يقدم هذا البروتوكول سير عمل تجريبي كامل لدراسة التفاعلات بين الحمض النووي الريبي والبروتين باستخدام الملاقط البصرية. يتم تحديد العديد من الاجهزة التجريبية المحتملة بما في ذلك الجمع بين الملاقط البصرية مع المجهر confocal.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
ملاقط بصرية لدراسة التفاعلات بين الحمض النووي الريبي والبروتين في تنظيم الترجمة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يعتمد الجيش الملكي النيبالي طيات هيكلية متنوعة ، والتي تعتبر ضرورية لوظائفه وبالتالي يمكن أن تؤثر على العمليات المتنوعة في الخلية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تعديل بنية ووظيفة الحمض النووي الريبي من خلال عوامل مختلفة عابرة للمفعول ، مثل البروتينات أو الأيض أو الحمض النووي الريبي الآخر. فجزيئات الحمض النووي الريبي المتحولة الإطارية، على سبيل المثال، هي RNAs تنظيمية تقع في مناطق الترميز، والتي تترجم الريبوسومات مباشرة إلى إطار قراءة مفتوح بديل، وبالتالي تعمل كمفاتيح جين. كما أنها قد تعتمد طيات مختلفة بعد ربط البروتينات أو غيرها من العوامل العابرة. لتشريح دور البروتينات الملزمة للجيش الملكي النيبالي في الترجمة وكيفية تعديل هيكل واستقرار الحمض النووي الريبي ، من الأهمية بمكان دراسة التفاعل والسمات الميكانيكية لهذه المجمعات بروتين الحمض النووي الريبي في وقت واحد. يوضح هذا العمل كيفية استخدام ملاقط بصرية مقترنة بجزيء واحد لاستكشاف المناظر الطبيعية التوافقية والديناميكية الحرارية لمجمعات بروتين الحمض النووي الريبي بدقة عالية. وكمثال على ذلك، يتم تفصيل تفاعل عنصر نقل الإطارات الريبوسومية المبرمجة سارس-CoV-2 مع العامل العابر للمفعول القصير isoform من البروتين المضاد للفيروسات بإصبع الزنك. وبالإضافة إلى ذلك، تم رصد الريبوسومات ذات العلامات الفلورية باستخدام الوحدة الكونفوكوكال، التي ستمكن في نهاية المطاف من دراسة استطالة الترجمة. يمكن تطبيق المقايسة الفلورية المقترنة OT على نطاق واسع لاستكشاف مجمعات بروتين الحمض النووي الريبي المتنوعة أو العوامل العابرة للمفعول التي تنظم الترجمة ويمكن أن تسهل دراسات تنظيم الجينات القائم على الحمض النووي الريبي.
المقدمة
نقل المعلومات الوراثية من الحمض النووي إلى البروتينات من خلال الحمض النووي الريبي هو عملية كيميائية حيوية معقدة، والتي يتم تنظيمها بدقة على جميع المستويات من خلال التفاعلات الجزيئية الكلية داخل الخلايا. للتنظيم الترجمي، تمنح التفاعلات بين الحمض النووي الريبي والبروتين دورا حاسما للتفاعل بسرعة مع مختلف المحفزات والإشارات1,2. تؤثر بعض التفاعلات بين الحمض النووي الريبي والبروتين على استقرار الحمض النووي الريبي وبالتالي تغير الوقت الذي يكون فيه الحمض النووي الريبي نشطا بشكل ترجمي. وترتبط التفاعلات الأخرى بين الحمض النووي الريبي والبروتين بآليات إعادة ترميز مثل إعادة معاينة وقف كودون، أو تجاوز، أو برمجة الريبوسومات....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد العينة
- استنساخ تسلسل الاهتمام في المتجه الذي يحتوي على شظايا الحمض النووي لامبدا، والتي هي بمثابة تسلسل مقبض (الشكل 2)43،50.
