يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تقليل نزيف الوريد البابي بعد التسريب أثناء زراعة الجزر داخل الكبد في الفئران

4K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/62530

⸱

مايو 10, 2021

 ,  ,  , 
1Department of Surgery, Medical University of South Carolina, 2Georgetown University, 3Ralph H. Johnson Veterans Affairs Medical Center

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

نقدم هنا إجراءات جراحية محسنة حول إجراء عملية زرع الجزر داخل البوابة بنجاح ، وهو إجراء جراحي ذي صلة سريريا ولكنه صعب تقنيا ، في الفئران.

الملخص

على الرغم من أن الكبد مقبول حاليا كموقع زرع أساسي للجزر البشرية في الإعدادات السريرية ، إلا أن الجزر يتم زرعها تحت كبسولة الكلى في معظم دراسات زراعة الجزر قبل السريرية للقوارض. يستخدم هذا النموذج بشكل شائع لأن زرع جزيرة الفئران داخل الكبد يمثل تحديا تقنيا ، ويمكن أن تموت نسبة عالية من الفئران من المضاعفات الجراحية ، وخاصة النزيف من موقع الحقن بعد الزرع. في هذه الدراسة ، تم عرض إجراءين يمكنهما تقليل حدوث نزيف الوريد البابي بعد التسريب. تطبق الطريقة الأولى إسفنجة جيلاتين مرقئ قابلة للامتصاص على موقع الحقن ، وتتضمن الطريقة الثانية اختراق إبرة حقن الجزيرة من خلال الأنسجة الدهنية أولا ثم في الوريد البابي باستخدام الأنسجة الدهنية كحاجز مادي لوقف النزيف. كلتا الطريقتين يمكن أن تمنع بشكل فعال موت الفئران الناجم عن النزيف. تم تقديم قسم الكبد بأكمله الذي يوضح توزيع الجزر وأدلة على تجلط الدم في الجزيرة بعد الزرع ، وهي ميزة نموذجية لزرع الجزر داخل الكبد. تعمل هذه البروتوكولات المحسنة على تحسين إجراءات زرع الجزر داخل الكبد وقد تساعد المختبرات على إعداد الإجراء لدراسة بقاء الجزيرة ووظيفتها في إعدادات ما قبل السريرية.

المقدمة

زرع الجزر داخل البوابة (IIT) عبر الوريد البابي هو الطريقة الأكثر استخداما لزرع الجزر البشرية في الإعدادات السريرية. يوفر نموذج IIT للفأر فرصة رائعة لدراسة زراعة الجزر واختبار الأساليب التداخلية الواعدة التي يمكن أن تعزز فعالية زراعة الجزر1. تم وصف IIT لأول مرة في 1970s واستخدامها من قبل عدة مجموعات1،2،3،4،5. استعادت شعبيتها بعد الاختراق في زرع الجزر البشرية في عام 20006،7. ومع ذلك ، استخدمت معظم دراسات زراعة الجزر كبسولة الكلى كموقع مفضل لزرع الجزر التجريبي بسبب نجاحها السهل. على العكس من ذلك ، فإن IIT أكثر تحديا من الناحية الفنية وأقل استخداما لدراسات زرع الجزر8,9. على عكس IIT ، ومع ذلك ، فإن الجزر المزروعة تحت كبسولة الكلى لا تعاني من التفاعل الالتهابي الفوري بوساطة الدم الذي يتميز بالجلطة والالتهاب ونقص تروية الأنسجة الكبدية ، وبالتالي يكون لها وظيفة أفضل من الجزر المزروعة في الكبد. لذلك ، قد لا يحاكي نموذج كبسولة الكلى تماما الضغوط التي تواجهها الجزر في زراعة الجزر البشرية 10،11،12.

