مقالة منهجية

اختيار الأجسام النانوية المثبطة المستهدفة بالناقل بواسطة الغشاء الصلب المدعوم (SSM) القائم على الفيزيولوجيا الكهربية

DOI:

10.3791/62578

⸱

مايو 3, 2021

 , 
1Biozentrum, University of Basel

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأجسام النانوية هي أدوات هامة في البيولوجيا الهيكلية وتشكل إمكانات كبيرة لتطوير العلاجات. ومع ذلك ، فإن اختيار الأجسام النانوية ذات الخصائص المثبطة يمكن أن يكون تحديا. هنا نظهر استخدام الغشاء الصلب المدعوم (SSM) القائم على علم الفيزيولوجيا الكهربية لتصنيف الأجسام النانوية المثبطة وغير المثبطة التي تستهدف ناقلات الأغشية الكهربائية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد استخدمت الأجسام المضادة مجال واحد (الأجسام النانوية) على نطاق واسع في الدراسات الميكانيكية والهيكلية للبروتينات وأنها تشكل إمكانات هائلة كأدوات لتطوير العلاجات السريرية، وكثير منها يعتمد على تثبيط البروتينات الغشائية مثل الناقلين. ومع ذلك، فإن معظم الأساليب المستخدمة لتحديد تثبيط نشاط النقل يصعب تنفيذها في إجراءات عالية الإنتاجية وتعتمد على توافر الركائز المسماة وبالتالي تعقيد فحص مكتبات الأجسام النانوية الكبيرة. الغشاء المدعوم بصلابة (SSM) علم الفيزيولوجيا الكهربية هو وسيلة عالية الإنتاجية، وتستخدم لوصف الناقلين الكهربائي وقياس الحركية النقل وتثبيط. هنا نعرض تنفيذ الفيزيولوجيا الكهربية القائمة على SSM لاختيار الأجسام النانوية المثبطة وغير المثبطة التي تستهدف ناقل ثانوي كهربائي لحساب الثوابت المثبطة للأجسام النانوية. قد تكون هذه التقنية مفيدة بشكل خاص لاختيار الأجسام النانوية المثبطة التي تستهدف الناقلين والتي لا تتوفر لها ركائز تحمل علامة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتكون الأجسام المضادة من سلسلتين ثقيلتين متطابقتين وسلاسل خفيفة مسؤولة عن ربط المستضد. Camelids والأجسام المضادة الثقيلة السلسلة فقط التي تظهر تقارب مماثلة لمضاد cognate مقارنة مع الأجسام المضادة التقليدية1،2. المجال المتغير واحد (VHH) من الأجسام المضادة ذات السلسلة الثقيلة فقط الاحتفاظ الكامل مستضد ملزمة المحتملة، وقد ثبت أن تكون مستقرة جدا1،2. وقد تم تنفيذ هذه الجزيئات VHH معزولة أو "الأجسام النانوية" في الدراسات المتعلقة البروتينات الغشاء الكيمياء الحيوية كأدوات لتثبيت الهيئات3،4، ومثبطات5،6، وعوامل تثبيت7، وكأدوات لتحديد هيكل8،9،10 . يمكن توليد الأجسام النانوية عن طريق تحصين camelids للتخصيب المسبق للخلايا B التي تشفر الأجسام النانوية الخاصة بالهدف والعزلة اللاحقة للخلايا B ، يليها استنساخ مكتبة الأجسام النانوية والاختيار عن طريق عرض phage11و12و13. ويستند وسيلة بديلة لتوليد الأجسام النانوية على أساليب اختيار في المختبر التي تعتمد على بناء المكتبات والاختيار عن طريق عرض phage، عرض الريبوسوم، أو عرض الخميرة14،15،16،17،18،19،20. تتطلب هذه الطرق في المختبر أحجام مكتبة كبيرة ولكنها تستفيد من تجنب تحصين الحيوانات وتفضل اختيار الأجسام النانوية التي تستهدف البروتينات ذات الاستقرار المنخفض نسبيا.

صغر حجم الأجسام النانوية، واستقرارها العالي وقابليتها للذوبان، وتقارب مستضد قوي، وانخفاض المناعة، وإنتاج سهل نسبيا، وجعلها مرشحة قوية لتطوير العلاجات21،22،23. على وجه الخصوص ، الأجسام النانوية التي تمنع نشاط بروتينات الأغشية المتعددة هي أصول محتملة للتطبيقات السريرية5،24،25،26. في حالة ناقلات الأغشية ، لتقييم ما إذا كان الجسم النانوي لديه نشاط مثبط ، من الضروري تطوير فحص يسمح بالكشف عن الركائز المنقولة و / أو الركائز المشتركة. وعادة ما تنطوي هذه المقايسات على جزيئات تحمل علامات أو تصميم أساليب كشف خاصة بالركيزة، والتي قد تفتقر إلى تطبيق عالمي. وعلاوة على ذلك، فإن تحديد الأجسام النانوية المثبطة يتطلب عموما فحص أعداد كبيرة من الموثقات. وبالتالي، أسلوب يمكن استخدامه في وضع الإنتاجية العالية و التي لا تعتمد على الركائز المسماة ضروري لهذا التحديد.

