مقالة منهجية

تحديد بروتينات المناعة المضادة للبكتيريا في الإشريكية القولونية باستخدام MALDI-TOF-TOF-MS/MS والتحليل البروتيومي من أعلى إلى أسفل

DOI:

10.3791/62577

⸱

مايو 23, 2021

 , 
1Produce Safety & Microbiology, Western Regional Research Center, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا نقدم بروتوكولا لتحديد سريع للبروتينات التي تنتجها البكتيريا المسببة للأمراض تسلسل الجينوم باستخدام MALDI-TOF-TOF قياس الطيف الكتلي جنبا إلى جنب وتحليل بروتيوميك من أعلى إلى أسفل مع البرامج التي وضعت في المنزل. أيونات البروتين ميتاستابل جزء بسبب تأثير حمض الأسبارتيك ويتم استغلال هذه خصوصية لتحديد البروتين.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يحدد هذا البروتوكول بروتينات المناعة للإنزيمات المبيدة للبكتيريا: colicin E3 والبكتيريا ، التي تنتجها سلالة الإشريكية القولونية المسببة للأمراض باستخدام تحريض المضادات الحيوية ، وتم تحديدها من قبل قياس الطيف الكتلي المترادف MALDI-TOF والتحليل البروتيومي من أعلى إلى أسفل مع البرامج المطورة داخليا. تم تحديد بروتين المناعة من الكوليسين E3 (Im3) وبروتين المناعة من البكتيريا (Im-Bac) من أيونات جزء بارزة من نوع b و / أو y التي تم إنشاؤها بواسطة الانقسام العمود الفقري للبوليبتيد (PBC) على الجانب C-terminal من حمض الأسبارتيك وحمض الجلوتاميك ومخلفات الهليون بواسطة آلية تجزئة تأثير حمض الأسبارتيك. البرنامج بمسح بسرعة في تسلسل البروتين سيليكو المستمدة من تسلسل الجينوم كله من سلالة بكتيرية. البرنامج أيضا يزيل تكراريا بقايا الأحماض الأمينية من تسلسل البروتين في حالة أن يتم اقتطاع تسلسل البروتين ناضجة. يمتلك تسلسل بروتين واحد أيونات الكتلة والشظايا بما يتفق مع تلك التي تم اكتشافها لكل بروتين مناعة. ثم تم فحص تسلسل المرشح يدويا للتأكد من إمكانية تعيين جميع أيونات الأجزاء المكتشفة. تمت إزالة ميثيونين N-terminal من Im3 بعد الترجمة ، في حين كان Im-Bac التسلسل الكامل. وبالإضافة إلى ذلك، وجدنا أن اثنين أو ثلاثة فقط من أيونات الشظايا غير التكميلية التي شكلتها لجنة البرنامج والميزانية ضرورية لتحديد تسلسل البروتين الصحيح. وأخيرا، تم تحديد مروج (صندوق SOS) في المنبع لجينات مضادة للبكتيريا والمناعة في جينوم بلازميد للسلالة البكتيرية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشار إلى تحليل وتحديد البروتينات غير المهضومة عن طريق قياس الطيف الكتلي على أنه التحليل البروتيوميكي من أعلى إلى أسفل1،2،3،4. وهي الآن تقنية راسخة تستخدم تأين الرذاذ الكهربائي (ESI)5 وتحليلات الكتلة عالية الدقة6، وتقنيات التفكك المتطورة ، على سبيل المثال ، فصاب نقل الإلكترون (ETD) ، فصيل التقاط الإلكترون (ECD)7، الفصام فوق البنفسجي للصور (UV-PD)8، إلخ.

تقنية التأين الناعمة الأخرى هي desorption الليزر بمساعدة المصفوفة / التأين (MALDI)9،10،11 التي تم استخدامها على نطاق أقل على نطاق واسع للتحليل من أعلى إلى أسفل ، ويرجع ذلك جزئيا إلى أنها تقترن في المقام الأول إلى وقت الطيران (TOF) محللات الكتلة ، والتي لديها دقة محدودة مقارنة مع محللات الكتلة الأخرى. وعلى الرغم من هذه القيود، استغلت أدوات MALDI-TOF وMALDI-TOF-TOF للتحليل السريع من أعلى إلى أسفل للبروتينات النقية والخليط المجزئ وغير المكسر من البروتينات. لتحديد البروتينات النقية، الاضمحلال في المصدر (ISD) هو تقنية مفيدة بشكل خاص لأنه يسمح تحليل الطيف الكتلي (MS) من أيونات شظايا ISD، فضلا عن الطيف الكتلي جنبا إلى جنب (MS/ MS) من شظايا أيون البروتين توفير جزء تسلسل محدد في كثير من الأحيان من N- و C-termini من البروتين المستهدف، على غرار تسلسل إدمان12،13 . العيب في نهج ISD هو أنه ، كما هو الحال في تسلسل إدمان ، يجب أن تحتوي العينة على بروتين واحد فقط. ويعزى شرط البروتين الوحيد إلى الحاجة إلى إسناد أيونات الشظايا بشكل لا لبس فيه إلى أيونات السلائف. إذا كان هناك اثنين أو أكثر من البروتينات الموجودة في عينة، قد يكون من الصعب تعيين أي أيونات الشظايا تنتمي إلى أي أيونات السلائف.