- أولا توليد قالب الحمض النووي للنسخ اللاحق في المختبر عن طريق PCR (الشكل 2B؛ رد الفعل 1). في هذه الخطوة PCR، تتم إضافة المروج T7 في نهاية 5 'من جزيء الحمض النووي الشعور32،33،43،50. تعيين رد فعل PCR وفقا للجدول 1. تشغيل PCR في 50 μL ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
في هذا القسم، يتم التركيز بشكل رئيسي على قياسات التفاعلات بين الحمض النووي الريبي وبروتين/ليغاند بواسطة الملاقط البصرية الفلورية. للحصول على وصف لتجارب ملاقط RNA البصرية العامة والنتائج التمثيلية المقابلة ، انظر32. لمزيد من التفاصيل حول التفاعلات بين الحمض النووي الريبي والبروتين الحمض النووي، انظر أيضا 1,2,26,59,60.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هنا، ونحن نظهر استخدام الملاقط البصرية المفلورة إلى جانب لدراسة التفاعلات والسلوك الديناميكي لجزيئات الحمض النووي الريبي مع مختلف ليغاندس. فيما يلي، تتم مناقشة الخطوات والقيود الهامة لهذه التقنية.
الخطوات الهامة في البروتوكول
أما بالنسبة للعديد من الطرق الأخرى، فإن جودة العينة محورية للحصول على بيانات موثوقة. لذلك ، للحصول على أعلى عينات الجودة الممكنة ، يجدر قضاء بعض الوقت لتحسين الإجراء لإعداد العينات. وتشمل خطوات التحسين التصميم التمهيدي المناسب ودرجات الحرارة الصلبة وال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
شكر وتقدير
نشكر أنوجا كيبي و جون البروفيسور ريدموند سميث على المراجعة النقدية للمخطوطة. نشكر تاتيانا كوخ على المساعدة التقنية الخبيرة. نشكر كريستينا بيكاركوفا على المساعدة في تسجيل مقاطع الفيديو التجريبية. يتم دعم العمل في مختبرنا من قبل جمعية هيلمهولتز وتمويل من مجلس البحوث الأوروبي (ERC) غرانت nr. 948636 (إلى NC).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوية >سلالات بكتيرية< / قوية > | |||
| بكتريا قولونية HB101 | مجموعة مختبر | N / A | استنساخ النواقل |
| < قوي > المواد الكيميائية والإنزيمات < / قوي > | |||
| كلوريد الصوديوم | سيجما ألدريتش | 31424 | المخازن |
| البيوتين -16-dUTP | روش | 11093070910 | البيوتينيل |
| BSA | Sigma-Aldrich | A4737 | Buffers |
| Catalase | Lumicks | N / A | نظام التعاف الأكسجين |
| Dithiothreitol (DTT) Melford | Labs | D11000 | Buffers |
| DNAse I من البنكرياس البقري | Sigma-Aldrich | D4527 | في النسخ المختبري |
| dNTPs | Th.Geyer | 11786181 | PCR |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | المخازن |
| المؤقتة فورماميد | سيجما ألدريتش | 11814320001 | المخازن |
| المؤقتة الجلوكوز | سيجما ألدريتش | G8270-1KG | نظام التعاف الأكسجين |
| الجلوكوز أوكسيديز | Lumicks | N / A | نظام التعاف الأكسجين |
| HEPES | Carl Roth | HN78.3 | المخازن المؤقتة |
| كلوريد المغنيسيوم | كارل روث | 2189.1 | المخازن المؤقتة |
| Phusion DNA polymerase | NEB | M0530L | Gibson Assembly ، استنساخ |
| كلوريد البوتاسيوم | Merck | 529552-1KG | المخازن المؤقتة |
| PrimeSTAR GXL DNA بوليميراز | تاكارا بيو Clontech | R050A | PCR |
| بيروفوسفاتاز ، حراري ، غير عضوي | NEB | M0296L | في النسخ المختبري |
| مثبط RNase | Molox | 1000379515 | Buffers |
| rNTPS | تقنيات الحياة | R0481 | في النسخ المختبري |
| ثيوسولوفات الصوديوم | سيجما-ألدريتش | S6672-500G | تعطيل التبييض |
| Sytox Green | Lumicks | N / A | قياسات متحد البؤر |
| T4 DNA Polymerase | NEB | M0203S | Biotinylation |