الفيزيولوجيا الكهربية القائمة على SSM هي تقنية حساسة للغاية ، تم حلها زمنيا للغاية تسمح باكتشاف حركة الشحنات عبر الأغشية (على سبيل المثال ، ربط / نقل الأيونات)27،28. وقد تم تطبيق هذه التقنية لتوصيف الناقلين الكهربائي، والتي يصعب دراستها باستخدام تقنيات الفيزيولوجيا الكهربية الأخرى بسبب الدوران المنخفض نسبيا لهذه البروتينات29و30و31و32و33و34و35. لا يتطلب علم الفيزيولوجيا الكهربية SSM استخدام الركائز المسماة ، بل هو مناسب لفحص عالي الإنتاجية ، ويمكن استخدام البروتيوليبوبوسومات أو الحويصلات الغشائية التي تحتوي على الناقل المثير للاهتمام. هنا، ونحن نثبت أن الفيزيولوجيا الكهربية القائمة على SSM يمكن استخدامها لتصنيف الأجسام النانوية الموجهة للنقل مع خصائص مثبطة وغير مثبطة. كدليل على المبدأ, ونحن نصف إعادة تشكيل ناقل الكولين البكتيرية في الليبوسومات, تليها خطوات مفصلة لشل حركة البروتيوليبوسومات على أجهزة الاستشعار SSM. ونحن بعد ذلك وصف كيفية أداء القياسات الكهربية القائمة على SSM للنقل الكولين وكيفية تحديد تركيز فعال نصف القصوى (EC50). ثم نعرض كيفية استخدام الفيزيولوجيا الكهربية القائمة على SSM لفحص الأجسام النانوية المتعددة وتحديد مثبطات نقل الكولين. وأخيرا، فإننا نصف وصف كيفية تحديد تركيزات المثبطة نصف القصوى (IC50)من الأجسام النانوية المثبطة مختارة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعادة تشكيل بروتين الغشاء

  1. مزيج 3 مل من الدهون القطبية الإشريكية القولونية مع 1 مل من فوسفاتيديلكولين في قارورة أسفل مستديرة تحت غطاء محرك السيارة التهوية.
  2. جفف خليط الدهون لمدة 20 دقيقة تحت الفراغ باستخدام المبخر الدوار وحمام مائي عند 37 درجة مئوية لإزالة الكلوروفورم. إذا لزم الأمر، تجف أكثر تحت النيتروجين أو غاز الأرجون.
  3. باستخدام مخزن TS المؤقت (20 مللي متر تريس-HCl pH 8.0، 150 mM NaCl) يحتوي على 2 mM β-mercaptoethanol، إعادة إنفاق الدهون إلى 25 ملغم/مل.
  4. Aliquot الدهون في 500 μL aliquots، تجميد فلاش في النيتروجين السائل، وتخزينها في -80 درجة مئوية.
  5. تذوب واحدة 500 ميكرولتر aliquot من الدهون وتمييع 1:1 باستخدام مخزن TS المؤقت الذي يحتوي على 2 mM β ميركابتوثانول.
  6. قذف تعليق الدهون 15 مرة باستخدام غشاء 400 نانومتر.
  7. تمييع تعليق الدهون ليكون تركيز الدهون النهائي من 4.4 ملغ / مل.
  8. إضافة ن-دودسيل-β-D-مالتوسايد (DDM) أن يكون تركيز النهائي من 0.2٪ وتركها تدور لمدة 1 ساعة في 200 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
  9. أضف البروتين المنقى إلى الدهون باستخدام نسبة الدهون إلى البروتين بين 1:10 و 1:100 (ث:ث).
    ملاحظة: يجب تعديل النسبة اعتمادا على قوة الإشارة المكتشفة في قياسات الفيزيولوجيا الكهربية SSM لنقل الركيزة (انظر أدناه). للحصول على إشارات أكبر، استخدم نسب الدهون إلى البروتين الأصغر.
  10. احتضان الخليط الدورية في 200 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة في RT.
  11. إضافة 30 ملغ / مل من حبات البوليسترين الممتزة، وغسلها مسبقا في مخزن TS المؤقت.
    ملاحظة: إضافة حبات البوليسترين خطوة بخطوة.
  12. احتضان خليط الخرز والدهون لمدة 30 دقيقة في RT تحت التحريك البطيء.
  13. لإزالة الخرز، دع خليط الخرز والدهون يقف حتى تستقر الخرز. نقل الحل إلى أنبوب جديد وترك الخرز وراء. إضافة 30 ملغ / مل من حبات البوليسترين الممتزة الطازجة إلى خليط الدهون المنفصلة.
  14. احتضان الخليط لمدة 1 ساعة في 4 درجة مئوية تحت اثارة بطيئة.
  15. فصل الخرز من الخليط كما هو موضح في الخطوة 1.13 وإضافة 30 ملغ / مل من حبات البوليسترين الطازجة الممتزة.
  16. احتضان الخليط لمدة 16 ساعة في 4 درجة مئوية.
  17. فصل الخرز من الخليط كما هو موضح في الخطوة 13 وإضافة 30 ملغ / مل من حبات البوليسترين الطازجة الممتزة.
  18. احتضان الخليط لمدة 2 ساعة في 4 درجة مئوية لغسل الرابع والأخير.
  19. جهاز طرد مركزي عند 110,000 x g لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  20. غسل بيليه مع 500 ميكرولتر من العازلة TS التي تحتوي على 2 mM β ميركابتوثانول.
  21. جهاز الطرد المركزي مرة أخرى في 110،000 × ز لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية.
  22. إعادة إنفاق بيليه إلى تركيز الدهون النهائي من 25 ملغم / مل في مخزن TS المؤقت مع 2 mM β ميركابتوثانول.
  23. تقدير تركيز البروتين باستخدام في هلام أو أميدو الأسود المقايسة36.
  24. Aliquot البروتيوليبوسومات، تجميد فلاش في النيتروجين السائل، وتخزينها في -80 درجة مئوية.

