مقالة منهجية

تحليل تقييد SAMHD1 عن طريق قياس التدفق الخلوي في خلايا U937 النخاعية البشرية

DOI:

10.3791/62502

⸱

يونيو 13, 2021

 ,  ,  , 
1Retrovirus-Host Interactions Laboratory, The Francis Crick Institute, 2Retroviral Replication Laboratory, The Francis Crick Institute, 3Sidney Sussex College, Department of Medicine, University of Cambridge

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الموصوفة هنا هي طريقة ثابتة لتحديد مدى تقييد فيروس نقص المناعة البشرية-1 بواسطة البروتين المثبط الخلوي SAMHD1. يتم نقل خلايا السلالة النخاعية البشرية U937 باستخدام ناقل تعبير SAMHD1 مشترك في التعبير عن YFP ، ويتم تمييزه ثم تحديه باستخدام فيروس نقص المناعة البشرية-RFP. يتم تحديد مستوى التقييد من خلال تحليل قياس التدفق الخلوي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمنع البروتين المعقم α / الهيستيدين والأسبارتات المحتوي على المجال 1 (SAMHD1) تكرار فيروس نقص المناعة البشرية-1 في الخلايا النخاعية الهادئة. تستخدم خلايا U937 على نطاق واسع كنظام خلوي مناسب لتحليل نشاط SAMHD1 بسبب انخفاض مستوى تعبير الحمض النووي الريبي SAMHD1 ، مما يؤدي إلى تعبير البروتين الداخلي الذي لا يمكن اكتشافه. استنادا إلى فحوصات مماثلة تم تطويرها في مختبر Stoye لتوصيف عوامل تقييد الفيروسات القهقرية الأخرى ، طور مختبر Bishop مقايسة تقييد بلونين لتحليل SAMHD1 في خلايا U937. تستخدم الجسيمات الشبيهة بفيروس سرطان الدم الفئرانية التي تعبر عن SAMHD1 ، إلى جانب YFP المعبر عنها من IRES ، لنقل خلايا U937. ثم يتم التعامل مع الخلايا مع خلات فيربول ميريستات للحث على التمايز إلى النمط الظاهري الهادئ. بعد التمايز ، تصاب الخلايا بجزيئات تشبه فيروس نقص المناعة البشرية-1 تعبر عن مراسل الفلورسنت. بعد 48 ساعة ، يتم حصاد الخلايا وتحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي. تتم مقارنة نسبة الخلايا المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية في السكان الذين يعبرون عن SAMHD1 مع تلك الموجودة في خلايا التحكم الداخلي التي تفتقر إلى SAMHD1. تكشف هذه المقارنة عن نسبة تقييد. يؤدي تعبير SAMHD1 إلى انخفاض بنسبة خمسة أضعاف في الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية ، وهو ما يتوافق مع نسبة تقييد تبلغ 0.2. وقد أدى استبدالنا الأخير ل RFP ب GFP الأصلي كجين مراسل لعدوى فيروس نقص المناعة البشرية إلى تسهيل تحليل قياس التدفق الخلوي.

تم استخدام هذا الفحص بنجاح لتوصيف تأثير بدائل الأحماض الأمينية على تقييد SAMHD1 عن طريق التحويل باستخدام الفيروسات التي تشفر بروتينات SAMHD1 المعدلة ، المشتقة من الطفرات الموجهة للموقع لمتجه التعبير. على سبيل المثال ، تظهر بدائل الموقع الحفاز HD206-7AA نمطا ظاهريا مقيدا من 1 ، مما يشير إلى فقدان نشاط التقييد. وبالمثل ، يمكن تحديد قابلية فيروسات الاختبار المختلفة. يمكن تكييف الفحص بشكل أكبر لدمج تأثير حالة التمايز ، وحالة التمثيل الغذائي ، ومعدلات SAMHD1 لفهم العلاقة بين SAMHD1 وحالة التمثيل الغذائي للخلية والتقييد الفيروسي بشكل أفضل.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعيق البروتين 1 (SAMHD1) المعقم α / الهستيدين - الأسبارتات (SAMHD1) تكرار فيروس نقص المناعة البشرية من النوع 1 (HIV-1) في الخلايا الهادئة من السلالة النخاعية. يمنع SAMHD1 النسخ المتماثل من خلال نشاطه الأنزيمي كثلاثي فوسفوهيدرولاز dNTP ، مما يؤدي إلى انخفاض مستويات dNTPs داخل الخلايا. ونتيجة لذلك ، لا يمكن ل HIV-1 إجراء عملية النسخ العكسي بكفاءة. وقد أحرز تقدم كبير في السنوات القليلة التي انقضت منذ هذه الملاحظة الأولية، ولا سيما فيما يتعلق بمساهمة مجالات محددة وأحماض أمينية في نشاط SAMHD1 المضاد للفيروسات. وقد تم إجراء هذه الرؤى باستخدام الفحوصات البيوكيميائية وكذلك أنظمة الخلايا التي تحاكي البيئة النخاعية الهادئة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. تستخدم خلايا U9371 على نطاق واسع كنظام خلية نخاعي مناسب لتحليل نشاط SAMHD1. ويرجع ذلك إلى نقص تعبير SAMHD1 الداخلي ، ويعتقد أنه يرجع إلى انخفاض مستويات الحمض النووي الريبي مقارنة بالخلايا المعبرة عن SAMHD1 (وهو مجال من مجالات البحث المستمر). هنا ، يصف البروتوكول النقل العابر لخلايا U937 مع جزيئات تشبه الفيروس تشارك في التعبير عن SAMHD1 ومراسل البروتين الفلوري الأصفر (YFP) لدراسة آلية تقييد SAMHD1 لفيروس نقص المناعة البشرية-1. تم تطوير هذه الفحوصات العابرة لقياس التدفق الخلوي بلونين لفحص قيود الفيروسات القهقرية لأول مرة في مختبر Stoye2 ومنذ ذلك الحين تم تكييفها للتحقيق في عوامل التقييد الأخرى ، بما في ذلك بروتينات الزخارف الثلاثية (TRIM)3. مستوحاة من هذه الفحوصات ، طور مختبر Bishop مقايسة بلونين لتحليل تقييد SAMHD1 في خلايا U937.

