استخراج وتصور مجاميع البروتين بعد علاج الإشريكية القولونية مع الإجهاد البروتيوكسي

البكتيريا تتعرض حتما لعدد لا يحصى من الضغوط البيئية، بما في ذلك انخفاض درجة الحموضة (على سبيل المثال، في معدة الثدييات)^1،2، الأكسجين التفاعلي وأنواع الكلور (ROS / RCS) (على سبيل المثال ، أثناء الانفجار التأكسدي في الخلايا الأكسدية)^3،4،5، درجات حرارة مرتفعة (على سبيل المثال ، في الينابيع الساخنة أو أثناء الصدمة الحرارية)^6،7، والعديد من مضادات الميكروبات القوية (على سبيل المثال ، AGXX المستخدمة في هذا البروتوكول)⁸. البروتينات هي عرضة بشكل خاص لأي من هذه الضغوطات، والتعرض يمكن أن تثير البروتين الامم المتحدة / طيها ثم تجميع البذور. جميع الكائنات الحية تستخدم أنظمة الحماية التي تسمح لهم للتعامل مع البروتين طي^9. ومع ذلك، يمكن أن تطغى الضغوط الشديدة على آلات مراقبة جودة البروتين وتعطيل البنية الثانوية و/أو الثالثة للبروتينات، والتي تؤدي في نهاية المطاف إلى تعطيل البروتينات. ونتيجة لذلك، يمكن أن تضعف مجاميع البروتين بشدة الوظائف الخلوية الحرجة المطلوبة للنمو البكتيري والبقاء على قيد الحياة، ومقاومة الإجهاد، والفوعة¹⁰. لذلك ، فإن الأبحاث التي تركز على تجميع البروتين وعواقبه في البكتيريا هي موضوع مهم بسبب تأثيره المحتمل على مكافحة الأمراض المعدية.

البروتين الناجم عن الحرارة تتكشف والتجميع وغالبا ما تكون عكسها⁷. في المقابل، يمكن أن تسبب الضغوط البروتيوكسية الأخرى، مثل الإجهاد التأكسدي، تعديلات بروتينية لا رجعة فيها من خلال أكسدة سلاسل جانبية محددة من الأحماض الأمينية مما يؤدي إلى البروتين un-/misfolding، وفي نهاية المطاف، تجميع البروتين⁴. وقد درس تشكيل الإجهاد الناجم عن المجاميع البروتين غير قابل للذوبان على نطاق واسع في سياق المرافقين الجزيئية ووظائفها الوقائية في الخميرة والبكتيريا^11،12،13. وقد تم نشر العديد من البروتوكولات التي تستخدم مجموعة متنوعة من التقنيات الكيميائية الحيوية لعزل وتحليل المجاميع البروتين غير القابلة للذوبان^{14،15،16،17}. وقد استخدمت البروتوكولات القائمة أساسا لدراسة تجميع البروتين البكتيري عند الصدمة الحرارية و / أو تحديد المرافقين الجزيئية. في حين أن هذه البروتوكولات كانت بالتأكيد تقدما في هذا المجال ، هناك بعض المضايقات الرئيسية في الإجراءات التجريبية لأنها تتطلب (1) حجم ثقافة بكتيرية كبيرة تصل إلى 10 L^14،17، (ii) عمليات التعطيل المادي المعقدة ، بما في ذلك استخدام أجهزة تعطيل الخلايا ، والصحافة الفرنسية ، و / أو سونيكيشن^14،15،17، أو (3) تستغرق وقتا طويلا غسل واحتضان الخطوات^15،16،17.

تصف هذه الورقة بروتوكولا معدلا يهدف إلى معالجة قيود النهج السابقة ويسمح بتحليل كمية مجاميع البروتين التي تشكلت في نوعين مختلفين من سلالات الإشريكية القولونية بعد العلاج بطلاء سطح مضاد للميكروبات بروتيتيوكسي. يتكون الطلاء من الفضة المعدنية (Ag) والروثينيوم (Ru) مكيفة بحمض الأسكوربيك ، ويتحقق نشاطها المضاد للميكروبات من خلال توليد أنواع الأكسجين^{التفاعلية 8،18}. هنا هو وصف مفصل لإعداد الثقافة البكتيرية بعد العلاج مع مركب مضاد للميكروبات ومقارنة حالة تجميع البروتين عند التعرض لسلالات كولاي اثنين مع ملامح قابلية متميزة لزيادة تركيز مضادات الميكروبات. الطريقة الموصوفة غير مكلفة وسريعة وقابلة للاستنساخ ويمكن استخدامها لدراسة تجميع البروتين في وجود مركبات بروتوتوكسية أخرى. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تعديل البروتوكول لتحليل تأثير حذف الجينات المحددة على تجميع البروتين في مجموعة متنوعة من البكتيريا المختلفة.