| T5 exonuclease | NEB | تجميع M0363S | Gibson ، استنساخ |
| T7 RNA polymerase | تم إنتاجه داخليا | N / A | في النسخ المختبري |
| Taq DNA polymerase | NEB | M0267S | PCR |
| Taq ligase | Biozym | L6060L | Gibson Assembly ، استنساخ |
| TWEEN 20 BioXtra | Sigma-Aldrich | P7949 | Buffers |
| < قوي > أطقم < قوي> | |||
| طقم وضع العلامات على البروتين Monolith RED-NHS الجيل الثاني (أمين التفاعلي) | Nanotemper | MO-L011 | يستخدم لوضع العلامات على الريبوسوم |
| Purefrex 2.0 | GeneFrontier | PF201-0.25-EX | الريبوسومات المستخدمة في وضع العلامات |
| < قوي > قليل النوكليوتيدات < / قوي > | |||
| 5 'مقبض T7 إلى الأمام | Microsynth | طلب | مخصص5 ' - CTTAATACGACTCACTATAGGTC CTTTCTGTGGACGCC - 3 '، تستخدم لإنشاء قالب نسخ OT في المختبر في PCR 1 |
| 3 'مقبض عكس | Microsynth ترتيب مخصص | 5' - ؛ GTCAAAGTGCGCCCCCCGTTATCC - 3 '، يستخدم لإنشاء قالب نسخ OT في المختبر في PCR 1 | |
| 5 'مقبض إلى الأمام | ترتيب مخصص Microsynth | 5' - TCCTTTGTGGACGCCGCC - 3 '، يستخدم لإنشاء مقبض 5 'في PCR 2 | |
| 5' مقبض عكسي | من أجل Microsynth | المخصص | 5 '- CATAAATACCTCTTTACTAATATA TATACCTTCGTAAGCTAGCGT - 3' ، يستخدم لإنشاء مقبض 5 'في PCR 2 |
| 3 'مقبض إلى الأمام | Microsynth | الترتيب المخصص | 5' - ATCCTGCAACCTGCTCTTCGCC AG - 3' ، يستخدم لإنشاء مقبض 3 'في PCR 3 |
| 3' مقبض عكس 5' المسمى بترتيب مخصص digoxigenin | Microsynth | 5 '-[Dig] -GTCAAAGTGCGCCCCCCGTTATCC - 3 '، يستخدم لتوليد مقبض 3 بوصات في PCR 3 | |
| ><ناقلات الحمض النووي القوية< / قوية> | |||
| pMZ_OT | تم إنتاجها داخليا | N / A | وصف إضافي في "الدراسات الهيكلية لبروتين فيروس القلب 2A تكشف عن الأساس الجزيئي للتعرف على الحمض النووي الريبي والتحكم الانتقالي" كريس إتش هيل ، سوسان نابثين ، لوكاس بيكاريك ، أنوجا كيبي ، أندرو إي فيرث ، ستيفن سي جراهام ، نيفا كاليسكان ، إيان بريرلي bioRxiv 2020.08.11.245035 ؛ دوي: |
| https://doi.org/10.1101/2020.08.11.245035<قوي>البرامج والخوارزميات | |||
| Atom | https://atom.io/packages/ide-python | N / A | |
| Bluelake | Lumicks | N / A | |
| Graphpad | https://www.graphpad.com/ | N / A | |
| InkScape 0.92.3 | https://inkscape.org/ | N / A | |
| Matlab | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | N / A | |
| N / A | |||
| RNAstructure | https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructure.html | N / A | |
| Spyder | https://www.spyder-ide.org/ | N / A | |
| أخرى< قوي> | |||
| جزيئات البوليسترين المطلية بالستربتافيدين ، 1.5-1.9 & م ، 5 مل ، 1.0٪ وزن / فولت | Spherotech | SVP-15-5 | |
| جزيئات البوليسترين المطلية بمكافحة الديجوكسيجينين ، 2.0-2.4 & micro ؛ م ، 2 مل ، 0.1٪ وزن / فولت | Spherotech | DIGP-20-2 | |
| محاقن | VWR | TERUMO SS + 03L1 | |
| Devices< / strong> | |||
| C-trap | Lumicks | N / A | & nbsp ؛ ملاقط بصرية مقترنة بالفحص المجهري متحد البؤر |
المراجع
- Balcerak, A., Trebinska-Stryjewska, A., Konopinski, R., Wakula, M., Grzybowska, E. A. RNA-protein interactions: disorder, moonlighting and junk contribute to eukaryotic complexity. Open Biology. 9 (6), 190096(2019).
- Armaos, A., Zacco, E., Sanchez de Groot, N., Tartaglia, G. G.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