يظهر سير العمل الخاص بالتجربة في الشكل 1. تستخدم الجسيمات الشبيهة بفيروس سرطان الدم الفئراني (MLV) التي تحتوي على رسالة ثنائية السيسترونيك تشفر SAMHD1 إلى جانب YFP المعبر عنها من IRES لنقل خلايا U937. ثم يتم التعامل مع الخلايا مع خلات فيربول ميريستات (PMA) للحث على التمايز إلى النمط الظاهري الهادئ. تصاب الخلايا بعد ذلك بجزيئات تشبه فيروس نقص المناعة البشرية-1 تعبر عن بروتين الفلورسنت الأحمر (RFP). بعد 48 ساعة ، يتم حصاد الخلايا وتحليلها بواسطة قياس التدفق الخلوي بلونين. يستخدم هذا الفحص أيضا مع YFP وبروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) ، مما يتطلب مجموعات مرشحات أقل معيارية لتحليل قياس التدفق الخلوي. يسمح استخدام فيروس نقص المناعة البشرية-RFP بتعويض أكثر وضوحا ، وبالتالي يمكن الوصول إلى الفحص بسهولة أكبر لمستخدمي قياس التدفق الخلوي الأقل خبرة ، ويمكن تحقيقه باستخدام معظم مقاييس الخلايا.

أثناء التحليل ، تتم مقارنة نسبة الخلايا المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية بين الخلايا المعبرة عن SAMHD1 وتلك التي تفتقر إلى SAMHD1 داخل نفس البئر من الخلايا. هذا يوفر تحكما داخليا في أنبوب قياس الخلايا / التدفق الجيد ، وهي ميزة رئيسية. تكشف مقارنة مستويات العدوى في الخلايا المحولة وغير المحولة عن نسبة تقييد. تشير نسبة 1.0 إلى أن العامل المحول ليس له أي تأثير على العدوى. يؤدي تعبير SAMHD1 من النوع البري إلى انخفاض بنسبة خمسة أضعاف في الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية في هذا الفحص ، وهو ما يتوافق مع نسبة تقييد تبلغ 0.2. في حين أن هذا التأثير متواضع بالمقارنة مع عوامل التقييد الأكثر كلاسيكية مثل TRIM5 ، إلا أن التأثير قابل للتكرار ويسمح بتصنيف معبر SAMHD1 المعدل إلى تلك التي تقيد بطريقة مكافئة للبروتين من النوع البري ، وتلك التي تفشل في التقييد ، وتلك التي لها نمط ظاهري وسيط.

تم استخدام هذا الفحص بنجاح لتوصيف مجال SAMHD1 والأنماط الظاهرية لتقييد طفرات الأحماض الأمينية عن طريق التحويل باستخدام الفيروسات التي تشفر تسلسلات SAMHD1 المتحولة. على سبيل المثال ، تفشل بدائل الموقع الحفاز HD206-7AA في التقييد في هذا الاختبار. وبالمثل ، يمكن تحديد قابلية فيروسات الاختبار المختلفة. على سبيل المثال ، تكون طفرات النسخ العكسي لفيروس نقص المناعة البشرية-1 أكثر عرضة للتقييد بوساطة SAMHD1 (على سبيل المثال ، 151V4). يحدد هذا البروتوكول تفاصيل إنتاج الجسيمات الشبيهة بالفيروس (VLP) ، ونقل U937 مع ناقلات التعبير SAMHD1 ، والعدوى بفيروس نقص المناعة البشرية التي تحمل مراسل الفلورسنت والتحليل اللاحق عن طريق قياس التدفق الخلوي. تتناول هذه المقالة البيانات التي يمكن توقعها وكيفية تجنب النتائج دون المستوى الأمثل. وأخيرا ، يتم تحديد الاستخدامات البديلة للفحص ، بالإضافة إلى فحص متغيرات SAMHD1 المختلفة لفهم التفاعل بين مستويات SAMHD1 و dNTP والعدوى الفيروسية بشكل أكثر شمولا. بالنظر إلى دور SAMHD1 في مركز استقلاب الخلايا ، مع روابط إضافية بالسرطان ، لا يزال هذا مجالا ذا اهتمام شديد.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا يحتوي هذا البروتوكول على أي دراسات تشمل الحيوانات أو المشاركين البشريين التي أجراها أي من المؤلفين. تم تنفيذ جميع خطوات هذا البروتوكول وفقا للمبادئ التوجيهية ومدونات الممارسات للمؤسسات التي تم تنفيذها فيها.

1. نقل الخلايا التائية 293T لإنتاج VLP (كل من ناقلات التعبير SAMHD1 وجزيئات فيروس نقص المناعة البشرية المختبرة)

ملاحظة: أهم المساهمين في الإنتاج الناجح لجزيئات الفيروس هم صحة الخلايا التائية المنتجة 293T ، والالتقاء عند النقل ووقت الحصاد. وعادة ما يكون لدى المختبرات كواشف النقل المفضلة لديها وبروتوكول لإنتاج جسيمات الفيروسات القهقرية. ينتج عن البروتوكول التالي جزيئات معدية ذات نوعية جيدة ، ولكن البروتوكولات المكافئة ستكون مناسبة أيضا لهذا التطبيق. للحفاظ على نوعية جيدة 293T الخلايا ، والمرور ثلاث مرات على الأقل في الأسبوع للحفاظ على معدل نمو ثابت. يجب أن تكون الخلايا مبذرة في مرحلة سجل النمو من أجل نقل فعال.

