المقطع البصري والتصور للقرص الفقري من التطور الجنيني إلى الانحطاط

Summary

نقدم طريقة للتحقيق في تنظيم الخلايا الشوندروسيتية المكانية في الورم الليفي أنولوس للقرص الفقري باستخدام طريقة تقسيم بصري.

Abstract

انحطاط القرص الفقري (IVD) هو السبب الرئيسي لآلام أسفل الظهر ويستلزم درجة عالية من الضعف للأفراد المتضررين. لفك انحطاط القرص وتكون قادرة على تطوير نهج التجديد فهم شامل للبيولوجيا الخلوية لل IVD أمر ضروري. أحد جوانب هذه البيولوجيا التي لا تزال دون إجابة هو مسألة كيفية ترتيب الخلايا مكانيا في حالة فسيولوجية وأثناء الانحطاط. الخصائص البيولوجية لل IVD وتوافرها تجعل من الصعب تحليل هذا النسيج. تبحث هذه الدراسة في تنظيم الخلايا الشوندريوسية المكانية في الورم الليفي الكولوس من التطور الجنيني المبكر إلى انحطاط المرحلة النهائية. يتم تطبيق طريقة الأقسام البصرية (Apotome) لإجراء تحليلات تلطيخ عالية الدقة باستخدام الأنسجة الجنينية البقرية كنموذج حيواني وأنسجة القرص البشري التي تم الحصول عليها من المرضى الذين يخضعون لجراحة العمود الفقري. من كثافة chondrocyte عالية جدا في القرص البقري الجنيني في وقت مبكر، وعدد من الخلايا يقلل خلال الحمل والنمو، والنضج. في الأقراص البشرية ، رافقت زيادة الكثافة الخلوية تطور انحطاط الأنسجة. كما سبق أن ثبت في الغضروف المفصلي، تشكيل الكتلة يمثل سمة مميزة من انحطاط القرص المتقدمة.

Introduction

القرص الفقري (IVD) هو بنية تعتمد على الغضاريف التي كيميائيا بيولوجيا وفيما يتعلق العمارة الخلوية، للوهلة الأولى، يشبه في نواح كثيرة الغضاريف المفصلية¹. في الواقع، يتميز كل من انحطاط IVD وهشاشة العظام (OA) من الغضاريف المفصلية بضيق المساحة المشتركة بسبب ارتداء الغضاريف، والكيس تحت الوخزات وتشكيل هشاشة العظام، والتصلب تحت الوخز^2،3. على الرغم من هذه التشابهات الظاهرية تختلف العمارة والدور الوظيفي لكلا النسيجين. في حين تتكون مصفوفة الغضروف المفصلي بشكل رئيسي من شبكة الكولاجين من النوع الثاني المكونة للممرات ، يتكون IVD من ثلاثة أنواع مختلفة من الأنسجة: يأخذ اللبوس النواة الغني بالكولاجين من النوع الثاني في المركز الأحمال المحورية وينقلها إلى حلقة شاملة من ألياف الكولاجين الدائرية المعبأة بكثافة I والتي تسمى ليفية أنولوس. وظيفتها هي امتصاص الضغوط المحورية المترجمة التي تتلقاها النواة الغنية بالبروتيوغليكان والمياه مع قوة الألياف الطولية الشدية. في أعلى وأسفل كل نواة و anulus لوحة نهاية كارتيلاجينوس الهيالين يشكل تقاطع الفقرات المجاورة⁴ (الشكل 1).

في الغضاريف المفصلية، يمكن العثور على أربعة أنماط مميزة chondrocyte المكانية: أزواج، سلاسل، سلاسل مزدوجة، مجموعات صغيرة كبيرة على التوالي^5،6،7 ( الشكل2). وترتبط التغيرات في هذا النمط مع بداية الزراعة العضوية والتقدم^8،9. chondrocyte المكانية المنظمة هي أيضا مؤشرا على خاصية وظيفية مباشرة من الغضاريف، وهي صلابة لها، مما يؤكد على الصلة الوظيفية لهذا النهج الدرجات القائمة على الصورة^10،11. ويمكن بالإضافة إلى ذلك تحديد هذه الأنماط مع التكنولوجيا المتاحة سريريا بالفعل¹². نظرا لأوجه التشابه بين IVD والغضاريف المفصلية ، يمكن افتراض أن أنماط chondrocyte المميزة موجودة أيضا في IVD. تشكيل الكتلة هي ظاهرة لوحظت أيضا في IVD المنحطة^13،14.