واحدة من المضاعفات الرئيسية ل IIT في الفئران هي النزيف من موقع الحقن بعد الزرع ، مما قد يسبب 10-30 ٪ من الوفيات بين سلالات الفئران المختلفة 12. في هذه الورقة ، تم تطوير نهجين مكررين لوقف النزيف بسرعة أكبر وأمان وللحد من وفيات الفئران بعد IIT. سيساعد العرض المرئي لهذه التفاصيل الدقيقة الباحثين على تحديد الخطوات الرئيسية لهذا الإجراء الصعب تقنيا. بالإضافة إلى ذلك ، تم تحديد موقع الطعوم الجزرية في كبد المتلقي من خلال الفحص النسيجي لأنسجة الكبد الملطخة بالهيماتوكسيلين والإيوسين (H & E) (القسم بأكمله) التي تحمل الجزر المزروعة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم إجراء جميع الإجراءات بموافقة اللجان المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات في جامعة ساوث كارولينا الطبية ومركز رالف إتش جونسون الطبي في تشارلستون.

1. تحريض مرض السكري باستخدام الستربتوزوتوسين (STZ)

  1. إعداد الفئران المتلقية:
    1. وزن جميع الفئران بشكل فردي.
    2. تحقق من مستويات الجلوكوز في الدم من عينة دم الوريد الذيل باستخدام مقياس السكر.
  2. تحديد جرعة STZ لثلاثة سيناريوهات مختلفة:
    1. بالنسبة للفئران المصابة بمرض الكبد الدهني ، قم بحقن جرعة واحدة من STZ [40 مجم / كجم / يوم ، حقن داخل الصفاق (i.p)] لمدة 5 أيام متتالية.
    2. بالنسبة للفئران NOD-SCID ، قم بحقن 125 مجم / كجم من STZ ، حقنة واحدة ، أي بعد الصيام طوال الليل.
    3. بالنسبة للفئران C57BL/6 ، تحقن 225 مجم / كجم من STZ ، حقنة واحدة ، i.p.
  3. حسابات STZ (13.5 ملغم / مل):
    ملاحظة: هذا الحساب مخصص لخمسة فئران C57BL/6 بأوزان جسم تبلغ 30 جم:
    1. إجمالي أوزان الجسم: 5 فئران × 30 جم / ماوس = 150 جم
    2. STZ المطلوبة: 150 جم × 225 مجم / 1000 جم STZ = 33.75 مجم
  4. إعداد STZ:
    1. وزن STZ بعد الجرعة المحسوبة مسبقا.
    2. انقل مسحوق STZ الموزون إلى كوب سعة 10 مل على الجليد.
    3. أضف 3 مل من محلول سترات الصوديوم إلى الكأس لإذابة STZ.
    4. اخلطي جيدا ، وقم بتصفية التعقيم من خلال مسام 0.22 ميكرومتر ، واستخدمي محلول STZ في غضون 10 دقائق من التحضير.
  5. حقن STZ:
    1. قم بتحميل الكمية المطلوبة من محلول STZ (يكفي لماوس واحد) في حقنة 1 مل.
    2. إجراء الحقن داخل الصفاق في الربع الأيمن السفلي من بطن الماوس.
    3. راقب الفئران لمدة 5 دقائق بعد الحقن وتحقق من وجود أي علامات على عدم الراحة خلال هذه الفترة الزمنية قبل إعادتها إلى الأقفاص.
    4. راقب مستوى الجلوكوز في الدم من عينة دم الوريد الخلفي باستخدام مقياس السكر يوميا بعد حقن STZ.
      ملاحظة: في هذه التجربة ، تعتبر الفئران مصابة بمرض السكري عندما يكون مستوى الجلوكوز في الدم غير الصائم > 350 مجم / ديسيلتر لمدة يومين متتاليين.