  1. اليوم الأول: زرع العدد المطلوب من الأطباق 10 سم مع انقسام 1/4 من طبق شبه ملتقي من 293T الخلايا لإنتاج حوالي 60٪ من الالتقاء في اليوم التالي (حوالي 5 × 105 خلايا / مل). قد تحتاج إلى زرع عدة كثافات لتحقيق كثافة مناسبة للنقل في اليوم التالي عند العمل مع مخزون خلية جديد.
  2. اليوم 2 (صباحا): تحقق من وجود ما يقرب من 60٪ من الالتقاء بواسطة الفحص المجهري واستبدل الوسائط بلطف على الخلايا ب 10 مل من Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM).
  3. اليوم 2 (بعد الظهر ، على الأقل 4 ساعات بعد تغيير الوسائط): Transfect لإنتاج VLP.
    1. تشكل مزيج تخفيف الحمض النووي الذي يحتوي على 3 ميكروغرام لكل من البلازميد السريع gag-pol ، وبلازميد المراسل المتكرر طويل الطرف (LTR) وبروتين فيروس التهاب الفم الحويصلي G (VSV-G) (إجمالي 9 ميكروغرام ، انظر NOTE) في 600 ميكرولتر من DMEM الخالي من المصل. دوامة وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة (15 ثانية ، >500 × غرام).
    2. أضف 20 ميكرولتر من كاشف النقل (انظر جدول المواد) ، دوامة (لا ترسل جهاز طرد مركزي) واحتضنها عند 20 درجة مئوية لمدة 15-20 دقيقة. أضف مزيج النقل قطرة إلى الطبق ، وقم بالدوران بلطف للخلط ، والعودة إلى الحاضنة.
      ملاحظة: بالنسبة ل MLV VLP الذي يعبر عن SAMHD1 ، استخدم KB4 5,6 (بلازميد كمامة بول) ، pLGatewaySAMHD1IeYFP1 (بلازميد المراسل المدفوع ب LTR) و pczVSV-G7. بالنسبة ل HIV-RFP VLP ، استخدم P8.91 8,9 (بلازميد كمامة - بول السريع) ، SCRPSY10 (بلازميد المراسل المدفوع ب LTR) ، و PCZVSV-G. وتناقش البدائل في جدول المواد. قد تحتاج نسب البلازميد إلى التحسين لأنظمة البلازميد / النقل المختلفة.
  4. اليوم 3 (في وقت متأخر من الصباح): قم بإزالة الوسائط بعناية من الخلايا عن طريق السحب ، واغسلها ب 5 مل من DMEM الطازج ، واستبدلها ب 5 مل من DMEM الطازج.
  5. اليوم 4 (الصباح): حصاد الفيروس عن طريق جمع supernatant من الخلايا واستبداله ب 5 مل من DMEM الطازج. قم بتمرير supernatant المحتوي على VLP من خلال مرشح 0.45 نانومتر ، aliquot ونقله إلى -70 درجة مئوية للتخزين. تأكد من أن الأليكوتات ذات حجم مناسب للتجارب المخطط لها (250 ميكرولتر كاقتراح) لأن دورات التجميد والذوبان المتكررة ستؤدي إلى فقدان العيار الفيروسي.
  6. اليوم 5 (الصباح): حصاد الفيروس كما هو الحال في 1.5 ولكن تخلص من الأطباق بعد جمع supernatant.

2. معايرة VLP جديدة قبل الاستخدام

  1. اليوم 1: البذور 293T في 2 × 105 خلايا لكل بئر من صفيحة 24 بئرا - 4 آبار لكل فيروس ليتم معايرتها ، بما في ذلك فيروس معروف العدوى لكل عمود فقري. تحسين كثافة البذر لمخزون خلية معين.
  2. اليوم 2: راقب اللوحة للتحقق من الالتقاء (من الناحية المثالية ~ 70٪). قم بإذابة السوبرنات المحتوي على الفيروس من الخطوتين 1.5 و 1.6. أضف 0 أو 10 أو 25 أو 100 ميكرولتر إلى كل بئر.
  3. اليوم 4 (الصباح): حصاد الخلايا لتحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي.
    1. إزالة الوسائط عن طريق السحب الدقيق أو الطموح. اغسل الخلايا بلطف باستخدام 250 ميكرولتر من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS). قم بإزالة الخلايا من اللوحة عن طريق السحب لأعلى ولأسفل باستخدام 250 ميكرولتر PBS ، ونقلها إلى أنبوب جهاز طرد مركزي صغير. أضف 250 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالديهايد (مع أخذ التركيز النهائي إلى 2٪).
      تحذير: بارافورمالديهايد سام. لا ينبغي خلطه مع المطهرات القائمة على الكلور.
    2. قم بتكوير الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 500 × g لمدة 5 دقائق ، وتخلص من supernatant وأعد تعليق حبيبة الخلية في 200 ميكرولتر من PBS أو المخزن المؤقت البديل لقياس التدفق الخلوي. قم بتحليل طلب تقديم العروض أو YFP حسب الاقتضاء عن طريق قياس التدفق الخلوي. تطبيع عدوى مخزون فيروس معين مقابل قيم مخزون من العدوى المعروفة.
      ملاحظة: يمكن أيضا تطبيع VLP عن طريق اختبار الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم p24 (ELISA) ؛ ومع ذلك ، هذا ليس بالضرورة مؤشرا جيدا على عدوى VLP ، خاصة عندما يتم إعداد مخزونات VLP في عمليات نقل مختلفة. يمكن أن توفر طرق11 أيضا متوسط الجرعة المعدية المنشورة لزراعة الأنسجة أو تعدد العدوى (TCID50 / MOI) الكم النسبي ، على الرغم من أنها ليست راسخة بشكل جيد ل MLV. يوفر التألق النسبي بديلا فعالا من حيث التكلفة لطرق النسخ العكسي التجاري ELISA.

3. نقل U937 مع VLP يعبر عن SAMHD1 و YFP

ملاحظة: تشكل الخطوات من 3 إلى 6 تجربة التقييد. يتم ترقيم الأيام لسهولة التخطيط.

  1. اليوم الأول (بعد الظهر): إذابة VLP للنقل بما في ذلك MLV-Wild-type SAMHD1-YFP (التحكم الإيجابي) ، MLV-SAMHD1 (HD206-7AA)-YFP (التحكم السلبي) والمتغير MLV-SAMHD1-YFP (العينات التجريبية). قم بتخفيف VLP الطبيعي إلى حجم نهائي قدره 500 ميكرولتر باستخدام وسائط معهد روزويل بارك التذكاري 1640 (RPMI) في أنبوب microfuge ، وأضف 0.5 ميكرولتر من البوليبرين (10 مجم / مل) ، واخلطه عن طريق النقر.
    1. إذا تعذر معايرة VLP مسبقا ، فاستخدم 100 ميكرولتر في المقام الأول. استخدم نسبة 1:1 كحد أقصى من VLP إلى RPMI للحد من السمية التي يسببها VLP. تهدف إلى نقل ما يقرب من 30٪.
  2. Aliquot 5 × 105 U937 الخلايا في أنبوب microfuge معقم لكل حالة نقل. الكريات عن طريق الطرد المركزي في 500 × g لمدة 5 دقائق ، وإزالة supernatant (بما في ذلك اثنين من الأنابيب الإضافية كعناصر تحكم غير محولة لقياس التدفق الخلوي). أعد تعليق حبيبة الخلية في 500 ميكرولتر من VLP المخفف (أو RPMI لعناصر التحكم غير المحولة) ونقلها إلى بئر واحد من صفيحة 24 بئرا.
  3. قم بالتلقيح في جهاز طرد مركزي على الطاولة عند 800 × g لمدة 90 دقيقة عند 20 درجة مئوية. أضف 1 مل من 37 درجة مئوية RPMI إلى البئر واسمح لها بالتعافي في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 3 أيام.

