هنا، نقدم استراتيجية مناعة لتوصيف تمايز الخلايا العملاقة، ونظهر كيف تسمح تلك الاستراتيجية بفرز الخلايا الضخمة في مراحل مختلفة مع مفرز خلايا مضان. يمكن تطبيق المنهجية على الأنسجة الأولية البشرية ، ولكن أيضا على الخلايا الضخمة المتولدة في الثقافة في المختبر.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الفينوتينوبينج المناعي وفرز الخلايا من MKs الإنسان من المصادر الأولية البشرية أو المتمايزة في المختبر من السلف الهيماتوبويات
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
التمايز Megakaryocyte (MK) يشمل عددا من الدورات البطينية التي تؤدي إلى متعدد الأضلاع للغاية (تصل حتى >64N) وخلية كبيرة للغاية (40-60 ميكرومتر). على عكس المعرفة المتزايدة بسرعة في megakaryopoiesis على بيولوجيا الخلية والمستوى الجزيئي ، يقتصر توصيف megakaryopoiesis عن طريق قياس التدفق الخلوي على تحديد MKs الناضجة باستخدام علامات سطحية خاصة بالنسب ، في حين أن مراحل التمايز السابقة MK لا تزال غير مستكشفة. هنا، نقدم استراتيجية مناعة تسمح بتحديد مراحل التمايز MK المتعاقبة، مع زيادة حالة الحيلة، في المصادر الأولية البشرية أو في الثقافات المختبرية مع لوحة دمج MK علامات سطح محددة وغير محددة. على الرغم من حجمها وهشاشتها، يمكن أن تكون MKs مناعية باستخدام اللوحة المذكورة أعلاه ومثرية بفرز الخلايا المنشطة بالفلورسينس في ظل ظروف محددة من الضغط وقطر الفوهة. يسهل هذا النهج الدراسات متعددة الوميك ، بهدف فهم أفضل لتعقيد megakaryopoiesis وإنتاج الصفائح الدموية في البشر. قد يشكل التوصيف الأفضل للأورام الضخمة أمرا أساسيا في تشخيص أو تشخيص الأمراض المرتبطة بالنسب والخبيثة.
المقدمة
تتطور الخلايا الضخمة (MKs) من الخلايا الجذعية الدموية (HSCs) بعد عملية معقدة تسمى megakaryopoiesis ، والتي يتم تنظيمها بشكل رئيسي من خلال هرمون thrombopoietin (TPO). تصف الرؤية الكلاسيكية ل megakaryopoiesis الرحلة الخلوية من HSCs من خلال سلسلة من المراحل الهرمية للأسلاف الملتزمين والخلايا السليفة ، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى عضو الكنيست الناضج. أثناء النضج ، تواجه MKs جولات متعددة من بطانة الرحم ، وتطوير نظام غشاء ترسيم معقد داخل الخلايا (DMS) ، والذي يوفر مساحة غشاء كافية لإنتاج الصفائح الدموية ، وإنتاج وتعبئة عدد كبير من العوامل الموجودة في الحبيبات المختلفة الموروثة من الصفائح الدموية الناضجة1و2
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وتم الحصول على عينات كاملة من الدم ونخاع العظم ومعالجتها وفقا لإعلان هلسنكي لعام 1964. تم الحصول على عينات دم كاملة من متبرعين أصحاء بعد إعطاء موافقة مستنيرة (ISPA) ، ضمن دراسة وافقت عليها لجنتنا الأخلاقية الطبية المؤسسية (مستشفى يونيفرسيتياريو سنترال دي أستورياس - HUCA-). تم الحصول على عينات نخاع العظم من نخاع العظم يستنشق المواد المهملة من المرضى الذين تدار في قسم أمراض الدم في مستشفى كلينيكو سان كارلوس (HCSC).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
نخاع العظم و بلويدي
في الشكل 4، نعرض تحليل مناعي تمثيلي ل megakaryopoiesis في عينات BM (الطموح) من المرضى. عند رسم كسر الخلوية ضد CD71 وCD31، لدينا بوابات ستة السكان الرئيسيين: CD31- CD71- (الأحمر)، CD31- CD71+ (الأزرق)، CD31+ CD71- (البرتقالي)، CD31+ CD71منتصف (الأخضر الفاتح)، CD31+ CD71+ (الأخضر الداكن) وCD31++ CD71منتصف (ك.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
معظم البحوث التي تركز على دراسة megakaryopoiesis عن طريق قياس التدفق الخلوي يقتصر حتى الآن على تحديد مجموعات فرعية MK باستخدام علامات سطح النسب فقط محددة(أي، CD42A/CD42B ، CD41/CD61) ، في حين تم فحص مراحل التمايز MK في وقت سابق بشكل سيئ. في هذه المقالة نعرض استراتيجية مناعة لمعالجة توصيف التدفق الشامل لقياس الخلايا من megakaryopoiesis الإنسان. عموما، نود أن تسليط الضوء على فائدة الجمع بين MK علامات سطح محددة وغير محددة (الجدولين 1 و 2) في نفس لوحة الأجسام المضادة قياس التدفق لدراسة megakaryopoiesis بطريقة أكثر ت.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
تم دعم إنتاج المواد السمعية البصرية من قبل BD Biosciences.
