) وتخلط مع DMEM 2x الباردة. تأكد من أن الخليط هو درجة حرارة مناسبة قبل إضافة إلى أحادي الخلية (حوالي 37-40 درجة مئوية). إذا تم استخدام الآغاروز للتراكب ، فيجب إصلاح الخلايا عن طريق احتضان 2 مل من الميثانول 3:1: حمض الخليك لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل التلطيخ.
  2. تلطيخ وحساب التيتر الفيروسي
    1. تصور لويحات عن طريق تلطيخ مع الكريستال البنفسجي أو التصور المباشر من eGFP تحت المجهر الفلورسنت.
    2. إلى لوحات وصمة عار، يستنشق تراكب، يغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني، ثم إضافة 2 مل من 0.1٪ البنفسجي الكريستال (في 80٪ الميثانول وDH2O) إلى كل بئر. ضعه على طبق روك لمدة 20 دقيقة تقريبا في درجة حرارة الغرفة قبل إزالة التلطيخ. إزالة الكريستال البنفسجي، وغسل بلطف كل بئر مرتين باستخدام DH2O أو PBS.
      ملاحظة: يجب إجراء خطوات الغسيل والتلطيخ بلطف عن طريق الأنابيب ببطء نحو جانب كل بئر لضمان بقاء الطبقة الأحادية الخلية سليمة طوال العملية.
    3. السماح للوحات لتجف لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل عد لويحات. تأكد من الحصول على عدد البلاك من الآبار التي تحتوي على 20 إلى 200 لويحة. لحساب تأصل الفيروس في وحدات تشكيل البلاك (PFU) لكل مل ، قم بضرب عامل التخفيف من البئر الذي تم عده بحجم العدوى ، وقسم هذا العدد من اللويحات الموجودة في البئر المعني.
      figure-protocol-1

4. الخلايا الطلاء (اليوم 1) لقياس تحييد الفيروس الزائف سارس-CoV-2 بواسطة الأجسام المضادة المتاحة تجاريا ومصل المريض النقاهة

  1. التحضير زراعة الأنسجة
    1. إعداد غطاء محرك السيارة متوسطة وزراعة الأنسجة كما هو موضح في القسم 1. وبالإضافة إلى ذلك، إعداد العدد اللازم من 96 لوحة بئر لاستيعاب ما لا يقل عن 2 تكرار لكل عينة (أي لوحة واحدة لكل 6 عينات)؛ إضافة نسخ متماثلة إضافية إذا سمح نموذج وحدة التخزين.
  2. طلاء والحفاظ على الخلايا
    1. تنمو والحفاظ على خلايا Vero E6 كما هو موضح في القسم 1. إعداد ما لا يقل عن 10 مل من تعليق الخلية لكل لوحة 96 بئر بتركيز 2 × 105 خلايا لكل مل (لوحة 1.5 × 105 خلايا لكل مل للمقاهات التي أجريت بعد 48 ساعة، إذا لزم الأمر). إضافة 100 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل بئر من لوحة 96 بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات، واحتضان لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
      ملاحظة: اخلط تعليق الخلية جيدا، وهز كل لوحة بلطف في جميع الاتجاهات لضمان التوزيع حتى للخلايا.

5. الأجسام المضادة أو تخفيف المصل والالتهابات (اليوم 2)

ملاحظة: يمكن تطبيق هذا البروتوكول لقياس تحييد VSV-S-eGFP من قبل كل من الأجسام المضادة المتاحة تجاريا ومصل المريض، وكذلك المصل الذي تم جمعه من الحيوانات لدراسات تطوير اللقاح قبل السريرية. *يحيط علما بالخطوات الإضافية المدرجة عند التعامل مع عينات مصل المريض / الحيوان.