4. تمايز U937 المنقول

  1. اليوم 4 (الصباح): أعد تعليق الخلايا عن طريق السحب بلطف ونقل 350 ميكرولتر إلى كل بئر من 4 آبار من صفيحة 12 بئرا. أضف 700 ميكرولتر من 37 درجة مئوية RPMI تحتوي على 150 نانومتر PMA إلى كل بئر مع إعطاء تركيز نهائي قدره 100 نانومتر والسماح بالتمايز لمدة 3 أيام.
    ملاحظة: يتم شراء PMA كمسحوق ويجب إعادة تعليقه إلى 1 mM في DMSO وتخزينه في الظلام. يجب إعداد مخزون عامل يبلغ 100 ميكرومتر عن طريق تخفيف 1/10 من مخزون 1 mM مع DMSO.

5. عدوى U937 المتباينة ، SAMHD1 المعبر عن فيروس نقص المناعة البشرية - RFP

  1. اليوم 7: مراقبة الخلايا عن طريق الفحص المجهري. تأكد من أن الخلايا ملتصقة. قم بشفط الوسائط من جميع الآبار ، وأضف 1 مل من RPMI إلى بئر 1 من كل مجموعة من 4 مما يسمح بالتحكم غير المنقول وغير المصاب بالإضافة إلى عناصر التحكم أحادية اللون. أضف مرة أخرى 0.5 مل من RPMI تحتوي على ما يقرب من 10 ميكرولتر من فيروس نقص المناعة البشرية-1-RFP (حوالي 10 نانوغرام p24 كدليل) إلى جميع الآبار الأخرى. تهدف إلى ما يقرب من 50 ٪ من العدوى.
  2. اليوم 8 (صباحا): أضف 0.5 مل من RPMI إلى كل بئر من الآبار المصابة.

6. تحليل التدفق الخلوي

ملاحظة: من الممارسات الجيدة تضمين بقعة حية ميتة في خطوط أنابيب قياس التدفق الخلوي. ومع ذلك ، إذا كانت خلايا U937 ذات نوعية جيدة ، فيمكن حذف هذه الخطوة دون عواقب سلبية على التحليل النهائي. يجب أن يؤدي السحب اللطيف للخلايا التربسينية بسهولة إلى تعليق خلية واحدة.

  1. اليوم 10 (الصباح): استنشاق وسائل الإعلام من الآبار وغسلها مرة واحدة باستخدام PBS. أضف 300 ميكرولتر من إنزيم تفكك الخلايا (أو التربسين) لمدة 5-10 دقائق. أضف 300 ميكرولتر إضافية من PBS ، وأعد تعليقها تماما مع التأكد من خروج جميع الخلايا من اللوحة ، وانقلها إلى أنابيب قياس التدفق الخلوي.
  2. أضف 300 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالديهايد (مع أخذ التركيز النهائي إلى 2٪). قم بتكوير الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 500 × g لمدة 5 دقائق ، وتخلص من supernatant وأعد تعليق حبيبة الخلية في 200 ميكرولتر من PBS أو المخزن المؤقت البديل لقياس التدفق الخلوي. تحليل عن طريق قياس التدفق الخلوي.
    ملاحظة: الخطوات أدناه هي لمحلل فورتيسا ، ولكن يمكن تحقيق تحليل مكافئ باستخدام أي محلل قادر على قراءة RFP و YFP التألق. استشر دعم قياس التدفق الخلوي المحلي أو باحث آخر من ذوي الخبرة قبل إعداد أي تحليل لقياس التدفق الخلوي. عندما تحتاج العديد من العينات إلى الفحص في نفس الوقت ، قد يكون من المناسب أخذ عينات عالية الإنتاجية. في هذه الحالة ، ينصح بعدد أكبر من الخلايا وحجمها.

7. تحليل التدفق الخلوي

  1. قم بتشغيل مقياس الخلايا قبل 10 دقائق من الحاجة إليه وقم بتشغيل الكمبيوتر. تحقق من أن النفايات فارغة وأن خزان الغمد ممتلئ.
  2. قم بتسجيل الدخول إلى الجهاز وافتح برنامج التحليل.
  3. حرك الذراع إلى الجانب ، وأخرج أنبوب الماء ، واضبط معدل التدفق على High واضغط على Prime. انتظر حتى ينطفئ الضوء وكرر ثلاث مرات أخرى.
  4. أعد تشغيل الماء وتشغيله عاليا لمدة 3 دقائق ثم قم بالتبديل إلى منخفض واضغط على وضع الاستعداد حتى الشروع في الاستحواذ.
  5. وفي الوقت نفسه إعداد التجربة داخل البرنامج:
    1. حدد تجربة/تجربة جديدة (الاسم وفقا للإرشادات المحلية). في المفتش ، احذف الفلوروكرومات غير المطلوبة ، تاركا Blue Laser 530/30 و Yellow Laser 610/20 أو مجموعات الليزر والمرشحات الموصى بها ل YFP و RFP للجهاز.
    2. انقر بزر الماوس الأيمن على التجربة واختر إعدادات مقياس الخلايا / إعدادات التطبيق / إنشاء ورقة عمل. في ورقة العمل، قم بإنشاء لطخة نقطة منطقة تشتت أمامية (FSC-A)/منطقة تشتت جانبية (FSC-A) ورسم بياني YFP ورسم بياني لطلب تقديم العروض ولطخة نقطة GFP/YFP بالنقر فوق الرمز المقابل وتغيير المحاور بالنقر فوق تسمية المحور.
    3. انقر بزر الماوس الأيمن مرة أخرى على التجربة وأضف عينة جديدة. إعادة تسمية حسب الاقتضاء. افتح العينة بالنقر فوق علامة الجمع للكشف عن أنبوب جديد.
  6. افتح لوحة معلومات الاكتساب من عرض، وقم بتحميل عنصر التحكم غير المصاب وغير المحول واضغط على اكتساب. اضبط فولتية FSC وSSC في لوحة المعلومات لوضع الخلايا في الربع السفلي الأيسر (لا توجد خلايا على المحاور). بوابة حول هذا السكان P1. انقر بزر الماوس الأيمن على قطع الأراضي الأخرى وحدد إظهار P1 لإزالة الحطام من التحليل اللاحق.
  7. قم بتحميل عنصر التحكم أحادي اللون ل YFP (SAMHD1 من النوع البري فقط) واحصل عليه. اضبط جهد YFP في لوحة القيادة بحيث تكون معظم خلايا الفلورسنت ضمن نطاق الكاشف (وليس على حافة المحور). كرر ذلك للتحكم في طلب تقديم العروض بلون واحد.
  8. قم بتشغيل التعويض التلقائي باستخدام عناصر التحكم غير المحولة وغير المصابة وأحادية اللون.
    1. حدد إعداد تعويض > التجربة > إنشاء عناصر تحكم التعويض من القائمة للتبديل إلى ورقة عمل عادية. حدد ورقة عمل عادية غير ملطخة، واضغط على تشغيل واحصل على عنصر تحكم غير ملطخ.
    2. ارسم بوابة حول الخلايا السليمة (P1) وسجلها. قم بإزالة الأنبوب ووضع الجهاز في وضع الاستعداد. انقر بزر الماوس الأيمن على P1 ، انقر فوق تطبيق على جميع عناصر التحكم في التعويض.
    3. قم بالتبديل إلى ورقة العمل العادية لطلب تقديم العروض، ثم اضغط على تشغيل. سجل عنصر التحكم في طلب تقديم العروض أحادي اللون، وضع الجهاز في وضع الاستعداد. يجب أن يختار البرنامج تلقائيا السكان الإيجابيين.
    4. كرر ذلك للتحكم بلون واحد YFP. حدد إعداد تعويض > التجربة > حساب التعويض > الارتباط والحفظ.
  9. التبديل إلى ورقة العمل العمومية. الحصول على الخلايا المنقولة مع النوع البري SAMHD1 ، المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية RFP والتحقق من أنه يمكن رؤية أربع مجموعات متميزة في زوايا الأرباع التي يتم محاذاتها رأسيا وأفقيا ل YFP و RFP ، على التوالي. قم بإزالة الأنبوب واضغط على وضع الاستعداد.
  10. أعد تحميل العينة غير المحولة وغير المصابة، واضغط على تشغيل وتسجيل 30000 حدث باستخدام P1 كبوابة إيقاف. كرر ذلك للعينات المتبقية (بما في ذلك عناصر التحكم الأخرى). أعد تسمية العينات أثناء التشغيل أو نشر hoc. بمجرد تصديرها، لا يمكن إعادة تسمية الملفات.
  11. تصدير البيانات كملفات .fcs وتنظيف الموائع وفقا للتعليمات المحلية.

