مقالة منهجية

استخدام تقنية المشبك التصحيحي لدراسة القدرة الحرارية للميتوكوندريا

DOI:

10.3791/62618

⸱

مايو 3, 2021

1Department of Physiology, David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تفصل مقالة هذه الطريقة الخطوات الرئيسية في قياس تسرب H + عبر غشاء الميتوكوندريا الداخلي باستخدام تقنية المشبك التصحيحي ، وهو نهج جديد لدراسة القدرة الحرارية للميتوكوندريا.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد تكوين الحرارة في الميتوكوندريا (المعروف أيضا باسم فك ارتباط الميتوكوندريا) أحد أكثر الأهداف الواعدة لزيادة إنفاق الطاقة لمكافحة متلازمة التمثيل الغذائي. الأنسجة الحرارية مثل الدهون البنية والبيج تطور الميتوكوندريا عالية التخصص لإنتاج الحرارة. الميتوكوندريا من الأنسجة الأخرى ، التي تنتج في المقام الأول ATP ، تحول أيضا ما يصل إلى 25 ٪ من إجمالي إنتاج طاقة الميتوكوندريا إلى حرارة ، وبالتالي ، يمكن أن يكون لها تأثير كبير على فسيولوجيا الجسم كله. لا يعد توليد الحرارة للميتوكوندريا ضروريا للحفاظ على درجة حرارة الجسم فحسب ، بل يمنع أيضا السمنة الناجمة عن النظام الغذائي ويقلل من إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) لحماية الخلايا من التلف التأكسدي. نظرا لأن توليد الحرارة في الميتوكوندريا هو منظم رئيسي لعملية التمثيل الغذائي الخلوي ، فإن الفهم الميكانيكي لهذه العملية الأساسية سيساعد في تطوير استراتيجيات علاجية لمكافحة العديد من الأمراض المرتبطة بخلل الميتوكوندريا. الأهم من ذلك ، أن الآليات الجزيئية الدقيقة التي تتحكم في التنشيط الحاد للتوليد الحراري في الميتوكوندريا غير محددة بشكل جيد. ويرجع هذا النقص في المعلومات إلى حد كبير إلى ندرة طرق القياس المباشر للبروتينات غير المقترنة. وقد مكن التطور الأخير لمنهجية المشبك الرقعة المطبقة على الميتوكوندريا، لأول مرة، من إجراء دراسة مباشرة للظاهرة في أصل توليد الحرارة للميتوكوندريا، وتسرب H+ من خلال IMM، وأول توصيف فيزيائي حيوي لناقلات الميتوكوندريا المسؤولة عنها، والبروتين غير المقترن 1 (UCP1)، المحدد للدهون البنية والبيج، وناقل ADP/ATP (AAC) لجميع الأنسجة الأخرى. سيوفر هذا النهج الفريد رؤى جديدة حول الآليات التي تتحكم في تسرب H + وتوليد الحرارة الميتوكوندريا وكيف يمكن استهدافها لمكافحة متلازمة التمثيل الغذائي. تصف هذه الورقة منهجية المشبك التصحيحي المطبقة على الميتوكوندريا لدراسة قدرتها الحرارية عن طريق قياس تيارات H+ مباشرة من خلال IMM.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تشتهر الميتوكوندريا بكونها قوة الخلية. في الواقع ، هم المصدر الرئيسي للطاقة الكيميائية ، ATP. ما هو أقل شهرة هو أن الميتوكوندريا تولد الحرارة أيضا. في الواقع ، كل ميتوكوندريون يولد باستمرار نوعين من الطاقات (ATP والحرارة) والتوازن الدقيق بين شكلي الطاقة يحدد توازن الخلايا الأيضية (الشكل 1). كيف توزع الميتوكوندريا الطاقة بين ATP والحرارة هو بالتأكيد السؤال الأكثر جوهرية في مجال الطاقة الحيوية ، على الرغم من أنه لا يزال غير معروف إلى حد كبير. نحن نعلم أن زيادة إنتاج حرارة الميتوكوندريا (تسمى توليد الحرارة الميتوكوندريا) ، وبالتالي تقليل إنتاج ATP يزيد من إنفاق الطاقة وهذه واحدة من أفضل الطرق لمكافحة متلازمة التمثيل الغذائي1.