2. إعداد رقاقة

  1. ملء رقاقة استشعار واحد مع 50-100 ميكرولتر من 0.5 mM 1-أوكتاديكانثيول الحل (resuspended في ايزوبروبانول).
  2. احتضان رقاقة مع الحل لمدة 30 دقيقة في RT.
  3. إزالة محلول ثيول عن طريق النقر على رقاقة على الأنسجة.
  4. شطف جهاز الاستشعار 3 مرات مع 5 مل من ايزوبروبانول نقية.
  5. شطف جهاز الاستشعار 3 مرات مع 5 مل من الماء المقطر مزدوجة.
  6. جفف المستشعر عن طريق النقر على ورق نسيجي.
  7. تطبيق 1.5 ميكرولتر من 7.5 ميكروغرام / ميكرولتر 1،2-diphytanoyl-sn-glycero-3-فوسفوتشولين (الدهون المجففة في المبخر الدورية وإعادة الإنفاق في ن ديكان).
  8. بعد ذلك مباشرة، قم بتعبئة المستشعر ب 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت SSM غير المنشط، والذي لا يحتوي على الركيزة. وهذا سيؤدي إلى تشكيل عفوية من طبقة SSM.
    ملاحظة: يجب تحسين المخزن المؤقت SSM مسبقا لتحديد الحالات المثلى التي تحتوي على ضوضاء خلفية منخفضة. يمكن استخدام المخزن المؤقت العام الذي يحتوي على 30 mM HEPES pH 7.4 و 5 mM MgCl2و 140 mM NaCl كنقطة بداية. يتم استخدام المخزن المؤقت SSM بدون الركيزة للغسيل قبل وبعد القياس (المخزن المؤقت غير المنشط). لتجنب عدم تطابق المخزن المؤقت، استخدم المخزن المؤقت غير المنشط لإعداد المخزن المؤقت الذي يحتوي على الركيزة (تنشيط المخزن المؤقت). يمكن إضافة الركيزة إما مباشرة كمسحوق أو بحجم صغير من مخزون عالي التركيز لتجنب التخفيف.
  9. تذوب البروتيوليبوسومات من الخطوة 1.24 في RT.
  10. تمييع البروتيوليبوسومات بين 1:5 و 1:100 (البروتيوليبوسومات: عازلة، (v:v)) في المخزن المؤقت SSM غير المنشط (هنا 1:20).
  11. سونيكاتي بروتيوليبوسومات لمدة 20-30 ق أو 3 مرات لمدة 10 ق، ووضع على الجليد بين سونيكيشن، إذا لزم الأمر. هنا تم استخدام sonicator حمام المياه في 45 كيلوهرتز.
  12. تطبيق 5-10 ميكرولتر من عينة البروتيوليبوسومات سونيكاتيد المخفف على سطح جهاز الاستشعار دون لمسها.
  13. طرد مركزي رقائق مع الحل في RT لمدة 30 دقيقة باستخدام سرعة بين 2000 و 3000 × ز.
    ملاحظة: استخدم أنابيب 50 مل مع قاع مسطح. ضع رقائق الاستشعار بعناية بشكل مستقيم باستخدام ملاقط. كما يمكن استخدام لوحات 6-well و الطرد المركزي مع حامل لوحة.
  14. استخدام رقائق الاستشعار في نفس اليوم.

3. قياس النقل المذاب: تحديد ظروف التشبع

ملاحظة: كدليل على المبدأ, تم تنفيذ هذه التجارب باستخدام ناقل الكولين البكتيرية إعادة تشكيلها في الليبوسومات التالية البروتوكول المذكور أعلاه. تظهر هنا عملية خطوة بخطوة لتحديد ظروف التشبع من الكولين الركيزة قبل قياس تثبيط بواسطة الأجسام النانوية.