8. تحليل البيانات

ملاحظة: تتوافق الخطوات التالية مع التحليل في FlowJo v10; ومع ذلك ، يمكن بسهولة تنفيذ خطوات مكافئة في برامج التحليل الأخرى.

  1. افتح البرنامج واسحب جميع ملفات .fcs إلى لوحة المعلومات. حدد عناصر التحكم في التعويض واسحبها إلى المجلد الفرعي للتعويض. افتح الملف للأنبوب غير المحول وغير المصاب بالنقر المزدوج ، مما سيؤدي إلى إظهار مؤامرة FSC-A / SSC-A.
  2. حدد أداة المضلع والبوابة على مجموعة الخلايا السليمة، باستثناء الحطام الموجود في الزاوية السفلية اليسرى. قم بتسمية هذه الخلايا. اسحب هذه البوابة إلى مجموعة الأنابيب بأكملها في شريط جميع العينات . قم بالتمرير عبر كل عينة فردية باستخدام أزرار الأسهم الأفقية للتأكد من أن البوابة مناسبة لكل أنبوب.
  3. انقر نقرا مزدوجا فوق مجتمع الخلايا للعينة غير المحولة وغير المصابة واضبط المحاور على FSC-Height (H) مقابل FSC-Area (A). حدد العدد الكبير الفردي باستخدام بوابة مستطيلة لاستبعاد المزدوجات. سيقترح البرنامج تلقائيا تسمية هذه الخلايا المفردة.
  4. اسحب هذه البوابة إلى جميع مجموعات الخلايا ومرة أخرى ، تحقق من أن البوابة مناسبة لجميع العينات. حدد مجموعة الخلايا المفردة للعينة غير المصابة وغير المحولة ، وقم بتغيير المحاور إلى ليزر أزرق تعويضي (y ، YFP) مقابل ليزر أصفر معوض (x ، RFP). اضغط على T على المحور وحدد المقياس ثنائي الأس ل x و y.
  5. حدد أداة البوابة الرباعية وانقر في أقصى يسار الجزء العلوي من مجموعة الخلايا السلبية. قم بتطبيق هذا المدخل الأولي على جميع مجموعات الخلايا المفردة عن طريق السحب إلى شريط كافة العينات. عندما لا تفصل البوابات الرباعية السكان بشكل مرض ، قد يكون من الضروري بوابة الأرباع الفردية باستخدام أداة المضلع ، كما في الشكل 2.
  6. قم بالتمرير إلى عينة SAMHD1 من النوع البري فقط (YFP فقط) وتحقق من صحة البوابة بين غير المقطوعة (سالبة YFP) وإيجابية YFP. قد يكون من المفيد التبديل إلى طريقة عرض كفاف للتمييز السلبي عن خلايا YFP الخافتة. إذا كانت خلايا YFP +ve العلوية منتشرة على نطاق واسع، فاضبط البوابة الرأسية العلوية على اليمين.
  7. قم بالتمرير عبر جميع العينات وتحقق من البوابة فيما يتعلق بإيجابية YFP. استخدم أفضل تقسيم بين YFP سلبي وإيجابي صالح لجميع العينات.
    ملاحظة: سيتم حساب التعويض استنادا إلى مستوى التعبير SAMHD1 YFP من النوع البري. إذا كانت مستويات العدوى مختلفة جدا بين الخلايا المحولة المختلفة SAMHD1-YFP ، فقد يلزم تعديل التعويض. لذلك يفضل تطبيع YFP VLP قبل الاستخدام.
  8. قم بالتمرير إلى الأنبوب غير المحول والمصاب بفيروس نقص المناعة البشرية-طلب تقديم العروض وتحقق مما إذا كان الحاجز بين طلب تقديم العروض السلبي غير المصاب وإيجابي طلب تقديم العروض المصاب صحيحا. اضبط حسب الاقتضاء ، باستخدام طريقة عرض الكفاف إذا لزم الأمر وقم بالتمرير عبر العينات المتبقية للتحقق من أن البوابة صالحة لجميع العينات.
  9. تتطلب كل عينة سلبيات مزدوجة (Q4: أسفل اليسار ، غير منقول ، غير مصاب) ، إيجابية YFP (Q1: أعلى اليسار ، SAMHD1 يعبر ، غير مصاب) ، إيجابية RFP (Q3: أسفل اليمين ، غير منقولة ، مصابة بفيروس نقص المناعة البشرية) ، وإيجابية مزدوجة (Q2: أعلى اليمين ، SAMHD1 تعبر عن الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية). افتح محرر الجدول بالنقر فوق الرمز واسحب البوابات الرباعية الأربعة إلى لوحة القيادة. حدد تصدير Excel وانقر فوق إنشاء جدول. احفظ جدول البيانات الذي تم إنشاؤه وفقا لاصطلاحات تسمية الملفات المحلية.
  10. لتصدير تمثيلات المؤامرات واستراتيجيات البوابات ، انقر فوق أيقونة محرر التخطيط . حدد كل مجموعة واسحب إلى المحرر مع المحاور ووضع العلامات والتباعد المطلوبة.
  11. لإنشاء تخطيط بنفس المخططات المعروضة لجميع العينات، حدد عمودا واحدا واضغط على الدفعة. اضغط على مقياس إلى العرض ثم تجنب فواصل الصفحات. احفظ بتنسيق الملف المطلوب.
  12. في جدول البيانات المصدر، احسب نسبة التقييد عن طريق إنشاء أعمدة النسبة المئوية لطلب تقديم العروض ل YFP-ves (RFP+ve / (السلبيات المزدوجة + RFP+ve)) والنسبة المئوية لطلب تقديم العروض من YFP+ves (الإيجابيات المزدوجة / (الإيجابيات المزدوجة + YFP+ve)) ثم عمود نهائي من (٪RFP من YFP+ve / ٪RFP من YFP-ve)، انظر الشكل 1. متوسط بيانات النسخ المتماثل لكل بنية SAMHD1 وحساب ما إذا كانت قيم التقييد لمتغيرات SAMHD1 المختبرة تختلف اختلافا كبيرا عن النوع البري و / أو 206-7AA باستخدام برنامج تحليل البيانات المناسب.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يجب أن تسفر نتائج التحليل أعلاه عن نسبة تقييد تبلغ 0.25 أو أقل للتحكم الإيجابي SAMHD1 من النوع البري ، و 1.0 للتحكم السلبي. إذا كان هذان الفحصان لمراقبة الجودة صالحين ، ففكر في الأهمية الإحصائية للنتائج. وبالتالي فإن متغيرات SAMHD1 التي لا تظهر فرقا كبيرا عن النوع البري تحمل بدائل لا تؤثر على تقييد SAMHD1 في هذا السياق. تلك التي تختلف اختلافا كبيرا عن النوع البري تظهر قيودا ضعيفة. إذا لم تكن هذه تختلف اختلافا كبيرا عن التحكم السلبي ، فإنها تفتقر إلى القدرة على التقييد في هذا السياق (الشكل 4 اللوحات اليسرى).