ينشأ توليد الحرارة للميتوكوندريا من تسرب H+ عبر غشاء الميتوكوندريا الداخلي (IMM) ، مما يؤدي إلى فصل أكسدة الركيزة وتخليق ATP مع ما يترتب على ذلك من إنتاج للحرارة ، ومن هنا جاء اسم "فك ارتباط الميتوكوندريا"1 (الشكل 1). يعتمد تسرب H+ هذا على ناقلات الميتوكوندريا التي تسمى البروتينات غير المقترنة (UCPs). كان UCP1 أول UCP يتم تحديده. يتم التعبير عنه فقط في الأنسجة الحرارية والدهون البنية والدهون البيج التي تتخصص فيها الميتوكوندريا لإنتاج الحرارة2،3،4. ظلت هوية UCP في الأنسجة غير الدهنية مثل العضلات الهيكلية والقلب والكبد مثيرة للجدل. يمكن أن تحتوي الميتوكوندريا في هذه الأنسجة على حوالي 25٪ من إجمالي طاقة الميتوكوندريا المحولة إلى حرارة ، مما قد يؤثر بشكل كبير على فسيولوجيا الجسم كله1. إلى جانب الحفاظ على درجة حرارة الجسم الأساسية ، يمنع توليد الحرارة الميتوكوندريا أيضا السمنة الناجمة عن النظام الغذائي عن طريق تقليل السعرات الحرارية. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يقلل من إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) بواسطة الميتوكوندريا لحماية الخلايا من الضرر التأكسدي1. وبالتالي ، فإن التوليد الحراري للميتوكوندريا يشارك في الشيخوخة الطبيعية ، والاضطرابات التنكسية المرتبطة بالعمر ، وغيرها من الحالات التي تنطوي على الإجهاد التأكسدي ، مثل نقص التروية - التروية. لذلك ، فإن توليد الحرارة الميتوكوندريا هو منظم قوي لعملية التمثيل الغذائي الخلوي ، والفهم الميكانيكي لهذه العملية الأساسية سيعزز تطوير استراتيجيات علاجية لمكافحة العديد من الأمراض المرتبطة بخلل الميتوكوندريا.

كان التنفس الميتوكوندريا أول تقنية تكشف عن الدور الحاسم للتوليد الحراري للميتوكوندريا في التمثيل الغذائي الخلوي ولا تزال الأكثر شعبية في المجتمع1. تعتمد هذه التقنية على قياس استهلاك الأكسجين بواسطة سلسلة نقل إلكترون الميتوكوندريا (ETC) التي تزداد عند تنشيط تسرب الميتوكوندريا H+. هذه التقنية ، على الرغم من أنها مفيدة ، لا يمكنها دراسة تسرب الميتوكوندريا H + مباشرة عبر IMM1 ، مما يجعل التحديد الدقيق وتوصيف البروتينات المسؤولة عنه أمرا صعبا ، خاصة في الأنسجة غير الدهنية التي يكون فيها إنتاج الحرارة ثانويا مقارنة بإنتاج ATP. في الآونة الأخيرة ، قدم تطوير تقنية المشبك التصحيحي المطبقة على الميتوكوندريا ، أول دراسة مباشرة لتسرب H + عبر IMM بأكمله في الأنسجة المختلفة 5,6,7.