  1. سلسلة التخفيف التسلسلي
    1. قبل تمييع عينات المصل، بالحرارة تعطيل كل عينة في حمام مائي 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لاتعطل تكملة. ضمان اتخاذ احتياطات السلامة اللازمة عند التعامل مع عينات المرضى؛ فقط فتح حاويات العينة عندما تكون في غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة، وضمان احتواء المناسبة مستوى 2 معدات الحماية الشخصية هو بالية.
    2. إعداد سلسلة التخفيف في لوحة فارغة 96 جيدا (لوحة 1).
    3. ابدأ جميع التخفيفات في الصف A من لوحة 96-well في 80 ميكرولتر. * لعينات المرضى ، ابدأ سلسلة التخفيف في 1 من كل 10 عن طريق وضع 8 ميكرولتر من المصل في 72 ميكرولتر من DMEM الخالية من المصل (مع 1٪ البنسلين / الستريبتوميسين).
      ملاحظة: تركيز تحييد الأجسام المضادة المستخدمة سيعتمد على النشاط الذي تنبأت به الشركة المصنعة. للاطلاع على الأجسام المضادة لتحييد السارس-CoV-2 Spike المستخدمة هنا (انظر جدول المواد)،ابدأ ب 5 ميكروغرام/مل لمراقبة تحييد 50٪ على الأقل.
    4. إضافة 40 ميكرولتر من DMEM خالية من المصل (مع 1٪ البنسلين / العقدية) إلى الصفوف B إلى G، و 80 ميكرولتر إلى الصف H. لا تقم بإضافة فيروس إلى الصف H، حيث أنه يعمل كعنصر تحكم للخلايا فقط.
    5. باستخدام ماصة متعددة القنوات 12 جيدا، مزيج ونقل 40 ميكروغرام من المصل المخفف أو الأجسام المضادة من الصف A إلى الصف B. ميكس وكرر حتى الصف F، تجاهل 40 ميكروغرام من الصف F. لا تقم بإضافة مصل إلى الصف G لأنه يمثل صف التحكم بالفيروسات فقط.
  2. العدوى والتراكب
    1. إعداد حجم مناسب من VSV-S-eGFP المخفف لعلاج كل بئر في MOI 0.05 (أو 2000 pfu). (عند الانتهاء من هذا الحساب، ضع في اعتبارك أنه سيتم نقل 60 ميكرولتر فقط من إجمالي حجم 80 ميكرولتر إلى الخلايا؛ وبالتالي، تأكد من مضاعفة حجم الفيروس بنسبة 1.33 للحفاظ على 2000 pfu).
      ملاحظة: بما أن VSV-S-eGFP حساس لدرجة الحرارة، فتأكد من بقاء المخزونات الفيروسية على الجليد كلما لم تكن قيد الاستخدام، وتجنب دورات التجميد والذوبان المتعددة حيث سيختلف الثدي بعد التجميد المتكرر.
    2. إضافة 40 ميكرولتر من الفيروس المخفف إلى كل بئر في الصفوف من ألف إلى ز من لوحة 1 ومزيج عن طريق pipetting صعودا وهبوطا 4-5 مرات. احتضان لوحة لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
    3. إزالة لوحة تحتوي على خلايا من الحاضنة (لوحة 2)، وتنشق بعناية وسائل الإعلام من جميع الآبار. نقل 60 ميكرولتر من خليط الأجسام المضادة / الفيروسات من لوحة 1 إلى لوحة 2، واحتضان لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2،هزاز لوحة كل 20 دقيقة.
    4. أعلى كل بئر مع 140 ميكرولتر من تراكب تحتوي على CMC في DMEM لتركيز النهائي من 3٪ CMC (مع 10٪ FBS و 1٪ البنسلين / العقدية). ضع اللوحة 2 في حاضنة تم ضبطها على 34 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة تقريبا قبل التصوير.
      ملاحظة: قم بتدفئة خليط التراكب مسبقا في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة أثناء خطوة العدوى.

6. التصوير والتحديد الكمي (اليوم الثالث)