إذا كانت قيمة تقييد SAMHD1 من النوع البري أكبر من 0.3 ، فقد تكون نتائج فيروسات الاختبار إرشادية ولكن لا يمكن الاعتماد عليها. قد ينتج التقييد غير الفعال بواسطة البروتين من النوع البري عن استخدام خلايا U937 في وقت مبكر جدا بعد الشفاء من إعادة التكوين (في غضون أسبوعين) ، أو عندما تكون قديمة جدا (>2-3 أشهر). قد تحتاج هذه المعلمات إلى تحديد تجريبي لمخزون خلية معين. عادة ، كلما انخفض الممر ، كلما تمايزت الخلايا بشكل أكثر موثوقية وبالتالي توفر البيئة المناسبة لتقييد SAMHD1. قد يؤدي مستوى العدوى غير المناسب إما مع SAMHD1-YFP أو HIV-RFP أيضا إلى صعوبات في كل من التعويض وتحديد نسبة التقييد في المراحل النهائية. ويرد مثال على ذلك في اللوحات اليمنى من الشكل 4.

إذا انحرف التحكم السلبي عن 1.0 (خارج نطاق 0.9-1.2) ، فقد يشير ذلك إلى وجود مشكلة في التحليل ، إما أن نسبة الخلايا المصابة أو استراتيجية البوابة أو صحة الخلايا تؤثر على الفحص. ارجع إلى الملاحظات أعلاه.