  1. تحضير 1-2 L المخزن المؤقت SSM غير تنشيط.
    ملاحظة: تحضير واستخدام نفس المخزون المخزن المؤقت SSM لكافة المخازن المؤقتة التنشيط و غير تنشيط خلال كافة القياسات.
  2. خذ 10 أنابيب نظيفة ونقل 10 مل من المخزن المؤقت SSM غير المنشط إلى كل منها.
  3. إضافة الركيزة في الأنابيب من الخطوة 3.2 باستخدام سلسلة من التركيزات حول تركيز نصف الحد الأقصى المتوقع (هنا 15, 10, 5, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005, 0.001 mM من الكولين) لإعداد المخازن المؤقتة SSM تنشيط. استخدام مخزون تركيز عال لتجنب التخفيف.
  4. قم بتشغيل جهاز SSM.
  5. بدء تشغيل برنامج SSM والسماح للجهاز تهيئة تلقائيا. تعيين مسار الحفظ للبيانات وتأكيد عن طريق الضغط على زر موافق. حدد بروتوكول التنظيف الأولي القياسي في خيارات سير العمل وانقر فوق تشغيل.
  6. جبل رقاقة المغلفة بروتوليبوسوم على المقبس، وتحريك الذراع لقفل رقاقة، وإغلاق رقاقة محمولة مع الغطاء.
  7. حدد CapCom البرنامج في سير العمل والسماح لها تشغيل لتحديد الموصلية والسعة. تأكد من أن الموصلية أقل من 5 nS والسعة بين 15 و 35 nF قبل استخدامه للقياس.
    ملاحظة: يوصى الشركة المصنعة بقيمة سعة 15-35 nF والتوصيلات أقل من 5 nS عند استخدام رقاقة 3 مم.
  8. نقل حلول التنشيط إلى قوارير ووضع المخازن المؤقتة في العينات التحقيق.
  9. نقل العازلة عدم تفعيلها في خزان ووضعها بجانب حامل رقاقة في موقف الخزان على اليمين.
  10. إنشاء بروتوكول لسير العمل باستخدام تسلسل من غير تنشيط (B) ، تنشيط (A) وحلول (B) غير تنشيط (تسلسل B-A-B) و حلقة التي تقوم بإجراء ثلاثة قياسات و ينتقل إلى المخزن المؤقت تنشيط التالي لكافة المخازن المؤقتة 10 المعدة في الخطوة 3.3. استخدم معدل التدفق الافتراضي بمعدل 200 ميكرولتر/ثانية باستخدام 1 ثانية - 1 ثانية - 1 ثانية من أوقات التدفق لتسلسل B-A-B. انقر فوق تشغيل لبدء القياس.
    ملاحظة: تتكون التجربة النموذجية من التدفق التسلسلي للحلول غير المنشطة (B) والتنشيفعل (A) وحلول عدم التنشيط (B) (مكتوبة باسم B-A-B؛ انظر الشكل 1A). سيتم غسل البروتيوليبوسومات المشلولة على المستشعر بالحلول. لذلك ، يولد تبادل محلول B-A تدرج تركيز ركيزة ، مما يدفع تفاعل النقل الكهربائي.
  11. حفظ البروتوكول والسماح سير العمل تشغيل بالنقر على زر التشغيل. قم بإجراء نفس النوع من التجارب ولكن باستخدام الليبوسومات الخالية من البروتين. وهذا أمر بالغ الأهمية لأنه سيظهر كثافة التيارات الخلفية. وينبغي النظر في ذلك عند تحليل بيانات النقل الكهربائي المقيس بالبروتيوليبوبوسومات(الشكل 1C).
  12. استخدم أي برنامج مفضل لتحليل البيانات لرسم الوقت الحالي المقاس مقابل الوقت. اقرأ ذروة التيار يدويا، أو إذا كنت تستخدم البرنامج، فاستخدم الدالة لتقدير ذروة الارتفاع في نطاق إضافة المخزن المؤقت المنشط.
  13. رسم التيار الذروة ضد تركيز الركيزة لتحديد EC50 من الركيزة عن طريق الانحدار غير الخطي (الشكل 1B، C). اقرأ أدنى تركيز يصل فيه تيار الذروة إلى قيمة قصوى، وهذا التركيز يتوافق مع ظروف التشبع.
    ملاحظة: من المهم أن تعتبر أن عدد البروتيوليبوسومات التي تبقى معطلة يختلف من رقاقة إلى رقاقة. ويتجلى هذا الاختلاف لأن التيارات القصوى في ظروف قياس متطابقة سوف تظهر اتساعات مختلفة. لذلك ، من الضروري تطبيع السعة الحالية للقياسات التي يتم إجراؤها على كل رقاقة بشكل منفصل قبل مقارنة القياسات بين مستحضرات الرقائق المختلفة.

4. التصنيف التسلسلي للأجسام النانوية المثبطة وغير المثبطة

ملاحظة: يوضح هذا القسم كيفية قياس نقل الكولين في وجود أجسام نانوية ترتبط خصيصا بنقل الكولين البكتيري. أصغر التيارات الذروة في وجود الأجسام النانوية تشير إلى تثبيط النقل. لن تؤثر الأجسام النانوية غير المثبطة على نقل الركيزة ، أي عدم انخفاض إشارة ذروة التيار.