2. إعداد الجزيرة

ملاحظة: تم استزراع الجزر البشرية في وسائط CMRL-1066 مع استكمال 10٪ من مصل البقر الجنيني (FBS) ، و 1٪ من البنسلين / الستربتومايسين (P / S) بكثافة 10000 رقم مكافئ للجزيرة (IEQ) لكل طبق زراعة خلايا 100 مم 9. تم استزراع جزر الماوس في DMEM بنسبة 10٪ FBS و 1٪ P / S بنفس الكثافة13. تم الحصول على ذكور NOD-SCID و C57BL/7 الفئران بين 6-10 أسابيع من العمر من مصادر تجارية.

  1. افصل الجزر المستزرعة عن طبق زراعة الخلايا عن طريق الخدش اللطيف.
  2. اختر يدويا الأعداد المطلوبة من الجزر (على سبيل المثال ، 300-350 جزيرة) باستخدام حقنة 1cc وضعها في أنابيب طرد مركزي دقيقة معقمة 1.5 مل على الجليد.
  3. قم بتدوير الأنبوب لمدة 10 ثوان باستخدام جهاز الطرد المركزي الدقيق.
  4. قم بإزالة السوبرناتانت ، مع ترك بعض السائل لتجنب فقدان الكريات.
  5. أعد تعليق الكريات في 200 ميكرولتر من HBSS مع ألبومين مصل البقر بنسبة 0.5٪ (BSA).
  6. استنشاق الجزر المعاد تعليقها في حقنة أنسولين سعة 0.5 مل.
  7. ضع المحقنة في وضع مستقيم. دع الجزر تغرق لمدة 1 دقيقة.
  8. ادفع المحقنة لإزالة جميع الفقاعات ، تاركا حوالي 100-150 ميكرولتر من الجزر التي تحتوي على سائل.
  9. ضع المحقنة رأسا لأسفل واضغط برفق على جانب المحقنة للسماح للجزر بالتوزيع بالتساوي في جميع أنحاء السائل. الجزر جاهزة الآن للحقن.

3. زرع الجزر

  1. حث والحفاظ على الماوس تحت التخدير العام مع 2 ٪ isoflurane. تحقق من عدم وجود ردود فعل دواسة لضمان التخدير السليم للحيوان.
  2. حلق وإزالة الفراء في منطقة البطن من الماوس.
  3. إعطاء جرعة واحدة قبل الجراحة من البوبرينورفين (0.1 مغ / كغ i.p.).
  4. تطهير المنطقة الجراحية بثلاثة مناديل متناوبة من 2٪ من اليود و 75٪ من الكحول.
  5. قم بإجراء بضع البطن باستخدام مقص صغير لتوليد شق 1-1.5 سم.
  6. افتح التجويف البريتوني باستخدام متراجع. اتبع إما الطريقة A أو الطريقة B كما هو مفصل أدناه.

4. الطريقة أ: (وقف النزيف مع رغوة هلام ، الشكل 1 أ) 14،15،16

  1. إعداد الماوس
    1. ضع شاشا معقما حول الشق.
    2. اسحب الأمعاء بلطف باستخدام ملقط واحتفظ بها على الشاش.
    3. التعرف على الوريد البابي حسب موقعه وكشفه جيدا.
    4. قم بتغطية الأمعاء بشاش ملحي دافئ رطب أثناء الجراحة بأكملها.
  2. أدخل إبرة حقنة الأنسولين المحملة مسبقا بالجزيرة عبر الوريد البابي بالقرب من الاثني عشر (الشكل 1B). للقيام بذلك ، أمسك الإبرة مع توجيه الثقب (الشطب) لأسفل ووضع زاوية سطح الفتحة موازية لجدار الوريد البابي قبل اختراق الجدار.
    1. اسحب المكبس لسحب بعض الدم (20-50 ميكرولتر) إلى المحقنة لخلط الجزر أولا.
    2. غرس الجزر في الوريد البابي ببطء أثناء سحب ودفع الغطس بشكل متكرر.
    3. ضع قطعة من رغوة الجل (حوالي 0.5 سم × 0.5 سم في الحجم) لتغطية موقع الحقن.
    4. اضغط على رغوة الجل لأسفل بطرف قطني أثناء سحب الإبرة من الوريد البابي.
    5. استمر في الضغط على الجل لمدة 2 دقيقة للتأكد من عدم وجود نزيف نشط.
    6. قم بلف طرف القطن فوق رغوة الجل وبعيدا عنها للتأكد من أن رغوة الجل تغطي الوريد البابي جيدا.