تم إنشاء مشبك رقعة الميتوكوندريا لكامل IMM لأول مرة بطريقة قابلة للتكرار بواسطة Kirichok et al.8. ووصفوا أول قياس مباشر لتيارات الميتوكوندريا يونيبورتر الكالسيوم (MCU) في عام 2004 باستخدام mitoplasts من خطوط خلايا COS-78. في وقت لاحق ، أظهر مختبر Kirichok تيارات الكالسيوم من IMMs من أنسجة الفأر 9 وذبابة الفاكهة 9. تستخدم مختبرات أخرى الآن هذه التقنية بشكل روتيني لدراسة الخصائص الفيزيائية الحيوية ل MCU10،11،12،13،14. من الممكن أيضا إجراء تحليل كامل لمشبك التصحيح IMM لتوصيل البوتاسيوم والكلوريد وقد تم ذكره في العديد من الأوراق البحثية ولكنه لم يكن بعد الموضوع الرئيسي لمنشور 6,7,9. تم الإبلاغ عن أول قياس لتيارات H + عبر IMM في عام 2012 من الميتوكوندريا6 ذات الدهون البنية للفئران ، ومن الميتوكوندريا الدهنية البيج للفئران في عام 20177. ويرجع هذا التيار إلى البروتين المحدد غير المقترن للأنسجة الحرارية ، UCP1 6,7. وصف العمل الأخير المنشور في عام 2019 AAC بأنه البروتين الرئيسي المسؤول عن تسرب الميتوكوندريا H + في الأنسجة غير الدهنية مثل القلب والعضلات الهيكلية5.

يسمح هذا النهج الفريد الآن بإجراء تحليل وظيفي مباشر عالي الدقة لقنوات أيون الميتوكوندريا والناقلات المسؤولة عن توليد الحرارة في الميتوكوندريا. لتسهيل توسيع الطريقة واستكمال الدراسات الأخرى مثل تنفس الميتوكوندريا ، يتم وصف بروتوكول مفصل أدناه لقياس تيارات H + التي تحملها UCP1 و AAC. يتم وصف ثلاث خطوات مهمة: 1) عزل الميتوكوندريا عن الدهون البنية للفأر لتحليل تيار H+ المعتمد على UCP1 والعزلة الميتوكوندريا من القلب لتحليل تيار H+ المعتمد على AAC ، 2) إعداد mitoplasts باستخدام مطبعة فرنسية للتمزق الميكانيكي لغشاء الميتوكوندريا الخارجي (OMM) ، 3) تسجيلات المشبك التصحيحي لتيارات H+ المعتمدة على UCP1 و AAC المعتمدة على H + عبر IMM بأكمله.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتوافق جميع الإجراءات التجريبية على الحيوانات التي تم تنفيذها مع المبادئ التوجيهية للمعاهد الوطنية للصحة وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية بجامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس (IACUC).

ملاحظة: يعتمد إجراء عزل الميتوكوندريا على الطرد المركزي التفاضلي ويختلف قليلا من نسيج إلى آخر. على سبيل المثال ، نظرا لأن الأنسجة الدهنية البنية غنية للغاية بالدهون ، فإنها تتطلب خطوة إضافية لفصل حطام الخلايا والعضيات عن مرحلة الدهون قبل حصاد الميتوكوندريا. لتجنب الارتباك ، يتم تفصيل إجراءي عزل الميتوكوندريا (أحدهما من الدهون البنية والآخر من القلب) أدناه.

1. عزل الميتوكوندريا عن الدهون البنية بين الكتف (المعدلة من Bertholet et al. 2020)15