ويمكن معالجة إسناد أيونات الشظايا/السلائف باستخدام الملدي -TOF-TOF-MS/MS. وكما هو الحال مع أي تجربة كلاسيكية لمرض التصلب العصبي المتعدد/ مرض التصلب العصبي المتعدد، فإن أيونات السلائف يتم اختيارها/عزلها على نطاق واسع قبل التفتت، ويمكن أن تعزى أيونات الشظايا المكتشفة إلى أيون سلائف محدد. ومع ذلك ، تقتصر تقنيات الانفصال المتاحة لهذا النهج على التفكك الناجم عن تصادم الطاقة العالية في المقام الأول (HE-CID)14 أو الاضمحلال بعد المصدر (PSD)15،16. HE-CID و PSD هي الأكثر فعالية في تجزئة الببتيدات والبروتينات الصغيرة، ويمكن أن تكون تغطية التسلسل، في بعض الحالات، محدودة. وبالإضافة إلى ذلك، يؤدي PSD في شق العمود الفقري البولي ببتيد (PBC) في المقام الأول على الجانب C-المحطة من بقايا حمض الأسبارتيك والغلوتاميك من قبل ظاهرة تسمى تأثير حمض الأسبارتيك17،18،19،20.

وقد وجدت مالدي-TOF-MS أيضا تطبيق متخصصة في تحديد التصنيف من الكائنات الحية الدقيقة: البكتيريا21، الفطريات22، والفيروسات23. على سبيل المثال، تستخدم أطياف التصلب المتعدد لتحديد البكتيريا غير المعروفة بالمقارنة مع مكتبة مرجعية لأطياف MS للبكتيريا المعروفة باستخدام خوارزميات التعرف على الأنماط للمقارنة. وقد أثبت هذا النهج نجاحا كبيرا بسبب سرعته وبساطته، على الرغم من أنه يتطلب زراعة العزل بين عشية وضحاها. أيونات البروتين التي تم الكشف عنها من خلال هذا النهج (عادة تحت 20 كيلودا) تشمل بصمة MS السماح القرار التصنيفي على مستوى جنس والأنواع وفي بعض الحالات في الأنواع الفرعية24 وسلالة مستوى25،26. ومع ذلك، لا تزال هناك حاجة ليس فقط لتصنيف الكائنات الحية الدقيقة المسببة للأمراض بشكل تصنيفي فحسب، بل أيضا تحديد عوامل خبيثة محددة، والسموم، وعوامل مقاومة مضادات الميكروبات (AMR). ولتحقيق ذلك، يتم قياس كتلة الببتيدات أو البروتينات أو الجزيئات الصغيرة بالتصلب المتعدد ثم عزلها وتجزئتها بواسطة MS/MS.

البكتيريا المسببة للأمراض غالبا ما تحمل قطع دائرية من الحمض النووي تسمى البلازميدات. البلازميدات، جنبا إلى جنب مع البروبهاج، هي ناقل رئيسي لنقل الجينات الأفقية بين البكتيريا وهي مسؤولة عن الانتشار السريع لمقاومة مضادات الميكروبات وغيرها من عوامل الفوعة عبر البكتيريا. قد تحمل البلازميدات أيضا جينات مضادة للبكتيريا (AB) ، على سبيل المثال ، كوليسين وبكتيريا. عندما يتم التعبير عن هذه الجينات وإفراز البروتينات ، فإنها تعمل على تعطيل آلات ترجمة البروتين من البكتيريا المجاورة التي تحتل نفس المكانة البيئية27. ومع ذلك ، يمكن أن تشكل هذه الإنزيمات المبيدة للبكتيريا خطرا على المضيف الذي أنتجها. ونتيجة لذلك ، يتم التعبير عن الجين من قبل المضيف الذي يمنع على وجه التحديد وظيفة إنزيم AB ويشار إليه باسم بروتين المناعة (Im).