5. الطريقة ب: (وقف النزيف مع وسادة الدهون ، الشكل 1C) 17

  1. كشف الوريد البوابة بدقة.
    1. استخدم طرفين قطنيين لتثبيت الوريد البابي المكشوف من الجانبين الأيسر والأيمن.
    2. تحديد وسادة الأنسجة الدهنية بين الاثني عشر والوريد البابي.
    3. اخترق وسادة الدهون قبل إدخال الإبرة في الوريد البابي (الشكل 1D).
    4. غرس الجزر ، باتباع الإجراء المماثل الموصوف أعلاه في الجزء 4.2.1 و 4.2.2 من الطريقة A.
    5. اسحب الإبرة للخارج أثناء الضغط على الدهون بطرف قطني.
    6. استمر في الضغط على وسادة الدهون لمدة 1 دقيقة بعد إزالة الإبرة.
  2. بعد التأكد من عدم وجود نزيف من الوريد البابي ، أعد الأمعاء بلطف إلى التجويف البريتوني في موضعه الأصلي.
  3. اترك 0.5 مل من المياه المالحة الدافئة (36-37 درجة مئوية) في تجويف البطن قبل الإغلاق.
    ملاحظة: المياه المالحة الدافئة تسهل حركة الأمعاء بعد الجراحة والتعافي منها وتمنع نخر الأمعاء.
  4. أغلق طبقة العضلات بخياطة 5-0.
  5. أغلق طبقة الجلد بخياطة 4-0.
  6. ضع الماوس في قفص نظيف على وسادة تدفئة حتى يتعافى تماما من التخدير.
  7. استمر في تقديم مسكن (على سبيل المثال ، البوبرينورفين 0.1 مجم / كجم i.p) كل 12 ساعة وحرارة تكميلية لمدة 48 ساعة بعد الجراحة.
    ملاحظة: تستغرق عملية زرع الجزر حوالي 15-20 دقيقة لإكمالها.

6. H & E تلطيخ وصورة لقسم الكبد كله

  1. تروية الكبد
    1. ضع الماوس تحت التخدير كما هو موضح أعلاه في الجزء 3.1.
    2. كشف بعناية الوريد البابي وقطع الوريد الأجوف السفلي.
    3. قم بتحريك الكبد يدويا باستخدام 20 مل من 10٪ paraformaldehyde عبر الوريد البابي لمدة 5 دقائق تقريبا ، باستخدام حقنة 20 مل مع إبرة 25G 18.
      ملاحظة: يمكن لتروية الكبد إزالة الدم من أنسجة الكبد وتحسين تثبيت الكبد دون إزعاج ترقيع الجزيرة.
    4. تشريح الكبد كله perfed من الأعضاء الأخرى.
    5. إصلاح أنسجة الكبد pervoled في 10 ٪ paraformaldehyde لمدة 24 ساعة.
    6. تضمين الأنسجة في البارافين.
    7. قطع أقسام الأنسجة بسماكة 5 ميكرومتر لكل منها ووضعها على شريحة زجاجية للتلطيخ.
    8. قم بإجراء تلطيخ H&E والأنسولين والفيبرين والعدلات النووية متعددة الأشكال (PMN) باستخدام الطرق القياسية15,16.
    9. مسح قسم الكبد بالكامل تحت المجهر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