  1. القتل الرحيم C57BL/6 الفأر الذكر باستخدام اختناق CO2 وخلع عنق الرحم اللاحق ، على النحو الموصى به من قبل فريق الجمعية الطبية البيطرية الأمريكية ولجنة IACUC.
  2. بعد وضع الفأر مع بطنه المواجه للطاولة ، رش الكحول لتنظيف الشعر وتبليله (تم تعديله من Mann et al.، 2014)16.
  3. قم بعمل شق 2 سم في الجزء العلوي من الظهر بعد الإمساك بالجلد باستخدام ملاقط.
  4. استخراج الدهون البنية بين الكتف من الماوس التي تتوافق مع عضو ثنائي الفصوص مع شكل فراشة16.
  5. انقل الدهون البنية إلى طبق بتري 35 مم مملوء ب 5 مل من عازل العزل البارد (الجدول 1) الموضوع مسبقا على الثلج.
  6. نظف الدهون البنية من الدهون البيضاء تحت منظار.
  7. انقل الدهون البنية إلى كوب سعة 10 مل مع 5 مل من عازل العزل البارد (الجدول 1) لتقطيعها إلى قطع رقيقة. نقل إلى مجانس الزجاج المبرد بالجليد 10 مل (مدقة المواد البلاستيكية البولي تترافلورو إيثيلين (PTFE).
  8. استخدم أداة تحريك علوية لتجانس الأنسجة المقطوعة مسبقا على الجليد بست ضربات لطيفة بسرعة يتم التحكم فيها تبلغ 275 دورة / دقيقة.
  9. جهاز طرد مركزي متجانس عند 8500 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية في أنبوب مخروطي بارد بالجليد سعة 15 مل. تخلص من المادة الفائقة التي تحتوي على مرحلة الدهون.
  10. أعد تعليق الكريات في 5 مل من العازل العازل للعزل البارد (الجدول 1) وقم بتجانس التعليق على الجليد مرة ثانية بست ضربات بطيئة بسرعة 275 دورة / دقيقة.
  11. انقل المتجانس في أنبوب مخروطي بارد بالجليد سعة 15 مل وقم بطرده مركزيا عند 700 × g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لتكسير جميع النوى والخلايا غير المنكسرة.
  12. اجمع السوبرناتانت في أنبوب جديد سعة 15 مل وضعه على الجليد.
  13. قم بطرد مركزي للجهاز الفائق عند 8500 × g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية للحصول على حبيبة تحتوي على الميتوكوندريا.
  14. أعد تعليق الكريات التي تحتوي على الميتوكوندريا في 3.8 مل من المخزن المؤقت للمانيتول مفرط التوتر (الجدول 2) واحتضن تعليق الميتوكوندريا على الجليد لمدة 10-15 دقيقة.

2. عزل الميتوكوندريا عن قلب الفأر (معدل من Garg et al. 2019)17

  1. القتل الرحيم C57BL/6 الفأر الذكر باستخدام اختناق CO2 وخلع عنق الرحم اللاحق ، على النحو الموصى به من قبل فريق الجمعية الطبية البيطرية الأمريكية ولجنة IACUC.
  2. بعد وضع الماوس على ظهره ، رش الكحول لتنظيف الشعر وترطيبه. ثم ، قم بعمل شق 2 سم على الصدر بعد الإمساك بالجلد باستخدام ملاقط.
  3. تشريح القلب من صدر الحيوان وشطفه لإزالة كل الدم في كوب 10 مل مع 5 مل من محلول العزل البارد (الجدول 1).
  4. بمجرد تطهير القلب من آثار الدم ، انقله إلى كوب آخر سعة 10 مل يحتوي على 5 مل من عازل العزل البارد (الجدول 1) لتقطيعه إلى قطع رقيقة. ثم ، انقل إلى مجانس زجاجي 10 مل مبرد بالجليد (مدقة PTFE).
  5. استخدم أداة تحريك علوية لتجانس الأنسجة المقطوعة مسبقا على الجليد بست ضربات لطيفة بسرعة يتم التحكم فيها تبلغ 275 دورة / دقيقة.
  6. انقل المتجانس إلى أنبوب مخروطي بارد بالجليد سعة 15 مل وقم بطرده مركزيا عند 700 × g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية إلى نوى الكريات والخلايا غير المنكسرة.
  7. اجمع السوبرناتانت في أنبوب جديد سعة 15 مل وضعه على الجليد.
  8. قم بطرد مركزي للجهاز الفائق عند 8500 × g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية للحصول على حبيبة تحتوي على الميتوكوندريا.
  9. أعد تعليق حبيبات الميتوكوندريا في 3.8 مل من المخزن المؤقت للمانيتول مفرط التوتر البارد (الجدول 2) واحتضن تعليق الميتوكوندريا على الجليد لمدة 10-15 دقيقة.

3. إعداد mitoplasts مع الصحافة الفرنسية للتمزق الميكانيكي من OMM.