وغالبا ما تستخدم المضادات الحيوية الضارة بالحمض النووي مثل mitomycin-C و ciprofloxacin للحث على استجابة SOS في الإشريكية القولونية المنتجة للسموم في شيغا (STEC) التي يوجد جين سم شيغا(stx) داخل جينوم البروجاب الموجود في الجينوم البكتيري28. لقد استخدمنا التعريفي المضادات الحيوية، MALDI-TOF-TOF-MS/MS، وتحليل بروتيوميك من أعلى إلى أسفل سابقا للكشف عن وتحديد أنواع Stx والأنواع الفرعية التي تنتجها سلالات STEC29،30،31،32. في العمل السابق، STEC O113:H21 سلالة RM7788 كان مثقف بين عشية وضحاها على وسائل الإعلام أجار تكملها mitomycin-C. ومع ذلك ، بدلا من الكشف عن المتوقع B - subunit من Stx2a في م / ض ~7816 ، تم الكشف عن أيون بروتين مختلف في م / ض ~ 7839 وحددت على أنها بروتين افتراضي بلازميد المشفرة من وظيفة غيرمعروفة 33. في العمل الحالي، حددنا اثنين من البروتينات AB-Im المشفرة بلازميد التي تنتجها هذه السلالة باستخدام تحريض المضادات الحيوية، MALDI-TOF-TOF-MS/MS، وتحليل بروتيوميك من أعلى إلى أسفل باستخدام برامج مستقلة وضعت لمعالجة ومسح في تسلسل البروتين سيليكو المستمدة من تسلسل الجينوم الكامل (WGS). وبالإضافة إلى ذلك، أدرجت إمكانية إدخال تعديلات بعد الترجمة تتضمن اقتطاع التسلسل في البرنامج الحاسوبي. تم تحديد بروتينات المناعة باستخدام هذا البرنامج من الكتلة المقاسة من أيون البروتين الناضج أيونات جزء تسلسل محدد من لجنة البرنامج والميزانية الناجمة عن تأثير حمض الأسبارتيك والكشف عنها من قبل MS / MS-PSD. وأخيرا، تم تحديد مروج المنبع من الجينات AB / ايم في الجينوم البلازميد التي قد تفسر التعبير عن هذه الجينات عندما تتعرض هذه السلالة لمضاد حيوي ضار بالحمض النووي. تم تقديم أجزاء من هذا العمل في الاجتماع الافتراضي للجمعية الكيميائية الأمريكية الوطنية خريف 2020 والمعرض (17-20 أغسطس 2020)34.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد العينة الميكروبيولوجية

  1. تلقيح 25 مل من مرق لوريا (LB) في أنبوب مخروطي 50 مل مع E. coli O113:H21 سلالة RM7788 (أو سلالة بكتيرية أخرى) من مخزون الجلسرين باستخدام حلقة معقمة 1 ميكرولتر. كب الأنبوب وما قبل الثقافة عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز (200 دورة في الدقيقة) لمدة 4 ساعة.
  2. Aliquot 100 ميكرولتر من مرق ما قبل المستزرعة وانتشرت على لوحة أجار LB تكملها مع 400 أو 800 نانوغرام / مل من mitomycin-C. لوحات أجار الثقافة ثابت بين عشية وضحاها في حاضنة في 37 درجة مئوية.
    تنبيه: سلالات STEC هي كائنات دقيقة مسببة للأمراض. إجراء جميع التلاعبات الميكروبيولوجية، وراء زراعة، في خزانة السلامة البيولوجية BSL-2.
  3. حصاد الخلايا البكتيرية من مستعمرات مرئية واحدة باستخدام حلقة معقمة 1 ميكرولتر ونقلها إلى 2.0 مل O-حلقة مبطنة المسمار كاب أنبوب الطرد الدقيق التي تحتوي على 300 ميكروغرام من المياه HPLC الصف. كاب الأنبوب، دوامة لفترة وجيزة، والطرد المركزي في 11،337 × ز لمدة 2 دقيقة لبيليه الخلايا.