عند محاولة تحليل تنظيم الخلوية المكانية في IVD، فمن الضروري للتغلب على العديد من الصعوبات التقنية التي ليست موجودة عند التحقيق غضروف المفصلي:

أولا، معالجة الأنسجة نفسها هي أكثر تحديا بكثير مما كانت عليه مع الغضروف الهيالين متجانسة التي تتكون إلى حد كبير من نوع الكولاجين الثاني. مكون الألياف الرئيسي في IVD هو الكولاجين من النوع الأول ، مما يجعل من الصعب توليد أقسام نسيجية رقيقة. بينما في الغضروف المفصلي الهيالين حتى أقسام سميكة يمكن تحليلها بسهولة بسبب طبيعة "الزجاج مثل" من الأنسجة، والكولاجين نوع الأول شبكة IVD لا يمكن اختراقها بصريا للغاية. لهذا السبب ، فإن الضوضاء الخلفية القوية هي مشكلة شائعة في علم الأنسجة في IVD. طريقة سريعة ورخيصة لاختراق هذا النسيج الكثيف بصريا هو استخدام جهاز تقسيم بصري على سبيل المثال ، عن طريق Apotome. في مثل هذا Apotome ، يتم إدخال شبكة في مسار الإضاءة لمجهر مضان تقليدي. أمام الشبكة يتم وضع لوحة زجاجية موازية للطائرة. هذا يميل ذهابا وإيابا وبالتالي إسقاط الشبكة في الصورة في ثلاثة مواقف مختلفة. لكل موقع z، يتم إنشاء ثلاث صور أولية مع الشبكة المتوقعة وفرضها. عن طريق برامج خاصة ، يمكن حساب الضوء خارج التركيز. والمبدأ الأساسي هو أنه إذا كانت الشبكة مرئية، فإن تلك المعلومات هي في بؤرة التركيز، إن لم يكن تعتبر بعيدة عن التركيز. مع هذه التقنية ، يمكن الحصول على صور مركزة بشكل جيد وعالية الدقة في فترة زمنية معقولة.

ثانيا، من الصعب اتى النسيج من المتبرعين البشريين. عند القيام باستبدال الركبة بالكامل، يمكن الحصول على كامل سطح المفصل لإجراء مزيد من التحليل أثناء الجراحة. على الرغم من هشاشة العظام من المفصل ثنائي المفاصل هو أيضا مرض في المفصل كله, ومع ذلك هناك اختلافات قوية في التنسيق نوعية الغضروف مع عادة بعض المناطق من المفصل لا تزال سليمة, على سبيل المثال بسبب انخفاض التحميل في تلك المنطقة. يختلف هذا الوضع في IVD ، حيث يتم إجراء الجراحة عادة فقط عندما يتم تدمير القرص عالميا. عند الحصول على الأنسجة من المتبرعين البشريين من غرفة العمليات ، يكون النسيج مجزأ للغاية أيضا ، ومن الضروري تخصيص الأنسجة بشكل صحيح لأحد أنواع الغضاريف الثلاثة لل IVD قبل إجراء المزيد من التحليلات. ولذلك، فإن السماح بإجراء تحليلات أكثر تفصيلا لأقسام الأنسجة الأكبر حجما والنظر في التطور الجنيني لل IVD هو أمر ضروري.

عند اختيار مثل هذا الكائن النموذجي من المهم أن يكون هناك نظام قابل للمقارنة مع القرص البشري فيما يتعلق بتشريحه وأبعاده ، وتحميله الميكانيكي ، وعدد الخلايا الحالية وكذلك تكوين الأنسجة. لغرض التقنية المعروضة هنا نقترح استخدام الأنسجة القطنية البقرية: خاصية حاسمة من القرص البشري مما أدى إلى إمكاناته التجديدية المنخفضة هو فقدان الخلايا نوتوشوردال أثناء النضج في النواة. ومع ذلك، في العديد من الكائنات الحية نموذج notochordal الخلايا يمكن الكشف عن حياتهم كلها لفترة طويلة. معظم الحيوانات القليلة التي تفقد خلاياها نوتوشوردال مثل الأغنام والماعز أو الأسماك chondrodystrophig لديها IVD التي هي أصغر بكثير من الأقراص البشرية. فقط أقراص البقر القطنية موجودة بقطر قرص برجي مماثل أقطار IVDs^{البشرية 15.}