1. علاج الإجهاد من سلالات الإشريكية القولونية MG1655 و CFT073

1. تلقيح 5 مل من مرق الليوجيني (LB) المتوسطة مع مستعمرة واحدة من commensal E. القولونية سلالة MG1655 وuropathogenic E. القولونية (UPEC) سلالة CFT073، على التوالي، واحتضان لمدة 14-16 ساعة (بين عشية وضحاها) في 37 درجة مئوية و 300 دورة في الدقيقة.
   ملاحظة: إيشريشيا كولاي CFT073 هو ممرض الإنسان. يجب أن يتم التعامل مع CFT073 مع تدابير السلامة البيولوجية المناسبة في مختبر معتمد من المستوى 2 للسلامة البيولوجية.
2. تمييع كل سلالة في قارورة 500 مل تحتوي على 70 مل من 3-(N-morpholino) حمض البروبانسولفونيك (MOPS) - الجلوكوز (MOPS-g) (الجدول 1) متوسطة إلى كثافة بصرية في 600 نانومتر (OD₆₀₀) قيمة 0.1. حضانة عند 37 درجة مئوية و 300 دورة في الدقيقة حتى منتصف مرحلة السجل يتم التوصل (OD₆₀₀ = 0.5-0.55).
3. نقل 20 مل من كل ثقافة إلى ثلاث قوارير 125 مل قبل الحرب واحتضانها عند 37 درجة مئوية و300 دورة في الدقيقة لمدة دقيقتين.
   ملاحظة: كما هو مطلوب معالجة العينات في الوقت المناسب معالجة لا يزيد عن 6 cultures في كل مرة.
4. إعداد محلول مركب مضاد للميكروبات في المتوسط MOPS-g بتركيز 2 ملغم/مل. إضافة مضادات الميكروبات إلى كل ثقافة للوصول إلى التركيزات المشار إليها. للتحكم غير المعالج، أضف الحجم المطلوب من وسيط MOPS-g.
   ملاحظة: دوامة محلول مضاد للميكروبات 2 ملغم/مل للسماح بتوزيع متساو للجسيمات المركبة وتجنب الترسيب.
5. احتضان الثقافات لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 300 دورة في الدقيقة.

الشكل 1: علاج الإجهاد الإشريكية القولونية. تزرع الثقافات البكتيرية في MOPS-g وتعالج بتركيزات المشار إليها من مضادات الميكروبات المحتوية على الفضة الروثينيوم عند الوصول إلى مرحلة منتصف السجل. الاختصارات: LB = مرق الليوجيني؛ Ag-Ru = الفضة الروثينيوم; MOPS-g = 3-(N-morpholino) حمض البروبانسولفونيك (MOPS) - الجلوكوز. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. جمع عينات الخلايا البكتيرية

1. بعد 45 دقيقة من علاج الإجهاد، حدد OD₆₀₀ من كل ثقافة. وبالنسبة لكل عينة، تحصد الخلايا ما يعادل 4 مل من الأوزون₆₀₀ = 1 في 15 مل من أنابيب الطرد المركزي عن طريق الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة عند 3000 × غرام و4 درجات مئوية.
2. إزالة تماما supernatant وإعادة إنفاق الكريات الخلية في 50 ميكرولتر من الجليد الباردة تحلل العازلة (الجدول 1). احتضان العينات لمدة 30 دقيقة على الجليد.
   ملاحظة: هذه الخطوة تحلل طبقة بيبتيدوغليكان. استخدم دائما مخزن تحلل حديث الإعداد.
3. نقل العينات إلى أنابيب 1.7 مل من أجهزة الطرد المركزي الدقيق. تجميد عند -80 درجة مئوية حتى مزيد من الاستخدام.

الشكل 2: جمع عينات بكتيرية. يتم حصاد عينات الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة إنفاقها في مخزن تحلل متبوعا بالتخزين عند -80 درجة مئوية.