  1. إعداد 1-2 L من المخزن المؤقت SSM غير تنشيط.
  2. نقل 50 مل من المخزن المؤقت SSM غير المنشط إلى أنبوب نظيف. إضافة الكولين الركيزة إلى تركيز النهائي من 5 mM (شروط التشبع). استخدم هذا لقياس عنصر تحكم موجب.
  3. نقل 10 مل من العازلة SSM غير المنشطة في أنبوب نظيف. إضافة الكولين الركيزة إلى تركيز النهائي من 5 MM (شروط التشبع) وإضافة نانوبود إلى تركيز النهائي من 500 نانومتر.
  4. كرر الخطوة 4.3 لكل نانوبود لإعداد حلول التنشيط.
    ملاحظة: إذا تم إعادة إنفاق الأجسام النانوية المنقى في مخزن مؤقت مختلف عن المخزن المؤقت SSM، فإن إضافة الأجهزة إلى المخازن المؤقتة التنشيطية وغير المنشطة ستؤدي إلى عدم تطابق المخزن المؤقت. يجب تجنب عدم تطابق المخزن المؤقت لأنه يمكن أن يؤدي إلى ضوضاء عالية. تبادل المخزن المؤقت للأجسام النانوية المنقى مع المخزن المؤقت SSM يمكن أن يساعد على تجنب هذه المشكلة. وعلاوة على ذلك، ينصح باستخدام تركيزات الأجسام النانوية التي تسمح للوصول إلى ظروف التشبع. وبالنظر إلى أن الثوابت الملزمة للأجسام النانوية هي عموما أقل من 100 نانومتر، ينصح بتركيز جسم نانوي من 500 نانومتر لهذه التجربة. ومع ذلك، من المهم أن ما قبل الشاشة لتركيزات الأمثل.
  5. بدء تشغيل الجهاز SSM وقياس سعة والتوصيلية من رقاقة المغلفة بروتوليبوسوم كما هو موضح في الخطوات 3.4-3.7.
  6. نقل حل تفعيل دون nanobody في قارورة ووضع المخزن المؤقت في العينات التحقيق. نقل العازلة عدم تفعيل دون nanobody في خزان ووضعها في أخذ عينات التحقيق.
  7. نقل حلول التنشيط التي تحتوي على أجسام نانوية في قوارير ووضع المخازن المؤقتة في أخذ عينات التحقيق. نقل المخازن المؤقتة غير المنشطة التي تحتوي على أجسام نانوية إلى قوارير ووضع المخازن المؤقتة في أخذ عينات المسبار.
  8. إنشاء بروتوكول لسير العمل باستخدام تسلسل من الحلول غير المنشطة (B) وحلول التنشيط (A) وحلول عدم التنشيط (B-A-B).
  9. إنشاء حلقة التي تؤدي ما يلي: ثلاثة قياسات للتسلسل B-A-B باستخدام مخازن عازلة دون nanobody، قياسين من تسلسل B-A-B مع المخازن المؤقتة التي تحتوي على متناهي الصغر، 120 ق تأخير الوقت لاحتضان مع nanobody، ثم 3 قياسات تسلسل B-A-B مع المخازن المؤقتة التي تحتوي على نانوبودي.
  10. حفظ سير العمل والسماح بتشغيله بالنقر فوق الزر تشغيل.
    ملاحظة: سيقوم سير العمل هذا بقياس الشروط الأولية للنقل دون تثبيط عن طريق تشغيل بروتوكول B-A-B 3 مرات باستخدام عدم التنشيط (B) وتفعيل المخازن المؤقتة (A) بدون الأجسام النانوية(الشكل 1B، C)، يليه قياس تأثير النانوبودي على النقل عن طريق تشغيل بروتوكول B-A-B 5 مرات مع المخازن المؤقتة غير المنشطة والتنشيط التي تحتوي على أجسام نانوية(الشكل 2A ). النظام الثاني ربط الحركية تملي التفاعل بين الأجسام النانوية والبروتينات المستهدفة. لذلك ، من المهم استخدام تأخير الوقت في خطوة B-A من أجل إعطاء ما يكفي من الوقت للأجسام النانوية لربط الناقلين في البروتيوليبوسومات على الشريحة. تعتمد الأوقات المثلى على تركيز الأجسام النانوية أي، في تركيزات أقل يلزم أوقات أطول. ويلزم إجراء القياسين الأول والثاني لتكييف النظام مع الظروف الجديدة، وينبغي إجراء الشوط الثاني بعد تأخير قدره 120 ثانية. وينبغي استخدام القياسات الثلاثة التالية فقط لتحليل البيانات.
  11. إنشاء بروتوكول جديد لسير العمل باستخدام تسلسل من عدم تنشيط (ب) ، وتفعيل (أ) ، وعدم تنشيط (باء) حلول (تسلسل B - A - باء) وحلقة من 5 قياسات لغسل نانوبودي منضم عكس ذلك.
    ملاحظة: اختياريا، وتشمل خطوة حضانة للسماح فصل الأجسام النانوية مع الحركية بطيئة.
  12. حفظ سير العمل والسماح بتشغيله بالنقر فوق الزر تشغيل.
  13. قارن آخر تيار ذروة للقياسات مع القياس الأولي للركيزة فقط في الخطوة 4.10. تم غسل الأجسام النانوية بنجاح وتم إعادة تأسيس الظروف الأولية إذا وصل تيار الذروة إلى القيمة الأولية ، أو كرر الخطوات 4.12-4.13 أو قم بالتغيير إلى رقاقة جديدة.
  14. كرر الخطوات 4.6-4.13 واستخدام رقائق الفردية لكل شاشة نانوبود(الشكل 2C)أو تكرار مع الهيئات النانوية متعددة باستخدام نفس الشريحة (الشكل 2D).
  15. استخدم أي برنامج مفضل لتحليل البيانات لرسم الوقت الحالي المقاس مقابل الوقت. اقرأ ذروة التيار يدويا، أو إذا كان متوفرا، في البرنامج المستخدم، حدد تلقائيا وظيفة لتقدير ذروة الارتفاع في نطاق إضافة المخزن المؤقت التنشيط.
  16. تطبيع التيار الذروة في وجود nanobody، استنادا إلى القياس الركيزة السابقة فقط. رسم التيارات الذروة في المدرج التكراري ومقارنة التيارات الذروة من القياسات الركيزة فقط إلى التيارات الذروة التي تقاس في وجود الأجسام النانوية (الشكل 2C، D) لتحديد الأجسام النانوية المثبطة.
    ملاحظة: يجب إجراء تطبيع التيارات الذروة المحددة لكل تشغيل فردي مع الأجسام النانوية بالنظر إلى ذروة التيار في غياب الأجسام النانوية من القياس السابق. أيضا، منذ عدد من البروتيوليبوسومات التي لا تزال معطلة تختلف من رقاقة إلى رقاقة، من المهم تطبيع السعة الحالية للقياسات التي أجريت على كل رقاقة على حدة قبل مقارنة القياسات بين الاستعدادات رقاقة مختلفة.