أجرينا عمليات زرع جزر متجانسة وجينية أجنبية عبر الوريد البابي. لوحظت وظيفة الكسب غير المشروع في الجزيرة بطريقة تعتمد على الجرعة في كل من نماذج زرع الجزر. في نموذج زرع الجزر المتلازمية باستخدام الفئران C57BL/6 ، أدى زرع 250 جزيرة إلى ارتفاع السكر في الدم المعياري العابر قبل أن تعود الفئران إلى ارتفاع السكر في الدم. وصلت الفئران التي تتلقى 500 جزيرة إلى مستوى السكر في الدم المعياري وحافظت عليه بعد 30 يوما من الزرع (الشكل 2 أ). أظهرت الفئران في كلتا المجموعتين زيادة في أوزان الجسم (

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في هذه الدراسة ، تم إثبات اثنين من الإجراءات المحسنة التي يمكن أن تمنع النزيف وقد تقلل من وفيات الفئران أثناء IIT الفأر. تمكن هذه الدراسة الباحثين من تصور نموذج زرع الجزر الفريد من نوعه في دراسة الاستجابة الالتهابية الفورية بوساطة الدم بعد الزرع. نموذج IIT هو نموذج مميز لدراسة بقاء الخلايا الجزرية والإصابات الإقفارية الكبدية استجابة لزرع الجزر19. هنا ، قمنا بتنقيح الإجراء بناء على دراسات سابقة وقللنا من وفيات الفئران المبكرة الناجمة عن المضاعفات. تم استخدام كل من الطريقة A14,15,16

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن جميع المؤلفين أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

تم دعم هذه الدراسة من قبل وزارة شؤون المحاربين القدامى (VA-ORD BLR & D MERITIT I01BX004536) ، ومنح المعهد الوطني للصحة # 1R01DK105183 ، DK120394 ، DK118529 ، إلى HW. نود أن نشكركم السيد مايكل لي والسيدة ليندسي سوابي على تحرير اللغة

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
10٪ فورمالين محايد مخزن v / vفيشر ساينتفيك23426796
1 مل حقنة مع إبرةAHSAH01T
20 مل حقنةBD301031
25G × 5/8 "إبر تحت الجلدBD305122
وسادات تحضير الكحول ، معقمةفيشر Scientific22-363-750
التخدير الحيواني نظامVetEquip، Inc.901806
بوبرينورفين هيدروكلوريد ، حقنPar Sterile Products ، LLCNDC 42023-179-05
أنابيب الطرد المركزي ، 15 ملفيشر ساينتفيك0553859A
CMRL-1066Corning15110CV
DMEMCorning10013CV
الإيثانول ، المطلق (200 دليل) ، درجة البيولوجيا الجزيئيةفيشر العلميBP2818500
مقص تشريح دقيق فائق الدقة 4 "شركةRoboz Surgical Instrument Co.RS-5882
مصل الأبقار الجنيني (FBS)Corning35011CV
FreeStyle  شرائط اختبار الجلوكوزAbbottLite
FreeStyleAbbottLite
Gelfoam (إسفنجة جيلاتين قابلة للامتصاص ، USP)Pharmacia & amp شركة Upjohn34201
ملقط Graefe 4 "طرف حساس للغايةRoboz Surgical Instrument Co.RS-5136
وسادة ساخنةمن أمازونB07HMKMBKM
حامل إبرة هيجار-بومغارتنر 5.25 بوصةشركة روبوز للأدوات الجراحيةRS-7850
حقنة الأنسولين بإبرة قياس 27BD879588
وسادات إعداد اليودفيشر Scientific19-027048
IsofluranePiramal للرعاية الحرجةNDC 66794-017-25
البنسلين / الستربتومايسين (P / S) خياطةHyCloneSV30010
البولي بروبيلين 4-0Med-Vet InternationalMV-8683
خياطة البولي بروبلين 5-0Med-Vet InternationalMV-8661
كلوريد الصوديوم ، محلول وريدي 0.9٪VWR2B1322Q
Streptozocin (STZ)SigmaS0130
الستارة الجراحية ، كاسيتالأنسجة المعقم Med-Vet InternationalDR1826
كاسيت الأنسجةفيشر Scientific22-272416
في الدم