أحد العوامل الرئيسية التي تؤدي إلى انحطاط القرص المبكر هو التحميل الميكانيكي المفرط. الضغوط داخل الفصالة من بقرة واقفة في العمود الفقري القطني حوالي 0.8 MPa مع العمود الفقري محاذاة أفقيا. من المستغرب أن هذه الضغوط مماثلة للضغوط القطنية داخل الشعب المبلغ عنها للعمود الفقري البشري المنتصب (0.5 MPa)^15،16. أيضا كمية المياه والبروتيوغليكان في أقراص البقر مماثلة لتلك التي من IVD من البشر الشباب¹⁷. لذلك ، على الرغم من أن نمط الحركة الفعلي لشرائح الحركة قد يختلف في الحيوانات الرباعية عن الإنسان ثنائي الساقين ، فيما يتعلق بخصائص التحميل والقرص الكلي ، فإن البقرة أقرب بكثير إلى البيولوجيا البشرية من النماذج الحيوانية الراسخة الأخرى لل IVD مثل الأغنام وال.

في هذا البروتوكول نقدم تقنية كيفية تحليل التغيرات في IVD من وجهة نظر تنظيم chondrocyte المكانية من التطور الجنيني المبكر لإنهاء انحطاط المرحلة.

Protocol

لتحليل النمو الجنيني والنضج ، تم استخدام أقراص الأبقار. لتقييم انحطاط ال IVD، تم تحليل العينات البشرية.

تم الحصول على أنسجة IVD البشرية من المرضى الذين يخضعون لعملية جراحية لانحطاط القرص القطني ، أو التدلي القرصي ، أو صدمة العمود الفقري في قسم جراحة العظام ، والمستشفى الجامعي في توبنغن ومركز الصدمات BG Tübingen. تم الحصول على موافقة اللجنة الأخلاقية الكاملة قبل بدء الدراسة (المشروع رقم 244/2013BO2). وقد تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من جميع المرضى قبل المشاركة. وقد نفذت هذه الأساليب وفقا للمبادئ التوجيهية المعتمدة.

تم الحصول على الأنسجة البقرية من مكتب ولاية بافاريا للصحة وسلامة الأغذية / Oberschleißheim ومن مصنع تقديم في Warthausen (ألمانيا). وتم الحصول على موافقة السلطات المحلية والبيطرية على الانسجة من الحيوانات النافقة .

1. عينة الحصاد

1. أنسجة IVD البشرية: ضع عينات IVD التي تم الحصول عليها أثناء الجراحة على الفور في متوسط النسر المعدل في دولبيكو (DMEM) مع 2٪ (v/v) من البنسلين-العقدية و 1.2٪ من (v/v) أمفوتريسين B. مخزن في 4 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة. معالجة الأنسجة في غضون 48 ساعة. بدلا من ذلك، تخزين الأنسجة في -20 درجة مئوية لعدة أسابيع.
2. الأنسجة الوريدية البقرية: تأكد من حصاد الأنسجة من الحيوانات في غضون 24 ساعة بعد الوفاة.
   استئصال أقراص البقر مع الفقرات المحيطة بها من الحيوانات الميتة en-bloc. نقل الأنسجة المجمدة على الجليد الجاف وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة.
   ملاحظة: إذا كان المقصود فقط تحليلات الفلورسينس وليس هناك المزيد من أساليب القياس الكمي الكيميائية الحيوية مثل ELISA أو PCR المخطط لها، إجراء تثبيت الأنسجة كما هو موضح أدناه. وهذا يسمح للحفاظ على الأنسجة لفترة أطول في التخزين قبل أن يحتاج إلى معالجة. لمنع تدهور مصفوفة الأنسجة، قم بإجراء التثبيت في غضون 48 ساعة بعد الحصاد ما لم يتم تجميد الأنسجة مباشرة.