2. قياس الطيف الكتلي

  1. بقعة 0.75 ميكرولتر aliquot من عينة supernatant على الهدف MALDI الفولاذ المقاوم للصدأ والسماح لها لتجف. تراكب بقعة عينة المجففة مع a0.75 ميكرولتر aliquot من محلول مشبع من حمض السنابيني في 33٪ أسيتونيتريل، 67٪ من الماء، و 0.2٪ حمض ثلاثي الفلوروسيتيك. السماح بقعة لتجف.
  2. تحليل بقع العينة المجففة باستخدام مطياف كتلة MALDI-TOF-TOF.
    1. بعد تحميل هدف MALDI في مطياف الكتلة، انقر فوق الزر للحصول على الوضع الخطي MS في برنامج الاستحواذ. أدخل نطاق m/z المطلوب تحليله بإدخال m/z في الحدين السفلي والعلوي (على سبيل المثال، 2 كيلو دا إلى 20 كيلودا) في حقول كل منهما في برنامج أسلوب الاستحواذ.
    2. انقر فوق عينة بقعة لتحليلها على القالب الهدف MALDI في البرنامج. ثم قم باكتئاب زر الماوس الأيسر واسحب مؤشر الماوس فوق بقعة العينة لتحديد المنطقة المستطيلة التي سيتم أخذ عينات منها لإجراء إزالة/تأين بالليزر. تحرير زر الماوس واقتناء ستبدأ. جمع 1000 طلقة ليزر لكل بقعة عينة.
      ملاحظة: يتم عرض الحصول على البيانات في الوقت الحقيقي في إطار اقتناء البرامج.
    3. إذا لم يتم الكشف عن أيونات، قم بزيادة كثافة الليزر عن طريق ضبط شريط مقياس الانزلاق تحت كثافة الليزر في البرنامج حتى يتم الكشف عن إشارة أيون البروتين. ويشار إلى ذلك على أنه عتبة.
      ملاحظة: قبل تحليل عينة بقعة، معايرة خارجيا الصك في الوضع الخطي MS مع calibrants البروتين الذي m / z تمتد النطاق الذي يجري تحليله، على سبيل المثال، و +1 و +2 الدولة تهمة من calibrants البروتين: السيتوكروم-C، lysozyme، والميوجلوبين تغطي مجموعة كتلة من 2 كدا إلى 20 كيلودا. وتستخدم كتلة متوسطة ضمن نطاق الكتلة المحدد ككتلة تركيز، على سبيل المثال، 9 كيلودا. كتلة التركيز هي الأيون الذي يركز m/z بشكل أمثل للكشف عن طريق كاشف الوضع الخطي.
    4. عند اكتمال اكتساب الوضع الخطي MS، انقر فوق الزر للحصول على وضع انعكاس MS/MS في برنامج الاستحواذ. أدخل كتلة السلائف ليتم تحليلها في حقل كتلة السلائف. بعد ذلك، أدخل عرض العزلة (في Da) في نافذة كتلة السلائف للجانب الكتلي المنخفض والعالي من كتلة السلائف، على سبيل المثال، ±100 Da.
    5. انقر على زر إيقاف CID. انقر فوق الزر "منع Metastable على". ضبط كثافة الليزر إلى ما لا يقل عن 90٪ من قيمته القصوى عن طريق ضبط شريط مقياس انزلاق تحت كثافة الليزر في البرنامج.
    6. انقر فوق عينة بقعة لتحليلها على القالب الهدف MALDI في البرنامج. ثم قم باكتئاب زر الماوس الأيسر واسحب مؤشر الماوس فوق عينة البقعة لتحديد المنطقة المستطيلة التي سيتم أخذ عينات منها لإجراء إزالة الليزر/التأين. تحرير زر الماوس، وسوف تبدأ اقتناء. جمع 10000 طلقات الليزر لكل بقعة عينة.
      ملاحظة: قبل تحليل بقعة العينة، ينبغي معايرة الأداة خارجيا في وضع MS/MS-reflectron باستخدام أيونات الشظايا من تسوس ما بعد المصدر (PSD) لحالة الشحن +1 من ثيوريجوشين35.
  3. لا تعالج بيانات MS الخام. معالجة MS/MS-PSD البيانات الخام باستخدام التسلسل التالي من الخطوات بالترتيب المحدد: تصحيح خط الأساس المتقدم (32، 0.5، 0.0) متبوعا إزالة الضوضاء (انحرافين قياسيين) متبوعا تنعيم الغاوسية (31 نقطة).
  4. فحص بيانات MS/MS-PSD يدويا للتأكد من وجود أيونات أجزاء بارزة تم إنشاؤها بواسطة PBC19و20.
  5. تقييم بيانات MS/MS فيما يتعلق بالوفرة المطلقة والنسبية لأيونات الشظايا وإشارة إلى ضوضاء (S/N). استخدم فقط أيونات الأجزاء الأكثر وفرة لتحديد البروتين ، خاصة إذا كانت بيانات MS / MS-PSD صاخبة.

3. في بناء قاعدة بيانات بروتين سيليكو

  1. إنشاء ملف نصي يحتوي على تسلسل بروتين سيليكو من السلالة البكتيرية ، والتي سيتم مسحها ضوئيا من قبل برنامج البروتين Biomarker الباحث عن تحديد البروتين. وتستمد تسلسل البروتين من تسلسل الجينوم الكامل (WGS) من سلالة يجري تحليلها (أو سلالة وثيقة الصلة).
  2. الوصول إلى موقع NCBI / PubMed (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/) لتحميل ما يقرب من 5000 تسلسل البروتين من سلالة بكتيرية محددة (على سبيل المثال، Escherichia القولونية O113:H21 سلالة RM7788) يجري تحليلها. الحد الأقصى لحجم التنزيل هو 200 تسلسل.
    1. ونتيجة لذلك، نسخ ولصق التنزيلات 25 في ملف نصي واحد. حدد تنسيق FASTA (نص) لكل تنزيل.