5. IC50 قياس مع الأجسام النانوية المثبطة

ملاحظة: بعد تحديد الأجسام النانوية المثبطة، فمن الممكن تحديد تركيزها المثبط نصف الأقصى (IC50). ويتم ذلك عن طريق قياس نقل الكولين بتركيز مستمر, في حين تركيزات متفاوتة من الأجسام النانوية المثبطة.

  1. تحضير 1-2 L المخزن المؤقت SSM غير تنشيط.
  2. نقل 50 مل من المخزن المؤقت SSM غير المنشط إلى أنبوب نظيف. إضافة الكولين الركيزة إلى تركيز النهائي من 5 mM (شروط التشبع). استخدم هذا كحل تنشيط للتحكم الإيجابي.
  3. خذ 8 أنابيب نظيفة وأضف 5 مل من محلول عدم التنشيط إلى كل منها. إضافة الكولين الركيزة إلى تركيز النهائي من 5 mM (شروط التشبع). إضافة نانوبودي المثبطة إلى أنابيب بتركيزات في نطاقIC 50 المتوقع (هنا 500 نانومتر - 1 نانومتر).
  4. خذ 8 أنابيب نظيفة وأضف 10 مل من محلول عدم التنشيط إلى كل منها. إضافة نانوبود مثبطة إلى كل أنبوب على حدة في نفس التركيز كما هو الحال في الخطوة 5.3. وهذا يتوافق مع المخزن المؤقت غير تنشيط.
    ملاحظة: هذا سوف تولد سلسلة من تنشيط و غير تنشيط أزواج العازلة بتركيزات مختلفة من نفس نانوبودي المثبطة.
  5. بدء الإعداد SSM وقياس سعة والتوصيلية من رقاقة المغلفة بروتوليبوسوم كما هو موضح في الخطوات 3.4-3.7.
  6. نقل حل تفعيل دون nanobody في قارورة ووضعه في العينات التحقيق. نقل العازلة عدم تفعيل دون nanobody في خزان ووضعها في موقف الخزان بجانب حامل رقاقة على اليمين.
  7. نقل حلول التنشيط التي تحتوي على أجسام نانوية في قوارير ووضع المخازن المؤقتة في أخذ عينات التحقيق. نقل المخازن المؤقتة غير المنشطة التي تحتوي على أجسام نانوية إلى قوارير ووضع المخازن المؤقتة في أخذ عينات المسبار.
  8. إنشاء بروتوكول لسير العمل باستخدام تسلسل من الحلول غير المنشطة (B) وحلول التنشيط (A) وحلول عدم التنشيط (B-A-B). وتشمل حلقة لقياس كل تركيز 2 مرات، واحتضان لمدة 120 ق وقياس 3 مرات أخرى. سيبدأ سير العمل بالتحكم الإيجابي في الركيزة فقط يليه أقل تركيز للأجسام النانوية. وسيتبع كل قياس للأجسام النانوية قياس لاحق للتحكم الإيجابي باستخدام الركيزة فقط لاستعادة سعة الذروة الأولية، قبل الانتقال إلى تركيز النانوبود الأعلى التالي.
    ملاحظة: الحركة من الدرجة الثانية تملي ربط الأجسام النانوية. لذلك، من المهم استخدام تأخير الوقت في الخطوة B-A. تعتمد الأوقات المثلى على تركيز الأجسام النانوية، أي أن هناك حاجة إلى تركيزات أقل مرات أطول؛ هنا 120 S تم استخدامها مع نتائج مرضية.
  9. استخدم أي برنامج مفضل لتحليل البيانات لرسم الوقت الحالي المقاس مقابل الوقت. اقرأ ذروة التيار يدويا، أو إذا كنت تستخدم البرنامج، حدد دالة تقدير ذروة الارتفاع في نطاق إضافة المخزن المؤقت للتنشيط(الشكل 3A). رسم التيارات الذروة ضد تركيز نانوبود لتحديد IC50 عن طريق الانحدار غير الخطي(الشكل 3B).
    ملاحظة: تطبيع السعة الحالية للقياسات التي يتم إجراؤها لكل شريحة على حدة قبل مقارنة القياسات بين مستحضرات الرقائق المختلفة.