figure-results-1
الشكل 1: بروتوكول تخطيطي محدد. VLP ، الجسيمات الشبيهة بالفيروسات ، PMA ، خلات phorbol myristate. تتوافق المراحل المرقمة مع المراحل في البروتوكول. الشكل المنتج باستخدام BioRender.com. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: مخطط البلازميدات الفيروسية الرجعية . (أ) ناقلات التعبئة (ب) ناقلات النقل (ج) معبر المغلف VSV-G. يتم عرض عناصر الترميز والتنظيم الرئيسية. لمزيد من التفاصيل، يرجى الرجوع إلى جدول المواد. CMV IE: الفيروس المضخم للخلايا الفوري المبكر المروج ، BGH: هرمون النمو البقري ، pA: polyA ، RRE: Rev Response Element ، CMV-LTR: مركب CMV-HIV-1 LTR المروج ، Psi: إشارة تغليف HIV-1 ، cPPT / CTS: مسار البولي بورين المركزي / تسلسل الإنهاء المركزي ، SV40: فيروس إخلاء سيميان 40. الشكل المنتج باستخدام BioRender.com. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: استراتيجية البوابات لتحليل التدفق الخلوي. (أ) ضوابط التعويض: تظهر اللوحة اليسرى بوابة FSC-A/SSC-A على الخلايا اللبقة للتحكم غير المنقول وغير المصاب. تعرض اللوحات المركزية واليمنى لقطات شاشة لعناصر التحكم في التعويض أحادية اللون ل YFP (في المنتصف) و RFP (يمين) مع بيانات غير معوض باللون الأسود وتعويضها باللون الأزرق. (ب) مصفوفة التعويض المقابلة وقطع الأراضي الخاصة بضوابط التعويض المذكورة أعلاه. (ج) استراتيجية البوابات. يتم التخلص من الحطام من خلال تحليل جميع الخلايا بواسطة FSC-A/SSC-A (اللوحة اليسرى). يتم استبعاد الثنائيات عن طريق البوابات على ارتفاع FSC مقابل المساحة (اللوحة المركزية). تعرض اللوحة اليمنى مثالا على تقييد فيروس نقص المناعة البشرية-1 بواسطة SAMHD1 من النوع البري. تظهر المحاور تألق ليزر أزرق وأصفر تعويضي يتوافق مع الخلايا الإيجابية YFP (SAMHD1) و RFP (HIV) على التوالي. يتم رسم البوابات الرباعية من خلال مقارنة عناصر التحكم السلبية وأحادية اللون ل RFP و YFP. تشير الأرقام إلى النسبة المئوية للسكان الوالدين. ستكون قيم التعويض ل YFP مع GFP أعلى بكثير ولكن من الممكن التمييز باستخدام مجموعات المرشحات المناسبة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: النتائج المتوقعة: البيانات المثالية مقابل البيانات دون المستوى الأمثل. (أ) مخططات YFP / RFP التمثيلية للبيانات المثلى (يسار) ودون المستوى الأمثل (يمين). تشير الأرقام إلى النسبة المئوية للسكان الوالدين. في اللوحة اليمنى ، تكون عدوى فيروس نقص المناعة البشرية منخفضة للغاية مما يخلق صعوبات في التعويض والبوابة. نسبة التقييد أعلى من المتوقع عند 0.5. (ب) قطع نسبة التقييد لمتغيرات SAMHD1 فيما يتعلق بالنوع البري (WT ، الأحمر) أو التحكم السلبي (HD206-7AA ، أسود) الذي تم إنشاؤه باستخدام برنامج إحصائي. تمثل كل نقطة قيمة نسخ متماثل. يتم عرض المتوسط والانحراف المعياري. كانت اختبارات t المقترنة بين كل مجموعة مهمة في جميع الحالات المتوقعة حيث تم عرضها. على اليسار: بيانات مثالية - يظهر WT التقييد المتوقع البالغ 0.2 تقريبا ، ويظهر السلبي 1.0. يختلف البديل R372D (الرمادي) اختلافا كبيرا عن WT ولكنه ليس مهما عن التحكم السلبي وبالتالي فقد القدرة على التقييد. على اليمين: بيانات دون المستوى الأمثل. هنا ، يتصرف السلبي كما هو متوقع ولكن في جميع النسخ المتماثلة الستة ، لا يظهر WT سوى نسبة تقييد تبلغ 0.5 ، بسبب انخفاض معدل الإصابة. التباين المنخفض داخل المجموعات يعني أن R143H يظهر نمطا ظاهريا وسيطا مختلفا إحصائيا عن WT والسلبي ، في حين أن G209S لا يقيد ؛ ومع ذلك ، ينبغي تكرار ذلك مع الخلايا الطازجة لأن التحكم الإيجابي لم يعط نسبة التقييد المتوقعة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كما نوقش في الملاحظات أعلاه ، تتمحور الجوانب الحرجة للبروتوكول حول الاحتفاظ بالنمط الظاهري الصحيح للخلية لإنتاج VLP ولخلق البيئة المناسبة لمراقبة قيود SAMHD1. أولا ، يعتمد التحليل الدقيق للتقييد بواسطة قياس التدفق الخلوي بلونين على تحقيق نسب مناسبة من الخلايا المحولة والمصابة بحيث يكون هناك ما يكفي من الخلايا في كل منطقة من مناطق المخطط للتحليل. على هذا النحو ، يجب أن يهدف الباحث إلى الحصول على وزارة الداخلية أقل من 1 (انظر البروتوكول). تؤدي معدلات النقل والعدوى التي تكون إما مرتفعة جدا أو منخفضة جدا إلى مشاكل في التحليل بسبب نقص الخلايا غير المصابة أو المصابة بشكل مضاعف. وبالمثل ، فإن معدل نقل مماثل لمتجهات SAMHD1 المراد مقارنتها هو المفتاح للسماح بتطبيق نفس مصفوفة التعويض والبوابة على التجربة بأكملها ، مما يزيد من الثقة في التحليل اللاحق.

ثانيا ، يعد عمر خلايا U937 المستخدمة عاملا رئيسيا في ما إذا كانت تفرق بنجاح. يمكن رصد التمايز الناجح من خلال مراقبة الالتزام ، وتقليل تحمض الوسائط بمرور الوقت بعد التمايز والتقييد الكافي من قبل التحكم الإيجابي للنوع البري في الفحص. كان التمايز لمدة تصل إلى 5 أيام ناجحا.

واحدة من المزايا الرئيسية لهذا الفحص هي مرونته. يمكن اختبار مجموعة متنوعة من الإصدارات المعدلة من SAMHD1 (المجالات والأحماض الأمينية وتسلسل الأنواع) عن طريق الطفرات البسيطة الموجهة للموقع للناقل أو الاستنساخ. وبالمثل ، يمكن استكشاف متغيرات فيروس المختبر. وقد استخدم الفحص سابقا لإثبات أن طفرات النسخ العكسي لفيروس نقص المناعة البشرية-1 مع انخفاض القدرة على ربط dNTP هي أكثر حساسية لتقييد SAMHD1. يمكن استخدام نفس المبدأ لاختبار تقييد الفيروسات الأخرى بواسطة SAMHD1. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام ظروف التمايز المختلفة أو التلاعب الاصطناعي بتركيزات dNTP داخل الخلايا لزيادة التحقيق في التفاعل بين الظروف داخل الخلايا ونشاط SAMHD1 ، وهو مجال للبحث النشط في مختبر بيشوب. كما تم وصف تفاعل SAMHD1 مع مختلف مثبطات النسخ العكسي للنيوكليوزيد ، وأظهر تأثير SAMHD1 باستخدام هذا الفحص المعدل للاستخدام في الخلايا الأولية12،13،14،15.

إن تكييف البروتوكول للاستخدام في الخلايا الأولية يتغلب على القيود التي يفرضها فحص الأنماط الظاهرية الأيضية في الخلايا المتحولة. ومع ذلك ، فإن التنسيق الحالي يسمح ببروتوكول مناسب وأقل تحديا من الناحية الفنية لتحليل الإنتاجية العالية ، خاصة مع استخدام مقياس التدفق الخلوي مع جهاز أخذ عينات عالي الإنتاجية. عند تكييف البروتوكول ، ينبغي النظر في قابلية الخلايا غير المحولة داخليا لتأثيرات المارة (مثل الإشارات المناعية).