2. إعداد العينة

1. إذابة الأنسجة المجمدة في درجة حرارة الغرفة. معالجة الأنسجة في أقرب وقت لا يمكن أن يشعر بلورات الجليد أي أكثر على ضغط لطيف الرقمية من الأنسجة.
   ملاحظة: إجراء إعداد الأنسجة في DMEM في طبق بيتري.
2. تحديد أصل أنسجة IVD البشرية (الأورام الليفية anulus ، المنطقة المتوسطة ، نواة اللب ، أو اللوحة النهائية cartilaginous) استنادا إلى خصائص العيان مثل كثافة الكولاجين والتوجه.
3. خذ الجزء المتحرك المكون من قرص IVD البقري مع فقرتين متجاورتين له وتشريح القرص ككل من العظم تحت الوخز باستخدام شفرة جراحية (شفرة رقم 15).
   1. استخدام اثنين من ملقط التشريحية لقلب القرص للوصول إلى مناطق أكثر توسيطا. إجراء تشريح. تأكد من استئصال اللب النواة الماضي كما هو أرق بكثير من anulus، عرضة للتمزق، وأنه لا يأتي قبالة بطريقة محددة بسهولة.
   2. تحديد مناطق مختلفة من الغضروف.
   3. قطع منطقة الاهتمام من القرص كله باستخدام شفرة الجراحية (شفرة رقم 20 أو 22). بدلا من ذلك، استخدم شفرة التبريد.
      ملاحظة: كما أقراص البقري تأتي en-bloc كجزء من العمود الفقري، يمكن إعداد الأقراص في توتو. وهذا يجعل التحديد الصحيح لأنواع مختلفة من الغضاريف أسهل بكثير. عند تشريح القرص هكذا الموضحة أعلاه، يبقى اللوح النهائي الكارتيلاجيني على الفقرات. إذا كان يجب التحقيق في هذه المنطقة، فمن الأفضل أن تؤخذ من العظام الكامنة مع إزميل العمل في اتجاه عرضي عازمة قليلا.
4. في حالة أن الأجنة هي من طول التاج الردف من أصغر من 20 سم، وضمان لمعالجة الأجنة في توتو للحفاظ على بنية الأنسجة من IVD. لا تقم بأي تشريح للفقرات في هذه الحالات.
5. بمجرد إعادة استئصال القرص في توتو، حدد المناطق المختلفة للغضاريف.
   1. إجراء الشارات في حمض الإيثيلينديامينتتراستيك (EDTA) (20٪ (ث / v)؛ درجة الحموضة = 7.4) في درجة حرارة الغرفة. اختيار حجم اعتمادا على حجم العينة - يجب أن تكون مغطاة بشكل جيد الأنسجة بأكملها مع EDTA.
   2. تغيير محلول الشارات يوميا والتي يمكن أن تستمر لمدة تصل إلى 5 أيام اعتمادا على حجم الأنسجة.
   3. تحقق من نجاح الشارات بإبرة قياس 20 تخترق الفقرات دون مقاومة ملحوظة.
      ملاحظة: التغيير اليومي لحل الشارات مهم لمنع EDTA الموثق chelate من التشبع للحفاظ على تأثيرية رد الفعل. كما أنه يمنع الاستعمار البكتيري.

3. تصنيف عمر العينة، والسلامة، والانحطاط

1. تصنيف الأنسجة القرص البشري في واحدة من خمس فئات التالية مع مساعدة من المعلومات السريرية وكذلك الأشعة السينية والتصوير بالرنين المغناطيسي¹⁸ (الشكل 3).
   ملاحظة: الفئة الأولى: لتكون بمثابة عينة شبه صحية استخدام anulus دون أي علامة إشعاعية من انحطاط IVD المستمدة من صدمة العمود الفقري الحادة.
   الفئة الثانية: لتوضيح حالة الالتهاب الحاد مع بداية الانحطاط استخدام الأنسجة من المنطقة المتوسطة من المرضى الذين يعانون من أعراض سريرية مع مدة أقل من 4 أسابيع.
   الفئة الثالثة: لوصف حالة كان فيها رد الفعل الالتهابي قد حان الوقت بالفعل للتأثير على الأنسجة والخلايا تأخذ الأنسجة من المرضى الذين تم إجراء عملية لتدلي نووي ولكن مع مدة أعراض تتجاوز 4 أسابيع.
   الفئة الرابعة: لانحطاط القرص المعتدل حدد anulus التي تم الحصول عليها من الجراحة مع الانصهار بين الأجسام لمرض القرص التنكسية مع درجة Pfirrmann من 3 أو 4 في التصوير بالرنين المغناطيسي¹⁹.
   الفئة الخامسة: بالنسبة لعملية انحطاط المرحلة النهائية التي تم الحصول عليها من الجراحة مع الانصهار بين الأجسام لمرض القرص التنكسي مع درجة Pfirrmann من 5.
2. تصنيف النسيج البقري على أساس مرحلة النمو / عمر الحيوان إلى واحدة من ثماني فئات ، كما هو معروض في الجدول 1.
   1. حساب عمر الحمل على طول التاج الردف من الأجنة على أساس الصيغة التي اقترحها كيلر:
      عمر الحمل بالشهور =
      ملاحظة: الحيوانات في الأسابيع ال 4 الأولى من الحمل الحالي مع طول التاج الردف من 0.8-2.2 سم²⁰.