6. تنظيف أجهزة الاستشعار

  1. شطف رقائق استشعار واحد بعد استخدامها مع 10 مل من الماء المقطر.
  2. جفف الشريحة عن طريق النقر عليها على ورق نسيجي.
  3. ملء تجويف استشعار رقاقة مع 100 ميكرولتر من ايزوبروبانول نقية واحتضان لمدة 10 دقيقة في RT.
  4. وضع مسحة القطن في ايزوبروبانول نقية واحتضان لمدة 1-3 دقائق.
  5. استخدم مسحات القطن الجاهزة وتناوب بلطف على سطح المستشعر دون ضغط لإزالة المخلفات.
  6. شطف جهاز الاستشعار مع 5 مل من ايزوبروبانول نقية.
  7. شطف جهاز الاستشعار مع 10 مل من الماء المقطر.
  8. جفف المستشعر عن طريق النقر على الشريحة على نسيج.
  9. دع المستشعر يجف بين عشية وضحاها في RT، وخزنه في RT في ظل ظروف جافة.
    ملاحظة: يمكن إعادة استخدام أجهزة الاستشعار حتى 4-5 مرات عند تنظيفها وتخزينها بشكل صحيح.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد استخدمت على نطاق واسع SSM القائمة على الفيزيولوجيا الكهربائية لتوصيف الناقلين الكهربائي. في البروتوكول المعروض هنا، نعرض كيفية استخدام الفيزيولوجيا الكهربية القائمة على SSM لتصنيف الأجسام النانوية التي تستهدف ناقلا ثانويا (هنا سيمبورتر الكولين البكتيري) استنادا إلى خصائصها المثبطة وغير المثبطة. واحدة من أكثر الميزات المفيدة لهذه التقنية هو أنه يسمح لفحص الإنتاجية العالية من ظروف المخزن المؤقت متعددة. هذه الخاصية الخاصة مفيدة لتحليل مكتبات الأجسام النانوية ، والتي بعد اختيار الموثقات يمكن تشكيلها من بضعة إلى عشرات الأ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتصنف التقنية المعروضة هنا الأجسام النانوية ذات الخصائص المثبطة وغير المثبطة التي تستهدف الناقلين الكهربائيين. تقييم النقل الركيزة ممكن بسبب الكشف عن حركة الشحنات من خلال الناقل جزءا لا يتجزأ من غشاء البروتيوليبوسومات. بعض الخطوات الحاسمة أثناء إعداد تجربة هي إعادة تشكيل البروتين النشط في الليبوسومات ، وإعداد طبقات أحادية مستقرة على رقائق SSM ، واستعادة الظروف الأولية بعد تطبيق بروتوكول الغسيل لإزالة جزيئات الأجسام النانوية المقيدة. بمجرد إعادة تشكيل بروتين الغشاء بنسبة الدهون إلى البروتين المناسبة ، يمكن إنشاء بروتوكول ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر سيدريك أ. ج. هوتر وماركوس أ. سيغر من معهد علم الأحياء المجهرية الطبية في جامعة زيوريخ، وغونزالو سيبريرو من Biozentrum من جامعة بازل للتعاون في توليد الأجسام النانوية الاصطناعية (الأجسام). نشكر ماريا بارتمز وأندريه بازون من شركة نانيون تكنولوجيز على المساعدة التقنية. وقد دعم هذا العمل المؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم (PP00P3_170607 ومبادرة منحة البحوث التي قدمتها مؤسسة نانيون إلى مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1-محلول أوكتاديكانيثيولسيجما ألدريتشO1858-25ML
1،2-ديفيتانويل-sn-glycero-3-فوسفوكولينأفانتي القطبية الدهون850356C-25mg
Bio-Beads SM-2 مادة ماصة (حبات ماصة من البوليسترين)BioRad# 152-3920
PD 10 أعمدة تحليةGE HealthcareGE17-0851-01
مرشح غشاء 200 نانومترWhatman NucleoporeWHA800282
2-PropanolMerck33539-1L-R
n-DecaneSigma Aldrich8034051000
n-dodecyl-ß-D-maltoside (DDM)AvantiPolar Lipids850520P-25g
كلوريد الصوديومAppliChem131659.1211
(إعداد SSM) SURFE2R N1Nanion-----
رقائق SURFE2R N1 أحادية الاستشعارNanion# 161001
Trizma BaseSigma AldrichT1503
E. coli مستخلص الدهون القطبيةAvanti Polar Lipids100600C
Egg PC L- & alpha - فوسفاتيديل كولين أفانتي الدهون القطبية840051C