ملاحظة: يسمح الإجراء الصحفي الفرنسي بتحرير IMM من OMM مع الحفاظ على سلامته ، بما في ذلك المصفوفة و crista (الشكل 2)18. يتم احتضان الميتوكوندريا مسبقا في مخزن مؤقت مفرط التوتر (الجدول 2) وتخضع لضغط أقل أثناء إجراء الصحافة الفرنسية لتجنب أي تمدد جذري ل IMM عند تمزق OMM.

  1. املأ تعليق الميتوكوندريا-فرط التوتر-مانيتول في خلية ضغط صغيرة مبردة (قطر المكبس 3/8 بوصة) من الصحافة الفرنسية (الشكل 3A).
  2. حدد الوضع المتوسط للضغط الفرنسي وضغط التعليق من خلال خلية الضغط الصغيرة عند 110 على قرص المعصرة الفرنسية للميتوكوندريا الدهنية البنية وعند 140 للميتوكوندريا القلبية (~ 2000 رطل لكل بوصة مربعة).  تأكد من أن التعليق يخرج من خلية الضغط الصغيرة بمعدل حوالي 1 قطرة / ثانية.
  3. اجمع القطرات في أنبوب مخروطي مبرد بالجليد سعة 15 مل.
  4. جهاز الطرد المركزي للتعليق عند 10500 × g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  5. أعد تعليق حبيبات mitoplasts في 0.5-2 مل من المخزن المؤقت Hypertonic-KCl البارد (الجدول 3) وقم بتخزين التعليق على الجليد.
    ملاحظة: الدهون البنية و mitoplasts القلب جاهزة لتسجيل المشبك التصحيح ويجب أن تظل قابلة للاستخدام لمدة 3-6 ساعات تقريبا.

4. التسجيلات الكهروفسيولوجية لتسرب H + من خلال UCP1 و AAC 5,7,15

ملاحظة: استخدم الإعداد الكهروفسيولوجي التالي (الشكل 3B): المجهر المقلوب مع تباين التداخل التفاضلي (DIC) ، وهدف الغمر المائي 60x ، وطاولة عزل الاهتزاز وقفص Faraday ، ومضخم صوت قياسي يدعم التسجيلات منخفضة الضوضاء ، وجهاز رقمنة قياسي يستخدم للإعداد الكهروفسيولوجي ، pClamp 10 ، ومناور دقيق ، وقطب مرجعي للحمام (3 M KCl-agar جسر ملحي مدرج داخل حامل microelectrode يحتوي على حبيبات كلوريد الفضة / الفضة مصبوبة في جسم الحامل (الموصوف في Liu et al. 2021)19 ، غرفة التروية ذات قاع الغطاء الزجاجي 0.13 مم ، متصلة بنظام تروية تغذيه الجاذبية.