4. تثبيت الأنسجة

1. تثبيت العينات في 10x حجم العينة من 4٪ (ث / v) محلول الفورمالديهايد في المالحة العازلة الفوسفات (PBS) خلال الليل في 4 درجة مئوية.
   ملاحظة: يخترق محلول الفورمالديهايد الأنسجة بمعدل حوالي 1 مم/ساعة من كل اتجاه. لعينات صغيرة جدا أو كبيرة جدا تعديل من التعرض وقت استطاع كنت ضرورية.
2. تخزين الأنسجة في برنامج تلفزيوني في 4 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة.

5. تقسيم الهسولوجيا

1. تضمين العينات في المتوسط تضمين قابلة للذوبان في الماء على مقبض الباب cryotome.
   1. ضع الأنسجة على المقبض بحيث يتم إنشاء إما طائرة محورية أو طائرة تقطع نوع الكولاجين I lamellae عمودي (على سبيل المثال، طائرة تقسيم القوس المتوسط).
      ملاحظة: يجب تغطية النسيج بالكامل من خلال وسيط التضمين.
2. قسم الأنسجة المضمنة بسماكة 70 ميكرومتر في العينات البشرية و 40 ميكرومتر في عينات الأبقار باستخدام كريوتومي قياسي.
   ملاحظة: يرجع الفرق في سمك المقطع إلى الفرق في سلامة الأنسجة بين القرص البقري السليم والأنسجة البشرية المنحطة للغاية.
3. جمع المقاطع على شريحة زجاجية.
   1. تطويق أقسام الأنسجة مع قلم مسعور.
   2. شطف المقاطع 3 مرات مع المالحة العازلة الفوسفات (PBS) لإزالة المتوسطة تضمين قابلة للذوبان في الماء.

6. تلطيخ الفلورسينس

1. إضافة 60 ميكرولتر من 1٪ (v/v) من DAPI (Exmax 358 نانومتر، إيماإكس 461 نانومتر) وكذلك 1٪ (v/v) من أكتين تتبع تلطيخ (Exmax 540 نانومتر، إيماإكس 565 نانومتر) في برنامج تلفزيوني واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة: بروتوكول تلطيخ وصفها هنا هو تصور النواة باستخدام DAPI تلطيخ النووية (الأزرق) والسيتوبلازم باستخدام Actin تتبع وصمة عار (أحمر). يحتوي IVD على فلورة تلقائية قوية بسبب ألياف الكولاجين في القناة الخضراء. كمية السوائل المضافة إلى المقاطع في هذا البروتوكول مخصصة لأقسام بحجم حوالي 5 مم × 5 مم. وبالنسبة للأقسام الأكبر حجما، يجب زيادة هذا المبلغ وفقا لذلك. قم بأداء جميع الأعمال في الغرف دون التعرض المباشر لأشعة الشمس ومع أضواء خافتة لمنع تبييض الصبغة.
2. إزالة السائل تلطيخ مع ماصة وغسل ثلاث مرات مع 60 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في كل مرة.
3. إضافة وسيط تركيب مناسبة وتغطية المقاطع مع زلة غطاء.
   ملاحظة: تأكد من عدم وجود فقاعات هواء عالقة عند إضافة زلة الغطاء. ويتم ذلك على أفضل وجه عن طريق بدء الاتصال من زلة مع الشريحة على حافة واحدة ومن ثم السماح زلة ينزل ببطء.