شكر وتقدير
ونشكر ماركوس بيريز باستريشيا ولورينا رودريغيز لورينزو وبغونا غارسيا منديز وبالوما سيريزو وألمودينا باييرو وماريا دي لا بوفيدا - كولومو على الدعم التقني. وقد دعم هذا العمل جزئيا من المنح الطبية (Roche SP200221001) إلى A.B، وهي زمالة RYC (RYC-2013-12587؛ الوزير دي إيكونوميا إي سيفيبيتفيداد، إسبانيا) ومنحة I+D 2017 (SAF2017-85489-P؛ الوزير دي سيينسيا، إنوفاسيون إي يونيفرسيدادس، إسبانيا وفودوس فيدر) إلى L.G. ، منحة سيفيرو أوتشوا (PA-20-PF-BP19-014؛ كونسيجيريا دي سيينسيا، إنوفاسيون إي يونيفرسيدادس ديل برينسيبيادو دي أستورياس، إسبانيا) إلى بي.M-ب. ومنحة ما بعد الدكتوراه داخل المنظمة لعام 2018 (Fundación para la Investigación y la Innovación Biosanitaria de Asturias - FINBA,....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 130 ميكرون فوهة | BD | 643943 | مطلوبة لفرز MK |
| 5810R جهاز طرد مركزي | عزل خلية | Eppendorf | |
| A-4-62 Swing Bucket Rotor | Eppendorf | Cell Isolation ويغسل | |
| Aerospray Pro Hematology Slide Stainer / Cellcentrifuge | ELITech Group | ابتكار علم الخلايا الآلي ، حيث يتم تلطيخ الشرائح ب Mat-Gr & uuml. nwald Giemsa | |
| CO2< / sub> حاضنة غالاكسي 170 S | Eppendorf | Cell Incubation | |
| Cytospin 4 جهاز طرد مركزي للخلايا | Thermo Scientific | لتحضير | |
| FACSAria IIu فارز | BD | ليزر 488 نانومتر و 633 نانومتر | |
| FACScanto II مقياس التدفق | الخلوي BD | ليزر 488 نانومتر و 633 نانومتر و 405 نانومتر | |
| Olympus Microscope BX 41 | أوليمبوس | ميكروفوتوغرافي أوليمبوس | |
| مجهر BX 61 | أوليمبوس | ميكروفوتوغرافي | |
| زوي تصوير الخلايا الفلورية | BioRad | Microphotographs | |
| للحصول على PBMCs | |||
| الدهون الكوليسترول الغني من مصل الأبقار | البالغ Sigma-Aldrich | L4646 | أو ما شابه ذلك |
| الليمفاوية | تقنيات | # 07801 | أو ما شابه |
| ذلك البنسلين - الستربتومايسين | سيجما ألدريتش | P4333 | أو ما شابه |
| من الإريثروبويتين البشري المؤتلف (EPO) | ؛ R & D Systems | 287-TC-500 | أو ما شابه |
| ذلك عامل الخلايا الجذعية البشرية المؤتلف (SCF) ثيرمو | فيشر العلمي ، جيبكو & التجارة ؛ | PHC2115 | أو ما شابه |
| ثثرة الدم البشري المؤتلف (TPO) ثيرمو | فيشر العلمي ، جيبكو & التجارة ؛ | ناهضات مستقبلات PHC9514 أو TPO | |
| StemSpan SFEM | Stem Cell Technologies | # 09650 | |
| تحليل قياس التدفق الخلوي ألبومين | |||
| مصل الأبقار | Merck | A7906-100G | أو ما شابه |
| ذلك BD CompBead Anti-Mouse Ig ، & kappa ؛ / مجموعة جزيئات تعويض التحكم السلبي | BD | 552843 | الأجسام المضادة للخلايا البشرية بشكل عام من الفأر. |
| BD Cytofix / Cytoperm | BD | 554714 | أو ما شابه |
| ذلك BD FACS Accudrop Beads | BD | 345249 | |
| CD31 AF-647 | BD | 561654 | ماوس مضاد للإنسان |
| CD31 FITC | Immunostep | 31F-100T | |
| CD34 FITC | BD | 555821 | ماوس مضاد للإنسان |
| CD41 PE | BD | 555467 | ماوس مضاد للإنسان |
| CD41 PerCP-Cy5.5 | BD | 333148 | ماوس مضاد للإنسان |
| CD42A APC | Immunostep | 42AA-100T | لاحظنا ارتباطا غير محدد ... التي تحتاج إلى تقييم |
| CD42A PE | BD | ماوس مضاد للإنسان | |
| CD42B PerCP | Biolegend | 303910 | ماوس مضاد للإنسان |
| CD49B PE | BD | ماوس مضاد للإنسان | |
| CD61 FITC | BD | 555753 | ماوس مضاد للإنسان |
| CD71 APC-Cy7 | Biolegend | 334109 | ماوس مضاد للإنسان |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Human BD Fc Block | BD | 564219 | Fc Blocking - Control |
| KIT PE-Cy7 | Biolegend | 313212 | Mouse Anti-Human |
| Lineage Cocktail 2 FITC | BD | 643397 | Mouse Anti-Human |
| RNAse | Merck | R6513 | أو ما شابه |
| ذلك Triton X-500 | Merck | 93443-500ML | أو ما شابه |
| مصافي الخلايا لفرز | |||
| مرشحات CellTrics 100 ميكرومتر | Sysmex | 04-004-2328 | مصافي الخلايا |
| ملاحظة: نحن لا نحدد الكواشف / المواد الكيميائية العامة (PBS ، EDTA ، إلخ) أو المستهلكات (الأنابيب ، إلخ) ، أو الكواشف المحددة في البروتوكولات المنشورة والقياسية السابقة ؛ - ما لم ينص على خلاف ذلك. |
المراجع
- Italiano, J. E. Unraveling Mechanisms That Control Platelet Production. Semin Thrombosis And Haemostasis. 39 (1), 15-24 (2013).
- Machlus, K. R., Italiano, J. E. The Incredible Journey: From Megakaryocyte Development To Platelet Formation. Journal ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