4. تشغيل البروتين Biomarker الباحث البرمجيات

  1. انقر نقرا مزدوجا على الملف القابل للتنفيذ الباحث عن العلامات الحيوية البروتين. ستظهر نافذة واجهة مستخدم رسومية (GUI)(الشكل 1، اللوحة العلوية).
  2. أدخل كتلة العلامات الحيوية للبروتين (كما تقاس في الوضع الخطي MS) في حقل كتلة البروتين الناضجة. بعد ذلك، أدخل خطأ قياس الكتلة في حقل التسامح الجماعي. الخطأ القياسي لقياس الكتلة هو ±10 دا لبروتين دا 10000.
  3. اختياريا، انقر على زر حاسبة كتلة البروتين التكميلي b/y أيون من أجل حساب كتلة البروتين من زوج أيون جزء تكميلي المفترض (CFIP أو b/y). ستظهر نافذة منبثقة، أداة حاسبة كتلة البروتين (الشكل 1، اللوحة السفلية).
    1. أدخل m/z من CFIP المفترض وانقر على زر إضافة زوج. ستظهر كتلة البروتين المحسوبة.
    2. نسخ ولصق هذا الرقم في حقل الكتلة البروتين ناضجة وإغلاق نافذة أداة حاسبة كتلة البروتين.
  4. حدد طول إشارة ببتيد N-terminal بالنقر فوق مربع تقييد المخلفات المحددة. ستظهر نافذة منبثقة ذات مقياس ومؤشر منزلق. حرك المؤشر إلى طول الببتيد المطلوب للإشارة (الحد الأقصى 50). إذا لم يتم تحديد طول الببتيد إشارة، سيتم إجراء اقتطاع تسلسل غير مقيد من قبل البرنامج.
  5. تحت شرط أيون جزء في واجهة المستخدم الرسومية، حدد بقايا لانشقاق العمود الفقري البولي ببتيد (PBC). انقر على صناديق واحد أو أكثر من المخلفات: D، E، N، و / أو P.
    1. انقر على زر إدخال أيونات الأجزاء (+1) ليتم البحث فيها. ستظهر صفحة جزء منبثقة. بعد ذلك، انقر على زر إضافة جزء أيون، والذي يتوافق مع عدد أيونات الأجزاء التي سيتم إدخالها، أي بنقرة واحدة لكل أيون جزء. سيظهر حقل منسدل لكل أيون جزء يتم إدخاله.
    2. أدخل m/z من أيونات الأجزاء وتفاوت m/z المقترن بها. عند الانتهاء، انقر على الزر حفظ وإغلاق.
      ملاحظة: التسامح m/z معقول هو ±1.5.
    3. حدد الحد الأدنى لعدد أيونات الأجزاء التي يجب مطابقتها لتعريف عن طريق التمرير إلى الرقم المطلوب في المربع إلى يمين عدد أيونات الأجزاء التي تحتاج إلى مطابقة.
      ملاحظة: يجب أن تكون ثلاث مباريات كافية.
    4. حدد بقايا السيستين لتكون في حالتها المؤتأكسدة عن طريق النقر على الدائرة المقابلة. إذا لم يتم العثور على تحديدات البروتين بعد البحث، كرر البحث مع السيستين في حالتها المخفضة. إذا لم يتم العثور على أية هويات بعد البحث، قم بتوسيع تفاوت أيون جزء إلى ±3 وتكرار البحث.
  6. ضمن إعداد الملف، انقر فوق الزر تحديد FASTA File لاستعراض وتحديد الملف FASTA (النص) الذي يحتوي على تسلسل بروتين السيليكو في السلالة البكتيرية التي تم إنشاؤها سابقا في خطوات البروتوكول من 3.1 إلى 3.2. ثم حدد مجلد إخراج ثم قم بإنشاء اسم ملف إخراج.
  7. انقر على زر تشغيل البحث في إدخالات الملفات. ستظهر نافذة منبثقة بعنوان تأكيد معلمات البحث (الشكل 1، اللوحة السفلية) ، تعرض معلمات البحث قبل بدء البحث.
  8. إذا كانت معلمات البحث صحيحة، فانقر على زر بدء البحث. إذا لم تكن معلمات البحث صحيحة، فانقر على زر إلغاء الأمر ثم قم بإعادة إدخال المعلمات الصحيحة. بمجرد بدء البحث، تغلق نافذة المعلمة، وتظهر نافذة منبثقة جديدة مع شريط تقدم(الشكل 1،اللوحة السفلية) تظهر تقدم البحث وعدد الهويات التي تم العثور عليها.
  9. عند الانتهاء من البحث (بضع ثوان) ، شريط التقدم يغلق تلقائيا ، ويتم عرض ملخص للبحث في حقل سجل واجهة المستخدم الرسومية(الشكل 2، لوحة أعلى). بالإضافة إلى ذلك، ستظهر نافذة منبثقة جديدة تعرض أيضا تعريف البروتين (البروتينات) إن وجدت(الشكل 2،اللوحة السفلية).
    ملاحظة: في تسلسل بروتين سيليكو وجود بقايا غير معترف بها، على سبيل المثال، U أو X، يتم تخطي تلقائيا من التحليل ويتم الإبلاغ عن هذه التسلسلات في وقت لاحق مع نافذة منبثقة منفصلة لتنبيه المشغل إلى أي (إن وجدت) تم تخطي تسلسل عند الانتهاء من البحث.