  1. اسحب خيوط زجاج البورسليكات في يوم التسجيل باستخدام مجتذب ماصة دقيقة. قم بتعيين برنامج على المجتذب المستخدم لتوليد الماصات بدرجة عالية من الاستنساخ20.
    ملاحظة: يتطلب تصميم هذا البرنامج عدة محاولات للحصول على ماصات محسنة لمشبك تصحيح IMM. تحتوي الماصة القياسية على أطراف دقيقة ذات شكل مخروطي تدريجي.
  2. أدخل خيطا زجاجيا واحدا داخل المجتذب واسحبه للحصول على ماصتين متطابقتين تقريبا من خيوط البورسليكات الواحدة.
  3. اضبط البرنامج عندما تصبح الماصات غير متناسقة بين دورات السحب بسبب شيخوخة خيوط صندوق التسخين الخاصة بالمسحوب.
  4. ضع الماصة داخل ملمع الماصة وضع الطرف بالقرب من الخيوط تحت تكبير 100x لتلميعها.
  5. اضغط على دواسة القدم عدة مرات لتسخين الخيوط دون انسداد أو إتلاف منحنى الطرف.
  6. البولندية حتى يتم الحصول على الماصات ذات المقاومة بين 25 و 35 MΩ عند ملئها بمحلول ماصة قائم على TMA (TMA لهيدروكسيد رباعي ميثيل الأمونيوم ، الجدول 4).
  7. أغطية ما قبل الحضانة (قطرها 5 مم ، سمك 0.1 مم) مع 0.1٪ جيلاتين لتقليل التصاق mitoplast وشطفها بمحلول حمام KCl (الجدول 5) قبل إيداع تعليق mitoplast.
  8. تحضير تخفيف الخام عن طريق خلط ~ 35 ميكرولتر من تعليق mitoplast المركز مع 500 ميكرولتر من محلول حمام KCl (الجدول 5) ووضعه على أغطية وضعت سابقا في بئر من لوحة 4 آبار.
  9. احتضن على الجليد لمدة 15 إلى 20 دقيقة للميتوبلاستيدات إلى الرواسب على الغطاء.
  10. املأ غرفة الحمام بالكامل ب ~ 50 ميكرولتر من محلول حمام KCl (الجدول 5).
  11. انقل غطاء مع mitoplasts داخل الغرفة باستخدام ملاقط تشريح مجهري رقيقة مع طرف عازم.
  12. رتب الغطاء في الجزء السفلي من الغرفة. لا تقم بتحريك الغرفة للحفاظ على استقرار mitoplasts على الغطاء.
  13. اختر mitoplast غير لاصق فردي على شكل 8 عن طريق مسح الغطاء تحت المجهر بهدف 60x.
  14. قم بتحميل الماصة بمحلول الماصة (~ 50 ميكرولتر) وضعها في حامل الماصة.
  15. أحضر الماصة إلى محلول الحمام باستخدام جهاز مناور دقيق واقترب منه فوق mitoplast المحدد مباشرة للاقتراب من IMM. يعطي برنامج مكبر الصوت مقاومة الماصة بمجرد وجودها في محلول الحمام. امسك إمكانات الغشاء عند 0 mV وقم بتطبيق نبضات 10 mV باستخدام أمر اختبار الغشاء في برنامج مكبر الصوت.
  16. تطبيق ضغط سلبي طفيف لإنشاء جيجاسيال بسرعة مع IMM (الشكل 2B).
  17. ارفع الماصة مع تثبيت mitoplast لإبعادها عن الغطاء لتجنب كسر الختم بسبب انحراف الماصة أثناء التجربة.
  18. قم بتعويض عابرات السعة الضالة بأمر "اختبار الغشاء" في برنامج مكبر الصوت قبل اختبار تكوين mitoplast الكامل للحصول على قياس السعة الصحيح (Cm) لغشاء mitoplast بعد الاقتحام.
  19. قم بتطبيق نبضات الجهد قصيرة المدة (5-15 مللي ثانية) (250-600 مللي فولت) مع برنامج مكبر الصوت لتمزيق رقعة الغشاء تحت الماصة الزجاجية وتحقيق تكوين mitoplast الكامل (الشكل 2C). ينعكس الاقتحام الناجح من خلال عودة ظهور العابرين للسعة.
  20. بعد الاقتحام ، قم بتركيب السعة العابرة مع خيار اختبار الغشاء لبرنامج مكبر الصوت لتقييم سعة الغشاء (التي تعكس حجم mitoplast) ومقاومة الوصول Ra (مما يعكس جودة تكوين mitoplast الكامل). بعد الاقتحام ، يجب أن يكون Ra بين 40 و 80 MΩ. عادة ما يكون لل Mitoplasts (2-6 ميكرومتر في الحجم) المستخدمة في تجارب مشبك التصحيح سعات غشائية من 0.5-1.1 pF.
  21. مباشرة بعد الاقتحام ، استبدل محلول حمام KCl (الجدول 5) بمحلول حمام HEPES (الجدول 6) عن طريق بدء التروية.
  22. قم بتطبيق بروتوكول منحدر 850 مللي ثانية مصمم باستخدام برنامج مكبر الصوت ، من -160 mV إلى +100 mV مع فاصل زمني 5 s ، مع الاحتفاظ ب mitoplast عند 0 mV. يعمل هذا البروتوكول مع دراسات UCP1 6,7,15 و AAC 5 (الشكل 4 والشكل 5).
    ملاحظة: يوصى بأن تحصل قياسات التيار H+ المعتمدة على UCP1 و AAC على جميع البيانات الكهروفسيولوجية عند 10 كيلو هرتز وأن ترشح عند 1 كيلو هرتز باستخدام برامج كافية تقود مكبر الصوت والرقمنة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قدم تطوير منهجية المشبك الرقعة المطبقة على الميتوكوندريا أول دراسة مباشرة لتسرب H + من خلال IMM وناقلات الميتوكوندريا ، UCP1 و AAC ، المسؤولة عن ذلك. يمكن أن يوفر التحليل الكهروفسيولوجي لتسريبات H+ المعتمدة على UCP1 و AAC نظرة أولى على القدرة الحرارية للميتوكوندريا. يصف قسم النتائج الإجراءات القياسية لقياس تسرب H+ عبر UCP1 و AAC.