  1. لوحات الصور باستخدام صور الفلورسنت الآلي (باستخدام مرشح ايزوثيوسيانات الفلورسين (FITC) أو مرشح بديل مع الطول الموجي للإثارة من 488 نانومتر). قياس العدوى الفيروسية عن طريق إنشاء بروتوكول يحدد تلقائيا ويحسب بؤر eGFP الفردية. إذا لم تتوفر ميزة العد التلقائي، فاستخدم برنامج ImageJ لتحديد عدد بؤر eGFP.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يحدد هذا البروتوكول طريقة سريعة وفعالة للكشف عن تحييد الأجسام المضادة ضد بروتين سارس-CoV-2 S عن طريق تثبيط عدوى الفيروس الزائف VSV-S-eGFP (قابلة للقياس الكمي عن طريق فقدان بؤر eGFP المكتشفة). يتم تصوير تمثيل تخطيطي للبروتوكول في الشكل 1. من المستحسن استخدام الأجسام المضادة المتاحة تجاريا كتحكم إيجابي في كل مرة يتم فيها تشغيل المقايسة لضمان اتساق المقايسة. هنا، ونحن نظهر منحنى التخفيف باستخدام الأجسام المضادة IgG تحييد المتاحة تجاريا ضد السارس-CoV-2 سبايك RBD مقارنة مع التحكم IgG (انظر

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويمكن تكييف الطريقة الموصوفة هنا لتناسب بيئات المختبر وموارده المختلفة حسب الحاجة. الأهم من ذلك، القيد الرئيسي لهذا البروتوكول هو ضرورة وجود مستوى الاحتواء 2 الفضاء والأنسجة غطاء محرك السيارة. إن تطبيق فيروس الحمض النووي الريبي المستنسخ الزائف مع ارتفاع السارس-CoV-2، مثل VSV-S-eGFP، هو بديل هائل لفيروس سارس-كوف-2، الذي يتطلب منطقة عمل من المستوى 3 للاحتواء، ولكنه قد يظل قيدا بالنسبة لبعض المجموعات. جميع الخطوات الأخرى الموصوفة هنا مرنة للغاية ويمكن إجراؤها في أي مختبر من مستوى الاحتواء 2 تقريبا. على سبيل المثال، استخدام ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس للمؤلفين مصالح مالية متنافسة تتعلق بهذا المنشور.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نشكر مختبر ويلان على توفير فيروس VSV-S-eGFP المستخدم في هذا البروتوكول بسخاء (الموصوف في الحالة وآخرون 2020). نشكر أيضا الدكتورين بيل كاميرون وجوثابورن كوان (والفريق) لجمع عينات دم المريض (معرف بروتوكول REB 20200371-01H). يكشف المؤلفون عن تلقي الدعم المالي التالي للبحث والتأليف و / أو نشر هذه المقالة: تم تمويل هذا العمل من الدعم السخي من مؤسسة مستشفى أوتاوا ومنحة من المعاهد الكندية للبحوث الصحية (#448323) ومنحة سريعة من مؤسسة Thistledown للعلوم COVID-19 إلى C.S.I. T.R.J. يتم تمويلها من منحة أونتاريو للدراسات العليا وزمالة Mitacs العنقودية. يتم تمويل JP من قبل زمالة Mitacs العنقودية. T.A. ممولة من زمالة CIHR Banting. كما نود أن نشكر جميع الأفراد الذين شاركوا وتبرعوا بعينات دمهم لهذه الدراسة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.25٪ تريبسين EDTA (جيبكو)LS25200114علمية
فيشر سكان VTI HCSثيرمو فيشر العلميالفلورسنت الآلي
كربوكسي ميثيل السليلوزسيجماC5678
النسر المعدل من دولبيكو (جيبكو)فيشر العلمي10-013-CV
نسر دولبيكو المعدل's medium (مسحوق) (Gibco)ثيرمو فيشر Scientific12-800-017
Dulbecco' s محلول ملحي مخزن بالفوسفات (DPBS)فيشر العلمي21-031-CV
HEPESفيشر العلميBP-310-500
IgG التحكم في النمط النظيري (الماوس)ثيرمو فيشر Scientific31903
البنسلين / الستربتومايسينثيرمو فيشر العلمي15070063
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) الجسم المضاد المحايد للسبايك ، الفأر MabSinoBiological40592-MM57
خلايا Vero E6ATCC  [رل-1586
مصفوفة تصوير وسط ]