5. تأكيد ما بعد البحث من تسلسل البروتين

  1. تأكيد صحة تسلسل المرشحين بواسطة التحليل اليدوي.
    ملاحظة: الغرض من برنامج الباحث عن العلامات الحيوية البروتين هو تحديد تسلسل البروتين بدقة عالية عن طريق القضاء على العديد من تسلسل البروتين غير صحيحة من النظر ودمج اقتطاع تسلسل ممكن PTM في البروتين ناضجة. وبما أن عدد تسلسلات المرشحين المحتملة التي يتم إرجاعها قليل، فإن التأكيد اليدوي يمكن التحكم فيه.
  2. إنشاء جدول متوسط m/z من أيونات جزء من نوع b و y من تسلسل المرشح باستخدام أي برنامج قياس الطيف الكتلي أو proteomic وجود مثل هذه الوظائف. قارن متوسط m/z في أيونات شظايا السيليكو على الجانب C-terminal من D-و E-و N-residues (وعلى الجانب N-terminal من بقايا P) ب m/z من أيونات الشظايا البارزة من بيانات MS/MS-PSD.
    ملاحظة: يجب أن تكون أيونات جزء MS/MS-PSD الأبرز مطابقة بسهولة إلى D-و E-و N المقترنة في أيونات جزء سيليكو. ومع ذلك، فإن تأثير حمض الأسبارتيك آلية التجزئة أقل كفاءة بالقرب من N- أو C-termini من تسلسل البروتين36.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الشكل 3 (لوحة أعلى) يظهر MS من STEC O113:H21 سلالة RM7788 مثقف بين عشية وضحاها على LBA تكملها مع 400 نانوغرام / مل mitomycin-C. وقد تم تحديد القمم في m/z 7276 و 7337 و 7841 سابقا كبروتين الصدمة الباردة C (CspC) وبروتين الصدمة الباردة E (CspE) وبروتين محمول بلازميد غير معروف الوظيفة ، على التوالي33. تم تحليل أيون البروتين في m/z 9780 [M +H]+ من قبل MS/MS-PSD كما هو موضح في الشكل 3 (اللوحة السفلية). تم عزل أيون السلائف مع نافذة م...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

اعتبارات البروتوكول
وتتمثل نقاط القوة الرئيسية للبروتوكول الحالي في سرعته وبساطة إعداد العينات واستخدام أداة يسهل تشغيلها نسبيا والتدريب عليها وصيانتها. على الرغم من أن التحليل البروتيوميكي من أسفل إلى أعلى ومن أعلى إلى أسفل بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة-ESI-HR-MS موجود في كل مكان ومتفوقا بكثير في العديد من النواحي على من أعلى إلى أسفل من قبل MALDI-TOF-TOF، إلا أنها تتطلب المزيد من الوقت والعمل والخبرة. ويمكن أن يؤثر تعقيد الأجهزة في كثير من الأحيان على ما إذا كان من المرجح أن يعتمد علماء غير مدربين ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ولا يوجد بين أصحاب البلاغ تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البروتين Biomarker الباحث البرمجيات متاحة بحرية (دون أي تكلفة) عن طريق الاتصال كليفتون ك. Fagerquist في clifton.fagerquist@usda.gov. نود أن نعترف بدعم هذا البحث من قبل ARS، وزارة الزراعة الأميركية، منحة CRIS: 2030-42000-051-00-D.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
4000 سلسلة إكسبلورر برنامجAB Sciexالإصدار 3.5.3
4800 بالإضافة إلى MALDI TOF / TOF AnalyzerAB Sciex
Acetonitrile Optima LC / MS الصففيشر الكيميائيةA996-1
BSL-2 خزانة بيوالمخاطرشركة بيكرSG403A-HE
السيتوكروم-سيسيجماC2867-10MG
برنامج Data ExplorerAB Sciexالإصدار 4.9
مجموعة التركيز لتقليل البروتين - الألكلةG-Biosciences786-231
برنامج GPMAWLighthouseData الإصدار 10.0
حاضنةVWR9120973
LB AgarInvitrogen22700-025
Luria BrothInvitrogen12795-027
الدقيقة ليزوزيمسيجماL4919-1G
، 2 مل ، غطاء لولبي ، حلقة Oفيشر Scientific02-681-343
MiniSpin Plus أجهزة الطرد المركزيEppendorf22620207
Mitomycin-C (من Streptomyces)Sigma-AldrichM0440-5MG
MyoglobinSigmaM5696-100MG
شاكر ماكس كيو 420 حصان موديل 420موديل علميحراري 420
حمض سينابينيك1861580حراري علمي
معقمة 1 حلقات ليلترفيشر ساینتفيك22-363-595
ثيوريدوكسين (بكتريا قولونية ، مؤتلف)سيجماT0910-1MG
حمض ثلاثي فلورو أسيتيكسيجما ألدريتش299537-100 جم
ماء أوبتيما LC / MS الصففيشر كيماوياتW6-4
أنابيب أجهزة الطرد المركزي