المراجع

  1. Pellegrini, S., Cantarelli, E., Sordi, V., Nano, R., Piemonti, L. The state of the art of islet transplantation and cell therapy in type 1 diabetes. Acta Diabetology. 53 (5), 683-691 (2016).
  2. Ballinger, W. F., Lacy, P. E. Transplantation of intact pancreatic islets in rats. Surgery. 72 (2), 175-186 (1972).
  3. Wright, J. R., Hauptfeld, V., Lacy, P. E., et al. Induction of Ia antigen expression on murine islet parenchymal cells does not diminish islet allograft survival. American Journal of Pathology. 134 (2), 237-242 (1989).
  4. Toyofuku, A., et al. Natural killer T-cells participate in rejection of islet allografts in the liver of mice. Diabetes. 55 (1), 34-39 (2006).
  5. Goss, J. A., Nakafusa, Y., Finke, E. H., Flye, M. W., Lacy, P. E. Induction of tolerance to islet xenografts in a concordant rat-to-mouse model. Diabetes. 43 (1), 16-23 (1994).
  6. Hara, M., et al. A mouse model for studying intrahepatic islet transplantation. Transplantation. 78 (4), 615-618 (2004).
  7. Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).
  8. Wang, J., et al. Alpha-1 antitrypsin enhances islet engraftment by suppression of instant blood-mediated inflammatory reaction. Diabetes. 66 (4), 970-980 (2017).
  9. Gou, W., et al. Alpha-1 antitrypsin suppresses macrophage activation and promotes islet graft survival after intrahepatic islet transplantation. American Journal of Transplantation. , (2020).
  10. Contreras, J. L., et al. Activated protein C preserves functional islet mass after intraportal transplantation: A novel link between endothelial cell activation, thrombosis, inflammation, and islet cell death. Diabetes. 53 (11), 2804-2814 (2004).
  11. Moberg, L., et al. Production of tissue factor by pancreatic islet cells as a trigger of detrimental thrombotic reactions in clinical islet transplantation. Lancet. 360 (9350), 2039-2045 (2002).
  12. Melzi, R., et al. Intrahepatic islet transplant in the mouse: functional and morphological characterization. Cell Transplantation. 17 (12), 1361-1370 (2008).
  13. Wang, H., et al. Donor treatment with carbon monoxide can yield islet allograft survival and tolerance. Diabetes. 54 (5), 1400-1406 (2005).
  14. Desai, C. S., et al. Effect of liver histopathology on islet cell engraftment in the model mimicking autologous islet cell transplantation. Islets. 9 (6), 140-149 (2017).
  15. Cui, W., Angsana, J., Wen, J., Chaikof, E. L. Liposomal formulations of thrombomodulin increase engraftment after intraportal islet transplantation. Cell Transplantation. 19 (11), 1359-1367 (2010).
  16. Cui, W., et al. Thrombomodulin improves early outcomes after intraportal islet transplantation. American Journal of Transplantation. 9 (6), 1308-1316 (2009).
  17. Proto, C., Grasso, G., Fassio, P. G. Hepatoparenchymal clearance of indocyanine green in infectious hepatitis. Giornale di Malattie Infettive e Parassitarie. 20 (9), 845-851 (1968).
  18. Cabral, F., et al. Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion. Journal of Visualized Experiments. (132), e56993(2018).
  19. Khatri, R., Hussmann, B., Rawat, D., Gurol, A. O., Linn, T. Intraportal transplantation of pancreatic islets in mouse model. Journal of Visualized Experiments. (135), e57559(2018).
  20. Wang, H., et al. Autologous mesenchymal stem cell and islet cotransplantation: Safety and efficacy. Stem Cells Translational Medicine. 7 (1), 11-19 (2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تقليل نزيف الوريد البابي بعد التسريب أثناء زراعة الجزر داخل الكبد في الفئران
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.