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19. Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 141-154 (2021).
  2. Burrell, C. J., Howard, C. R., Murphy, F. A. Coronaviruses. Fenner and White's Medical Virlogy. , 437-446 (2017).
  3. COVID-19 Map. Johns Hopkins Coronavirus Resource Center. , Available from: https://coronavirus.jhu.edu/map.html (2021).
  4. Zimmer, C., Corum, J., Wee, S. L. Covid-19 vaccine tracker. The New York Times. , Available from: https://www.nytimes.com/interactive/2020/science/coronavirus-vaccine-tracker.html (2021).
  5. Hoffmann, M., et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 181 (2), 271-280 (2020).
  6. Letko, M., Marzi, A., Munster, V. Functional assessment of cell entry and receptor usage for SARS-CoV-2 and other lineage B betacoronaviruses. Nature Microbiology. 5, 562-569 (2020).
  7. Azad, T., et al. Nanoluciferase complementation-based bioreporter reveals the importance of N-linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry. Molecular Therapy. , (2021).
  8. Brown, E. E. F., et al. Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268(2021).
  9. Azad, T., et al. SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: a Nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition. Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122(2021).
  10. Azad, T., et al. Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: Fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization. Membranes. 10 (9), 215(2020).
  11. Cao, Z., et al. Potent and persistent antibody responses against the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein in recovered patients. Virology Journal. 7, 299(2010).
  12. To, K. K. W. Temporal profiles of viral load in posterior oropharyngeal saliva samples and serum antibody responses during infection by SARS-CoV-2: an observational cohort study. The Lancet Infectious Diseases. 20 (5), 565-574 (2020).
  13. Gao, Q., et al. Development of an inactivated vaccine candidate for SARS-CoV-2. Science. 369 (6499), 77-81 (2020).
  14. Liu, W., et al. Two-year prospective study of the humoral immune response of patients with severe acute respiratory syndrome. Journal of Infectious Diseases. 193 (6), 792-795 (2006).
  15. Dong, Y., et al. A systematic review of SARS-CoV-2 vaccine candidates. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 237(2020).
  16. Amanat, F., Krammer, F. SARS-CoV-2 vaccines: Status report. Immunity. 52 (4), 583-589 (2020).
  17. Amanat, F., et al. A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in humans. Nature Medicine. 26 (7), 1033-1036 (2020).
  18. Case, J. B., et al. Neutralizing antibody and soluble ACE2 inhibition of a replication-competent VSV-SARS-CoV-2 and a clinical isolate of SARS-CoV-2. Cell Host and Microbe. 28 (3), 475-485 (2020).
  19. Garcia-Beltran, W. F., et al. Journal Pre-proof COVID-19 neutralizing antibodies predict disease severity and survival. Cell. 184 (2), 476-488 (2020).
  20. Zeng, C., et al. Neutralizing antibody against SARS-CoV-2 spike in COVID-19 patients, health care workers, and convalescent plasma donors. JCI insight. 5 (22), (2020).
  21. Whitman, J. D., et al. Evaluation of SARS-CoV-2 serology assays reveals a range of test performance. Nature Biotechnology. 38 (10), 1174-1183 (2020).
  22. Ainsworth, M., et al. Performance characteristics of five immunoassays for SARS-CoV-2: a head-to-head benchmark comparison. The Lancet Infectious Diseases. 20 (12), 1390-1400 (2020).
  23. Sharifkashani, S., et al. Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) receptor and SARS-CoV-2: Potential therapeutic targeting. European Journal of Pharmacology. 884, 173455(2020).
  24. Burki, T. Understanding variants of SARS-CoV-2. The Lancet. 397 (10273), 462(2021).
  25. Jayamohan, H., et al. SARS-CoV-2 pandemic: a review of molecular diagnostic tools including sample collection and commercial response with associated advantages and limitations. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 413 (1), 49-71 (2020).
  26. Nie, J., et al. Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by a pseudotyped virus-based assay. Nature Protocols. 15 (11), 3699-3715 (2020).
  27. Crawford, K. H. D., et al. Protocol and reagents for pseudotyping lentiviral particles with SARS-CoV-2 spike protein for neutralization assays. Viruses. 12 (5), 513(2020).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

SARS CoV 2 Neutralizing AntibodiesPseudovirus Neutralization AssayHigh Throughput ImagingFluorescent ImagingVero E6 CellsSpike Protein PseudovirusConvalescent SerumPlaque AssayCrystal Violet StainingAntibody Quantification

مقالات ذات صلة