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fornelli, L., et al. Accurate sequence analysis of a monoclonal antibody by top-down and middle-down orbitrap mass spectrometry applying multiple ion activation techniques. Analytical Chemistry. 90 (14), 8421-8429 (2018).
  2. Fornelli, L., et al. Top-down proteomics: Where we are, where we are going. Journal of Proteomics. 175, 3-4 (2018).
  3. He, L., et al. Top-down proteomics-a near-future technique for clinical diagnosis. Annals of Translational Medicine. 8 (4), 136(2020).
  4. Wu, Z., et al. MASH explorer: A universal software environment for top-down proteomics. Journal of Proteome Research. 19 (9), 3867-3876 (2020).
  5. Konermann, L., Metwally, H., Duez, Q., Peters, I. Charging and supercharging of proteins for mass spectrometry: recent insights into the mechanisms of electrospray ionization. Analyst. 144 (21), 6157-6171 (2019).
  6. Bourmaud, A., Gallien, S., Domon, B. Parallel reaction monitoring using quadrupole-Orbitrap mass spectrometer: Principle and applications. Proteomics. 16 (15-16), 2146-2159 (2016).
  7. Hart-Smith, G. A review of electron-capture and electron-transfer dissociation tandem mass spectrometry in polymer chemistry. Analitica Chimica Acta. 808, 44-55 (2014).
  8. Brodbelt, J. S., Morrison, L. J., Santos, I. Ultraviolet photodissociation mass spectrometry for analysis of biological molecules. Chemical Reviews. 120 (7), 3328-3380 (2020).
  9. Karas, M., Bachmann, D., Bahr, U., Hillenkamp, F. Matrix-assisted ultraviolet-laser desorption of nonvolatile compounds. International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes. 78, 53-68 (1987).
  10. Karas, M., Bachmann, D., Hillenkamp, F. Influence of the wavelength in high-irradiance ultraviolet-laser desorption mass-spectrometry of organic-molecules. Analytical Chemistry. 57 (14), 2935-2939 (1985).
  11. Tanaka, K., et al. Protein and polymer analyses up to m/z 100 000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2 (8), 151-153 (1988).
  12. Resemann, A., et al. Top-down de Novo protein sequencing of a 13.6 kDa camelid single heavy chain antibody by matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight/time-of-flight mass spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (8), 3283-3292 (2010).
  13. Suckau, D., Resemann, A. T3-sequencing: targeted characterization of the N- and C-termini of undigested proteins by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 75 (21), 5817-5824 (2003).
  14. Mikhael, A., Jurcic, K., Fridgen, T. D., Delmas, M., Banoub, J. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight/time-of-flight tandem mass spectrometry (negative ion mode) of French Oak Lignin: A Novel Series of Lignin and Tricin Derivatives attached to Carbohydrate and Shikimic acid Moieties. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 34 (18), 8841(2020).
  15. Demirev, P. A., Feldman, A. B., Kowalski, P., Lin, J. S. Top-down proteomics for rapid identification of intact microorganisms. Analytical Chemistry. 77 (22), 7455-7461 (2005).
  16. Fagerquist, C. K. Unlocking the proteomic information encoded in MALDI-TOF-MS data used for microbial identification and characterization. Expert Review of Proteomics. 14 (1), 97-107 (2017).
  17. Gu, C., Tsaprailis, G., Breci, L., Wysocki, V. H. Selective gas-phase cleavage at the peptide bond C-terminal to aspartic acid in fixed-charge derivatives of Asp-containing peptides. Analytical Chemistry. 72 (23), 5804-5813 (2000).
  18. Herrmann, K. A., Wysocki, V. H., Vorpagel, E. R. Computational investigation and hydrogen/deuterium exchange of the fixed charge derivative tris(2,4,6-trimethoxyphenyl) phosphonium: implications for the aspartic acid cleavage mechanism. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 16 (7), 1067-1080 (2005).
  19. Rozman, M. Aspartic acid side chain effect-experimental and theoretical insight. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 18 (1), 121-127 (2007).
  20. Yu, W., Vath, J. E., Huberty, M. C., Martin, S. A. Identification of the facile gas-phase cleavage of the Asp-Pro and Asp-Xxx peptide bonds in matrix-assisted laser desorption time-of-flight mass spectrometry. Analytical Chemistry. 65 (21), 3015-3023 (1993).
  21. Luethy, P. M., Johnson, J. K. The use of Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) for the identification of pathogens causing sepsis. The Journal of Applied Laboratory Medicine. 3 (4), 675-685 (2019).
  22. Knabl, L., Lass-Florl, C. Antifungal susceptibility testing in Candida species: current methods and promising new tools for shortening the turnaround time. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 18 (8), 779-787 (2020).
  23. Gould, O., Ratcliffe, N., Krol, E., de Lacy Costello, B. Breath analysis for detection of viral infection, the current position of the field. Journal of Breath Research. 14 (4), 041001(2020).