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Braden, B. C., Goldman, E. R., Mariuzza, R. A., Poljak, R. J. Anatomy an antibody molecule: structure, kinetics, thermodynamics, and mutational studies of the antilysozyme antibody D1.3. Immunology Reviews. 163, 45-57 (1998).
  2. Hamers-Casterman, C., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363, 446-448 (1993).
  3. Perez, C., et al. Structural basis of inhibition of lipid-linked oligosaccharide flippase PglK by a conformational nanobody. Science Reports. 7, 46641(2017).
  4. Grahl, A., Abiko, L. A., Isogai, S., Sharpe, T., Grzesiek, S. A high-resolution description of beta1-adrenergic receptor functional dynamics and allosteric coupling from backbone NMR. Nature Communication. 11, 2216(2020).
  5. Schenck, S., et al. Generation and characterization of anti-VGLUT nanobodies acting as inhibitors of transport. Biochemistry. 56, 3962-3971 (2017).
  6. Mireku, S. A., Sauer, M. M., Glockshuber, R., Locher, K. P. Structural basis of nanobody-mediated blocking of BtuF, the cognate substrate-binding protein of the Escherichia coli vitamin B12 transporter BtuCD. Science Reports. 7, 14296(2017).
  7. Manglik, A., Kobilka, B. K., Steyaert, J. Nanobodies to study G protein-coupled receptor structure and function. Annual Reviews of Pharmacology Toxicology. 57, 19-37 (2017).
  8. Rasmussen, S. G., et al. Structure of a nanobody-stabilized active state of the beta(2) adrenoceptor. Nature. 469 (2), 175-180 (2011).
  9. Jiang, X., et al. Crystal structure of a LacY-nanobody complex in a periplasmic-open conformation. Proceeding of the National Academy of Science U. S. A. 113, 12420-12425 (2016).
  10. Geertsma, E. R., et al. Structure of a prokaryotic fumarate transporter reveals the architecture of the SLC26 family. Nature Structural Molecular Biology. 22, 803-808 (2015).
  11. Harmsen, M. M., De Haard, H. J. Properties, production, and applications of camelid single-domain antibody fragments. Applied Microbiology and Biotechnology. 77, 13-22 (2007).
  12. Pardon, E., et al. A general protocol for the generation of nanobodies for structural biology. Nature Protocols. 9, 674-693 (2014).
  13. Nguyen, V. K., Desmyter, A., Muyldermans, S. Functional heavy-chain antibodies in Camelidae. Advances in Immunology. 79, 261-296 (2001).
  14. Zimmermann, I., et al. Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins. Elife. 7, 34317(2018).
  15. McMahon, C., et al. Yeast surface display platform for rapid discovery of conformationally selective nanobodies. Nature Structural Molecular Biology. 25, 289-296 (2018).
  16. Olichon, A., de Marco, A. Preparation of a naive library of camelid single domain antibodies. Methods in Molecular Biology. 911, 65-78 (2012).
  17. Moutel, S., et al. NaLi-H1: A universal synthetic library of humanized nanobodies providing highly functional antibodies and intrabodies. Elife. 5, 16228(2016).
  18. Yan, J., Li, G., Hu, Y., Ou, W., Wan, Y. Construction of a synthetic phage-displayed nanobody library with CDR3 regions randomized by trinucleotide cassettes for diagnostic applications. Journal of Translational Medicine. 12, 343(2014).
  19. Sabir, J. S., et al. Construction of naive camelids VHH repertoire in phage display-based library. Comptes Rendus Biologies. 337, 244-249 (2014).
  20. Yau, K. Y., et al. Selection of hapten-specific single-domain antibodies from a non-immunized llama ribosome display library. Journal of Immunology Methods. 281, 161-175 (2003).
  21. vander Linden, R. H., et al. Comparison of physical chemical properties of llama VHH antibody fragments and mouse monoclonal antibodies. Biochimica et Biophysica Acta. 1431, 37-46 (1999).
  22. Dumoulin, M., et al. Single-domain antibody fragments with high conformational stability. Protein Science. 11, 500-515 (2002).
  23. Iezzi, M. E., Policastro, L., Werbajh, S., Podhajcer, O., Canziani, G. A. Single-domain antibodies and the promise of modular targeting in cancer imaging and treatment. Frontiers in Immunology. 9, 273(2018).
  24. Yu, X., et al. Nanobodies derived from camelids represent versatile biomolecules for biomedical applications. Biomaterials Science. 8, 3559-3573 (2020).
  25. Jahnichen, S., et al. CXCR4 nanobodies (VHH-based single variable domains) potently inhibit chemotaxis and HIV-1 replication and mobilize stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 107, 20565-20570 (2010).
  26. Nguyen, V. S., et al. Inhibition of type VI secretion by an anti-TssM llama nanobody. PLoS One. 10, 0122187(2015).
  27. Bazzone, A., Barthmes, M., Fendler, K. SSM-Based Electrophysiology for Transporter Research. Methods in Enzymology. 594, 31-83 (2017).
  28. Schulz, P., Garcia-Celma, J. J., Fendler, K. SSM-based electrophysiology. Methods. 46, 97-103 (2008).
  29. Barthmes, M., Liao, J., Jiang, Y., Bruggemann, A., Wahl-Schott, C. Electrophysiological characterization of the archaeal transporter NCX_Mj using solid supported membrane technology. Journal of General Physiology. 147, 485-496 (2016).
  30. Watzke, N., Diekert, K., Obrdlik, P. Electrophysiology of respiratory chain complexes and the ADP-ATP exchanger in native mitochondrial membranes. Biochemistry. 49, 10308-10318 (2010).
  31. Zuber, D., et al. Kinetics of charge translocation in the passive downhill uptake mode of the Na+/H+ antiporter NhaA of Escherichia coli. Biochim Biophys Acta. 1709, 240-250 (2005).
  32. Garcia-Celma, J. J., Smirnova, I. N., Kaback, H. R., Fendler, K. Electrophysiological characterization of LacY. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 106, 7373-7378 (2009).
  33. Bazzone, A., Madej, M. G., Kaback, H. R., Fendler, K. pH regulation of electrogenic sugar/H+ symport in MFS sugar permeases. PLoS One. 11, 0156392(2016).
  34. Williamson, G., et al. A two-lane mechanism for selective biological ammonium transport. Elife. 9, 57183(2020).
  35. Mirandela, G. D., Tamburrino, G., Hoskisson, P. A., Zachariae, U., Javelle, A. The lipid environment determines the activity of the Escherichia coli ammonium transporter AmtB. FASEB Journal. 33, 1989-1999 (2019).
  36. Kaplan, R. S., Pedersen, P. L. Determination of microgram quantities of protein in the presence of milligram levels of lipid with amido black 10B. Annals of Biochemistry. 150, 97-104 (1985).
  37. Kermani, A. A., et al. The structural basis of promiscuity in small multidrug resistance transporters. Nature Communication. 11, 6064(2020).
  38. Weitz, D., et al. Functional and structural characterization of a prokaryotic peptide transporter with features similar to mammalian PEPT1. Journal of Biological Chemistry. 282, 2832-2839 (2007).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

SSM IC50

مقالات ذات صلة