7. التصوير المجهري والمعالجة

1. ضع شريحة مع مقطع ملطخ على حامل العينة للمجهر.
   ملاحظة: نظرا لشبكة الكولاجين الكثيفة من النوع الأول من IVD ، يجعل الضوء المتناثر الأنسجة صعبة التصور باستخدام المجهر الفلوري التقليدي. إحدى الطرق لمعالجة هذه المشكلة هي إجراء المقاطع البصرية باستخدام الإضاءة المنظمة. وهذا يسمح أيضا لتقديم إسقاط ثلاثي الأبعاد للعينة بأكملها في كلا القناتين (الأزرق والأحمر). ويتم ذلك على أفضل وجه باستخدام إعداد الإضاءة منظم ووضع الفسيفساء مع عدسة هدف التكبير 10x للحصول على لمحة عامة عن العينة، فضلا عن إعادة بناء 3D من أنماط الفردية.
2. بدء تشغيل جهاز الإضاءة منظم.
   1. قم بإجراء تصوير واحد في مجال الرؤية باستخدام مجهر مضان مناسب ومرشحات مضانة وإضاءة كافية.
      ملاحظة: ضبط وقت التعرض لكافة المرشحات المستخدمة لتوحيد اقتناء التصوير. للحصول على تمثيل دقيق للعينة في صورة ذات دقة أعلى المقاطع ذات التكبير الأعلى (على سبيل المثال، هدف 20x).
   2. بعد معالجة الصور عن طريق تحسين كثافة وسطوع باستخدام برنامج تحسين الصورة متوافقة مع المجهر الفلوري.
3. لتصور المقطع ككل استخدم تقنية تصوير الفسيفساء
   1. افتح إعدادات الامتلاك (اضغط على 6D-Acquisition)من لوحة شريط الأدوات.
   2. ضبط إعدادات الفسيفساء (في سجل MosaiX)وتحديد عدد الأعمدة والصفوف من الصور حقل العرض التي سيتم دمجها لاحقا إلى صورة نظرة عامة واحدة.
   3. اضغط على الإعداد واضبط تصحيح التركيز على البلاطات الفردية.
      ملاحظة: يكاد يكون من المستحيل على قسم الأنسجة الكبيرة أن يكون سطح الأنسجة بأكمله في مستوى تركيز واحد. يمكن أخذ بلاط الصور على مستويات بؤرية مختلفة من خلال "اكتساب MosaiX".
   4. لبدء اكتساب إطارات الصور المتجانبة، اضغط على بدء.
   5. غرزة البلاط المصورة باستخدام وظيفة خياطة (زرخياطة) مع تداخل 20٪ أدرجت في البرنامج.
   6. بعد معالجة الصور عن طريق تحسين كثافة وسطوع باستخدام برنامج تحسين الصورة متوافقة مع المجهر الفلوري.
4. لتحليل المنظمة chondrocyte المكانية ، واستخدام وظيفة 3D المدرجة في البرنامج.
   1. ضبط إعدادات z-المكدس. تعريف معلمات المسح الضوئي: حدد موضعي البدء والتوقف في المحور z والمسافة الشريحة عن طريق تنشيط زر البدء/الإيقاف.
      ملاحظة: البرنامج تلقائيا بحساب عدد الشرائح.
   2. لبدء الحصول على الصور z-stacks، اضغط على ابدأ.
   3. بعد معالجة الصور عن طريق تحسين كثافة وسطوع باستخدام برنامج تحسين الصورة متوافقة مع المجهر الفلوري.
5. تصدير الصور مع تنسيق ملف متوافق مع برنامج معالجة الصور.
   ملاحظة: تصدير عمليات إعادة إنشاء ثلاثية الأبعاد كصور فردية أو/وكنموذج ثلاثي الأبعاد تفاعلي أو بتنسيق فيديو.