قياس التيار H+ المعتمد على UCP1 (الشكل 4)6,7,15

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تهدف مقالة هذه الطريقة إلى تقديم تقنية المشبك التصحيحي التي تم تطبيقها مؤخرا على الميتوكوندريا ، وهو نهج جديد لدراسة تسرب H + مباشرة من خلال IMM المسؤول عن توليد الحرارة الميتوكوندريا5،6،7،15. لا تقتصر هذه التقنية على الأنسجة ويمكن استخدامها أيضا لتحليل تسرب H + والموصلات الأخرى ل IMM في نماذج بشرية وخلوية قياسية مختلفة مثل HAP1 و COS7 و C2C12 و MEF. ومع ذلك، يتطلب كل عزل ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ولا يعلن صاحب البلاغ عن أي مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أشكر الدكتور يوري كيريشوك على العلم العظيم الذي كنت جزءا منه في مختبره وأعضاء مختبر كيريشوك على المناقشات المفيدة. كما أشكر الدكتور دوغلاس سي والاس على توفير الفئران AAC1 بالضربة القاضية. التمويل: تم دعم A.M.B من قبل جائزة التطوير الوظيفي لجمعية القلب الأمريكية 19CDA34630062.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.1٪ جيلاتينMilliporeES-006-B
60X هدف الغمر في الماء ، الفتحة العددية 1.20أوليمبوسUPLSAPO60XW
أكسوباتش 200B مكبر للصوتالأجهزة الجزيئية الشعيرات
الدموية الزجاجية البورسليكاتأدوات سوترBF150-86-10
Digidata 1550B أجهزة جزيئية
قفص فارادايمحلي الصنع
الفرنسية الصحافةجلين ميلز5500-000011
IKA Eurostar PWR CV S1 مختبر النمام
المجهر العكوسأوليمبوسIX71 أو IX73
مايكروفورج (ناريشيج)MF-830
Micromanupulator MPC-385سوتر الأدواتFG-MPC325
حامل القطب الكهربائي الدقيق لجسر أجارالدقةالعالمية MEH3F4515
مجتذب الماصات الدقيقة(أدوات سوتر)خليةP97
للصحافةالفرنسية Glen Mills5500-FA-004
MIXER IKA 6-2000RPMCole ParmerEW-50705-50
تكبير الهدف 100Xنيكون عدسةMPlan 100/0.80 ELWD 210/0
pClamp 10جزيئية
غرفة الترويةWarner InstrumentsRC-24E
Potter-Elvehjem الخالط 10 ملمبرد Wheaton
SORVALL X4R PRO-MDThermo Scientific75 009 521
أغطية زجاجية مستديرة صغيرة: قطر 5 مم ، سمك 0.1 ممWarner Instruments640700
طاولة عزل الاهتزازنيوبورتVIS3036-SG2-325A
< قوي > كيماويات < / قوي >
حمض جلوكونيكسيجما ألدريتشG1951
D-mannitol& nbsp ؛ سيجما ألدريتشM4125
EGTA  سيجما ألدريتش3777
HEPES  سيجما ألدريتشH7523
KCl  سيجما ألدريتش60128
MgCl2  سيجما ألدريتش63068
السكروز  سيجما ألدريتشS7903
TMA  سيجما ألدريتش331635
TrisBase  سيجما ألدريتشT1503
TrisCl  سيجما ألدريتشT3253
محول الأرقامالعلوي أدوات صغيرة أجهزة جهاز طرد مركزي 358039