  24. Fagerquist, C. K., et al. Sub-speciating Campylobacter jejuni by proteomic analysis of its protein biomarkers and their post-translational modifications. Journal of Proteome Research. 5 (10), 2527-2538 (2006).
  25. Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: a review. Mass Spectrometry Reviews. 32 (3), 188-217 (2013).
  26. Christner, M., et al. Rapid MALDI-TOF mass spectrometry strain typing during a large outbreak of Shiga-Toxigenic Escherichia coli. PLoS One. 9 (7), 101924(2014).
  27. Masaki, H., Ohta, T. Colicin E3 and its immunity genes. Journal of Molecular Biology. 182 (2), 217-227 (1985).
  28. Michel, B. After 30 years of study, the bacterial SOS response still surprises us. PLoS Biology. 3 (7), 255(2005).
  29. Fagerquist, C. K., Sultan, O. Induction and identification of disulfide-intact and disulfide-reduced beta-subunit of Shiga toxin 2 from Escherichia coli O157:H7 using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and top-down proteomics. Analyst. 136 (8), 1739-1746 (2011).
  30. Fagerquist, C. K., Sultan, O. Top-down proteomic identification of furin-cleaved alpha-subunit of Shiga toxin 2 from Escherichia coli O157:H7 using MALDI-TOF-TOF-MS/MS. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2010, 123460(2010).
  31. Fagerquist, C. K., et al. Top-down proteomic identification of Shiga toxin 2 subtypes from Shiga toxin-producing Escherichia coli by matrix-assisted laser desorption ionization-tandem time of flight mass spectrometry. Applied and Environmental Microbiology. 80 (9), 2928-2940 (2014).
  32. Fagerquist, C. K., Zaragoza, W. J., Lee, B. G., Yambao, J. C., Quiñones, B. Clinically-relevant Shiga toxin 2 subtypes from environmental Shiga toxin-producing Escherichia coli identified by top-down/middle-down proteomics and DNA sequencing. Clinical Mass Spectrometry. 11, 27-36 (2019).
  33. Fagerquist, C. K., Lee, B. G., Zaragoza, W. J., Yambao, J. C., Quiñones, B. Software for top-down proteomic identification of a plasmid-borne factor (and other proteins) from genomically sequenced pathogenic bacteria using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and post-source decay. International Journal of Mass Spectrometry. 438, 1-12 (2019).
  34. Fagerquist, C. K., Rojas, E. ACS Fall 2020 Virtual Meeting & Expo. American Chemical Society, Virtual. , (2020).
  35. Fagerquist, C. K., Sultan, O. A new calibrant for matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight-time-of-flight post-source decay tandem mass spectrometry of non-digested proteins for top-down proteomic analysis. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 26 (10), 1241-1248 (2012).
  36. Fagerquist, C. K., Zaragoza, W. J. Complementary b/y fragment ion pairs from post-source decay of metastable YahO for calibration of MALDI-TOF-TOF-MS/MS. International Journal of Mass Spectrometry. 415, 29-37 (2017).
  37. Quinones, B., Yambao, J. C., Lee, B. G. Draft genome sequences of Escherichia coli O113:H21 strains recovered from a major produce production region in California. Genome Announcements. 5 (44), 01203-01217 (2017).
  38. Harrison, A. G. The gas-phase basicities and proton affinities of amino acids and peptides. Mass Spectrometry Reviews. 16 (4), 201-217 (1997).
  39. Fagerquist, C. K. Polypeptide backbone cleavage on the C-terminal side of asparagine residues of metastable protein ions analyzed by MALDI-TOF-TOF-MS/MS and post-source decay. International Journal of Mass Spectrometry. 457, (2020).
  40. Fagerquist, C. K., Zaragoza, W. J. Mass Spectrometry: Application to the Clinical Lab 2019 (MSACL 2019). , Palm Springs, CA. (2019).
  41. Fagerquist, C. K., Zaragoza, W. J. Bacteriophage cell lysis of Shiga toxin-producing Escherichia coli for top-down proteomic identification of Shiga toxins 1 & 2 using matrix-assisted laser desorption/ionization tandem time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 30 (6), 671-680 (2016).
  42. Fagerquist, C. K., et al. Web-based software for rapid top-down proteomic identification of protein biomarkers, with implications for bacterial identification. Applied and Environmental Microbiology. 75 (13), 4341-4353 (2009).
  43. Fagerquist, C. K., et al. Rapid identification of protein biomarkers of Escherichia coli O157:H7 by matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight-time-of-flight mass spectrometry and top-down proteomics. Analytical Chemistry. 82 (7), 2717-2725 (2010).
  44. Maus, A., Bisha, B., Fagerquist, C., Basile, F. Detection and identification of a protein biomarker in antibiotic-resistant Escherichia coli using intact protein LC offline MALDI-MS and MS/MS. Journal of Applied Microbiology. 128 (3), 697-709 (2020).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

E3

مقالات ذات صلة