8. تحديد نمط الخلوية وتقييم الكثافة

1. افتح صور الفسيفساء المصدرة لقسم الأنسجة بأكمله في برنامج معالجة صور مناسب.
2. تحديد المناطق الخاضعة لتقييم كثافة الخلية من خلال تحديد المناطق ذات الأهمية من 500 ميكرومتر × 500 ميكرومتر في الصور.
   ملاحظة: يتم استبعاد كافة المربعات التي لا تحتوي على جودة صورة كافية من التحليل.
3. تحديد أنماط الخلوية الفردية.
   ملاحظة: يتم تعريف الخلايا المفردة كخلايا فردية - مغلفة بالكامل داخل المصفوفة المجاورة. وتعرف الأزواج بأنها خلية متجاورة على مقربة (<25 ميكرومتر) حيث يتم ترابط الخلايا من خلال مصفوفاتها (انظر الشكل 2). تشكيلات السلسلة هي على الأقل ثلاثة chondrocytes الانحياز في خط (من منتصف النواة <25 ميكرومتر). وتشمل هذه الخلايا مصفوفة سليمة ويمكن رؤية الترابط مصفوفة بين كل خلية. تمثل المجموعات خلايا متعددة تقع في القرب المباشر من بعضها البعض (<25 ميكرومتر) ويتم تغليفها في ثغرات كبيرة خالية من المصفوفة.
4. استخدم مكون إضافي لحساب الخلية للتحليل الكمي للأنماط الخلوية.
   ملاحظة: يمثل تلطيخ السيتوبلازم طريقة تحقق لتحديد الأنماط المكانية المختلفة.
5. حساب كثافة الخلية عن طريق تقسيم الخلايا التي تم عدها حسب حجم المنطقة المختارة من الفائدة.

Results

باستخدام صور الفسيفساء ، يمكن التعرف بوضوح على بنية IVD مع شبكة ألياف الكولاجين الكثيفة في anulus والنواة الأكثر ليونة(الشكل 4). ويمكن ملاحظة انخفاض مستمر في الكثافة الخلوية أثناء النمو الجنيني (الشكل 5). بينما في المراحل المبكرة من تطوير IVD يمكن العثور على كثافة خلية من 11435 خلية / مم² في الليفية الأبقار anulus و 17426 خلية / ملم² في لب النواة البقرية ، وهذه الأرقام تنخفض بسرعة إلى 1011 خلية / مم² (ليفي أنولوس البقري) و 488 خلية / مم² (نواة البقر اللب) حتى ال...

Discussion

باستخدام المجهر الفلوري المعزز بتصوير الفسيفساء والقسم البصري ، قمنا بتقييم الترتيب المكاني للخلايا الشوندرية في أنولوس IVD القطني طوال التطوير والنضج والانحطاط. في حين يمكن حصاد الأنسجة التنكسية من المرضى الذين يتلقون جراحة العمود الفقري لانحطاط القرص ، وتحليل الفترة الجنينية ومرحلة النضج يتطلب استخدام كائن حي نموذجي (البقرة). ولوحظت كثافات خلوية عالية في الندول خلال النمو الجنيني المبكر. وفي سياق التطور الإضافي، يمكن ملاحظة انخفاض واضح في الكثافة الخلوية بعد الولادة ونضوجها. في الأنسجة البشرية مع انحطاط القرص المتقدمة،...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
أمفوتريسين ب	ميرك KGaA,  ألمانيا	A2942
مجهر التصاق شرائح SuperFrost Plus	R. Langenbrinck ، ألمانيا	03-0060
ApoTome	Carl Zeiss MicroImaging GmbH ، ألمانيا	462000115
AxioVision Rel. 4.8 مع Modul MosaiX	Carl Zeiss MicroImaging GmbH ، ألمانيا
CellMask Actin Tracking Stain	Thermo Fischer Scientific ، الولايات المتحدة	A57249
Cryostat	Leica Biosystems ، الولايات المتحدة	CM3050S
DAPI	Thermo Fischer Scientific ، الولايات المتحدة	D1306
Dulbecco's Eagle's medium (DMEM)	Gibco ، Life Technologies ، ألمانيا	41966052
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك	سيجما ألدريتش ، الولايات المتحدة	الأمريكية 60004
منظار التألق - Axio Observer Z1 مع Axio Cam MR3 and Colibri	Carl Zeiss MicroImaging GmbH ، ألمانيا	3834000604
الفورمالديهايد	Merck KGaA ،   ؛ ألمانيا	104002
الصورة J 1.53a ، مع البرنامج المساعد لمضاد الخلية	National Insittute of Health (NIH) ، US
Invitrogen Alexa Fluor 568 Phalloidin	Thermo Fischer Scientific ، نظارات الغطاء المجهري الأمريكية	A12380
	R. Langenbrinck ، ألمانيا	01-1818 / 1
PAP Pen Liquid Blocker	Science Sevices   ؛ GmbH ، ألمانيا	N71310
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich ، US	P4333
محلول ملحي مخزن بالفوسفات	Sigma-Aldrich ، الولايات المتحدة	P5119
Scalpel	pf medical AG ، ألمانيا	2023-01
Tissue-tek O.C.T. مركب	Sakura Finetek ، هولندا	SA6255012