كما هو الحال مع العديد من جوانب بيولوجيا الخلية ، من الضروري استخدام هذه المقايسات كجزء من نهج شامل لفهم ظاهرة معينة. إن الاستخدام المتوازي للمقايسات البيوكيميائية لنشاطSAMHD1 16 ، والقياس الكمي لبرك dNTP داخل الخلايا ، ومراقبة الأنماط الظاهرية الطافرة SAMHD1 في البشر ، خارج الجسم الحي وفي النماذج الحيوانية (التي تقوم بها المختبرات في جميع أنحاء العالم ، وبعضها موصوف في هذا العدد) هي المفتاح للفهم المتطور لهذا البروتين المعقد.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لغرض الوصول المفتوح، قام المؤلفون بتطبيق ترخيص حقوق الطبع والنشر العام CC BY على أي إصدار مخطوطة مقبولة من المؤلف ينشأ عن هذا التقديم. الآراء المعرب عنها هي آراء المؤلف (المؤلفين) وليس بالضرورة آراء المؤسسة الوطنية لحقوق الإنسان أو وزارة الصحة والرعاية الاجتماعية.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل معهد فرانسيس كريك ، الذي يتلقى تمويله الأساسي من أبحاث السرطان في المملكة المتحدة (FC001042 و FC001162) ، ومجلس البحوث الطبية في المملكة المتحدة (FC001042 و FC001162) ، وصندوق ويلكوم (FC001042 و FC001162) وجائزة ويلكوم ترست للباحث إلى JPS (108012 / Z / 15 / Z). شارك في تمويل العمل في جامعة كامبريدج مركز كامبريدج للأبحاث الطبية الحيوية التابع للمؤسسة الوطنية لحقوق الإنسان، وصندوق إيفلين (16/21)، وصندوق روزتريز الاستئماني (M590)، ومجلس البحوث الطبية في المملكة المتحدة (MR/S009752/1). الجائزة الأخيرة الممولة من المملكة المتحدة هي جزء من برنامج EDCTP2 الذي يدعمه الاتحاد الأوروبي.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
293T خلاياATCCCRL-3216
0.45 & مرشحات الحقنة mSartoriusFCT122
أطباق 10 سمCorning430167من خلال التعدي في ألواح / قوارير ذات سعة أعلى - انظر إرشادات كاشف التعدي
12 لوحة بئر Greiner665180
24 لوحة بئر Greiner662160
BD LSRFortessa محلل الخلاياBD Bioscience649225يمكن استخدام المحللات البديلة طالما أنها تستطيع قراءة RFP و YFP مضان
DMEMSigmaD6429ATCC توصي Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) لتحتوي على 4 ملي مولار L-glutamine و 4500 مجم / لتر جلوكوز و 1 ملي مولار بيروفات الصوديوم و 1500 مجم / لتر بيكربونات الصوديوم.
يمكن استخدام DMSOFisherBP-231-100
مصل الأبقار الجنينيGibco10500064
FlowjoBD Bioscience-برنامج التحليل
البديل-مجهر ضوئي ذو المجال الساطع
p8.91-مفسر HIV GagPol (PMID: 8602510)
بارافورمالدهيد (4٪ في PBS)Alfa AesarJ61889
PBSSigmaD8537
Penicillin-Streptomycin (10،000 U / mL)ThermoFisher15140122
phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)SigmaP8139
polybreneSigmaTR-1003
pKB4-سرطان الدم الفئران GagPol Expressor (PMID: 23035841)
pLGatewaySAMHD1eYFP-MLV تغليف البلازميد ترميز التسلسل البشري من النوع البري. التفاصيل وإجراءات الاستنساخ Arnold et al 2015 (المرجع 1).
pLGatewaySAMHD1HD206-7AAeY
FP		-كما هو مذكور أعلاه ، يقوم بتشفير بدائل الأحماض الأمينية في بقايا المواقع النشطة الحاسمة
PrismGraphpad-https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/برامج تمثيل البيانات الأخرى مناسبة أيضا
pVSV-G-VSV-G expressor (https://www.addgene.org/138479/) ، بديل: pMD2.G (https://www.addgene.org/12259/)
RPMIThermoFisher21875034
أنابيب الغطاء اللولبيStarLabE1415-2231
SCRPSY-تشفير البلازميد لفيروس نقص المناعة البشرية RFP ، سام ويلسون ، https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5026698/
شرائط 10 ملCorning10084450
Stripettes 5 ملCorning 10420201
سيكون TrypLE ExpressGibco12604021Trypsin مناسبا أيضا
وستعمل كواشف التعداء البديلةTurbofectThermoFisherR0531
U937ATCCCRL-1593.2
يمكن توسيع نطاق مستحضرات فيروس أي فيروس ، بشكل جيد أيضا خلايا

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sundström, C., Nilsson, K. Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937). International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).
  2. Bock, M., Bishop, K. N., Towers, G., Stoye, J. P. Use of a transient assay for studying the genetic determinants of Fv1 restriction. Journal of Virology. 74 (16), 7422-7430 (2000).
  3. Yap, M. W., Nisole, S., Lynch, C., Stoye, J. P. Trim5alpha protein restricts both HIV-1 and murine leukemia virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (29), 10786-10791 (2004).
  4. Arnold, L. H., et al. Phospho-dependent regulation of SAMHD1 oligomerisation couples catalysis and restriction. PLoS Pathogens. 11 (10), 1005194(2015).
  5. Groom, H. C. T., et al. Absence of xenotropic murine leukaemia virus-related virus in UK patients with chronic fatigue syndrome. Retrovirology. 7, 10(2010).
  6. Mothes, W., Boerger, A. L., Narayan, S., Cunningham, J. M., Young, J. A. Retroviral entry mediated by receptor priming and low pH triggering of an envelope glycoprotein. Cell. 103 (4), 679-689 (2000).
  7. Pietschmann, T., et al. Foamy virus capsids require the cognate envelope protein for particle export. Journal of Virology. 73 (4), 2613-2621 (1999).
  8. Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272 (5259), 263-267 (1996).
  9. Bainbridge, J. W., et al. In vivo gene transfer to the mouse eye using an HIV-based lentiviral vector; efficient long-term transduction of corneal endothelium and retinal pigment epithelium. Gene Therapy. 8 (21), 1665-1668 (2001).
  10. Kane, M., et al. Identification of interferon-stimulated genes with antiretroviral activity. Cell Host and Microbe. 20 (3), 392-405 (2016).
  11. Gao, Y., et al. Calculating HIV-1 infectious titre using a virtual TCID50 method. Methods in Molecular Biology. 485, Clifton, N.J. 27-35 (2009).
  12. Ordonez, P., et al. SAMHD1 enhances nucleoside-analogue efficacy against HIV-1 in myeloid cells. Scientific Reports. 7, 42824(2017).
  13. Ballana, E., et al. SAMHD1 specifically affects the antiviral potency of thymidine analog HIV reverse transcriptase inhibitors. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (8), 4804-4813 (2014).
  14. Huber, A. D., et al. SAMHD1 has differential impact on the efficacies of HIV nucleoside reverse transcriptase inhibitors. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (8), 4915-4919 (2014).
  15. Amie, S. M., et al. Anti-HIV host factor SAMHD1 regulates viral sensitivity to nucleoside reverse transcriptase inhibitors via modulation of cellular deoxyribonucleoside triphosphate (dNTP) levels. The Journal of Biological Chemistry. 288 (28), 20683-20691 (2013).
  16. Arnold, L. H., Kunzelmann, S., Webb, M. R., Taylor, I. A. A continuous enzyme-coupled assay for triphosphohydrolase activity of HIV-1 restriction factor SAMHD1. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (1), 186-192 (2014).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

YFP RFP

مقالات ذات صلة