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Divakaruni, A. S., Brand, M. D. The regulation and physiology of mitochondrial proton leak. Physiology (Bethesda). 26 (3), 192-205 (2011).
  2. Chouchani, E. T., Kazak, L., Spiegelman, B. M. New advances in adaptive thermogenesis: UCP1 and beyond. Cell Metabolism. 29 (1), 27-37 (2019).
  3. Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. 84 (1), 277-359 (2004).
  4. Nicholls, D. G. The hunt for the molecular mechanism of brown fat thermogenesis. Biochimie. 134, 9-18 (2017).
  5. Bertholet, A. M., et al. H(+) transport is an integral function of the mitochondrial ADP/ATP carrier. Nature. 571 (7766), 515-520 (2019).
  6. Fedorenko, A., Lishko, P. V., Kirichok, Y. Mechanism of fatty-acid-dependent UCP1 uncoupling in brown fat mitochondria. Cell. 151 (2), 400-413 (2012).
  7. Bertholet, A. M., et al. Mitochondrial patch clamp of beige adipocytes reveals UCP1-positive and UCP1-negative cells both exhibiting futile creatine cycling. Cell Metabolism. 25 (4), 811-822 (2017).
  8. Kirichok, Y., Krapivinsky, G., Clapham, D. E. The mitochondrial calcium uniporter is a highly selective ion channel. Nature. 427 (6972), 360-364 (2004).
  9. Fieni, F., Lee, S. B., Jan, Y. N., Kirichok, Y. Activity of the mitochondrial calcium uniporter varies greatly between tissues. Nature Communications. 3, 1317(2012).
  10. Chaudhuri, D., Sancak, Y., Mootha, V. K., Clapham, D. E. MCU encodes the pore conducting mitochondrial calcium currents. eLife. 2, 00704(2013).
  11. Vais, H., Payne, R., Paudel, U., Li, C., Foskett, J. K. Coupled transmembrane mechanisms control MCU-mediated mitochondrial Ca(2+) uptake. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (35), 21731-21739 (2020).
  12. Vais, H., et al. EMRE is a matrix Ca(2+) sensor that governs gatekeeping of the mitochondrial Ca(2+) uniporter. Cell Reports. 14 (3), 403-410 (2016).
  13. Vais, H., et al. MCUR1, CCDC90A, is a regulator of the mitochondrial calcium uniporter. Cell Metabolism. 22 (4), 533-535 (2015).
  14. Kamer, K. J., et al. MICU1 imparts the mitochondrial uniporter with the ability to discriminate between Ca(2+) and Mn(2+). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (34), 7960-7969 (2018).
  15. Bertholet, A. M., Kirichok, Y. Patch-clamp analysis of the mitochondrial H(+) leak in brown and beige fat. Frontiers in Physiology. 11, 326(2020).
  16. Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, identification, and excision of murine adipose depots. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (94), e52174(2014).
  17. Garg, V., Kirichok, Y. Y. Patch-clamp analysis of the mitochondrial calcium uniporter. Methods in Molecular Biology. 1925, 75-86 (2019).
  18. Decker, G. L., Greenawalt, J. W. Ultrastructural and biochemical studies of mitoplasts and outer membranes derived from French-pressed mitochondria. Advances in mitochondrial subfractionation. Journal of Ultrastructure Research. 59 (1), 44-56 (1977).
  19. Liu, B., et al. Recording electrical currents across the plasma membrane of mammalian sperm cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), (2021).
  20. Flaming, D. G., Brown, K. T. Micropipette puller design: form of the heating filament and effects of filament width on tip length and diameter. Journal of Neuroscience Methods. 6 (1-2), 91-102 (1982).
  21. Klingenberg, M. The ADP and ATP transport in mitochondria and its carrier. Biochimica and Biophysica Acta. 1778 (10), 1978-2021 (2008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

1 ADP ATP

مقالات ذات صلة