3. استخراج المجاميع البروتين غير قابل للذوبان

1. تذوب العينات على الجليد.
   ملاحظة: دورة التجميد-ذوبان يساهم في تحلل الخلية.
2. إضافة 360 ميكرولتر من الجليد الباردة العازلة A (الجدول 1) وتخلط بلطف عن طريق pipetting.
   ملاحظة: سوف تسهم الصدمة التناضحية أيضا في تحلل الخلية.
3. نقل العينة إلى أنبوب 2 مل من أجهزة الطرد المركزي الدقيقة التي تحتوي على ~ 200 ميكرولتر من الخرز الزجاجي 0.5 ملم. احتضان لمدة 30 دقيقة في 8 درجة مئوية في thermomixer مع اهتزاز في 1400 دورة في الدقيقة.
   ملاحظة: هذه الخطوة ينتج عن تعطيل فعلي للخلية. يمكن استخدام مثبط البروتيز لتقليل تدهور البروتين. يمكن إجراء التعطيل عند 4 درجات مئوية. لاحظ أنه تم الإبلاغ عن استخدام الخرز الزجاجي للحث على تجميع مجموعة فرعية صغيرة من البروتينات في الخميرة^19.
4. احتضان لمدة 5 دقائق على الجليد دون اهتزاز لتسوية الخرز الزجاجي. نقل 200 ميكرولتر من lysate الخلية إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيق 1.7 مل.
   ملاحظة: تجنب نقل الخرز الزجاجي.
5. جهاز طرد مركزي عند 16,000 × غرام و4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. جمع supernatant، الذي يحتوي على البروتينات القابلة للذوبان، والمضي قدما إلى القسم 4.
6. Resuspend بيليه في 200 ميكرولتر من الجليد الباردة العازلة A (الجدول 1) باستخدام ماصة. جهاز طرد مركزي عند 16,000 × غرام و4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. إزالة بعناية فائقة تماما.
7. إضافة 200 ميكرولتر من الجليد الباردة العازلة B (انظر الجدول 1 وجدول المواد)وإعادة إنفاق بعناية بيليه عن طريق pipetting.
   ملاحظة: المنظفات غير الأيونية تعمل على تليين بروتين الغشاء.
8. كرر جهاز الطرد المركزي عند 16000 × غرام و 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. إزالة بعناية فائقة.
9. Resuspend بيليه في 200 ميكرولتر من العازلة الباردة A (الجدول 1) عن طريق pipetting. جهاز طرد مركزي عند 16,000 × غرام و4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. إزالة تماما supernatant.
10. Resuspend بيليه في 100 ميكرولتر من 1x الحد من التخزين المؤقت عينة SDS (الجدول 1) ويغلي لمدة 5 دقائق في 95 درجة مئوية في thermomixer.
11. تخزين العينة في -20 درجة مئوية للمتابعة في وقت لاحق أو تحميل فورا على هلام البولي أكريلاميد SDS لفصل.

الشكل 3:استخراج مجاميع البروتين غير القابلة للذوبان. استخراج المجاميع البروتين ينطوي على سلسلة من الخطوات بما في ذلك تعطيل الخلايا، وفصل المجاميع البروتين من البروتينات القابلة للذوبان، وذوبان البروتينات الغشائية، والغسيل. اختصار: SDS = كبريتات دودسيل الصوديوم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

4. إعداد عينة البروتين القابل للذوبان

1. مزيج 1 حجم 100٪ حمض ثلاثي الكلور (TCA) مع 4 مجلدات من عينة البروتين القابل للذوبان من الخطوة 3.6.
   ملاحظة: يتطلب التعامل مع TCA غطاء الدخان ومعدات الحماية الشخصية وإجراء التخلص من النفايات المعتمدة.
2. احتضان لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية للسماح لهطول الأمطار البروتين.
   ملاحظة: سوف تظهر الترسب الأبيض قريبا جدا.
3. الطرد المركزي للتعجيل في 21،000 × غرام و 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وإزالة supernatant. غسل بيليه مع 200 ميكرولتر من الأسيتون الجليد الباردة لإزالة الحطام الخلوي. جهاز الطرد المركزي في 21،000 × غرام و 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وإزالة supernatant. كرر هذه الإجراءات في الخطوة 4.3 ما مجموعه ثلاث مرات.
4. ضع أنابيب الطرد المركزي الدقيق ذات الأغطية المفتوحة في ثيرموميكسير عند 37 درجة مئوية لإزالة الأسيتون المتبقي من الكريات.
   ملاحظة: حضانة أكثر من 5 دقائق قد يقلل من قابلية الذوبان من بيليه البروتين.
5. إضافة 100 ميكرولتر من 1x الحد من المخزن المؤقت SDS (الجدول 1) وحل تماما بيليه. غلي العينة لمدة 5 دقائق في 95 درجة مئوية.
6. تخزين عينة في -20 درجة مئوية للمتابعة في وقت لاحق أو تحميل فورا على هلام بولياكريلاميد SDS لفصل.

الشكل 4:إعداد البروتينات القابلة للذوبان. إعداد البروتين القابل للذوبان ينطوي على خطوة هطول الأمطار مع حمض ثلاثي الكلور والغسيل المتكرر مع الأسيتون الجليد الباردة. المختصرات: TCA = حمض ثلاثي الكلور؛ SDS = كبريتات دودسيل الصوديوم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

5. الفصل والتصور من المجاميع البروتين المستخرج باستخدام SDS-PAGE

1. إعداد هلام SDS-polyacrylamide 12٪.
   1. لاثنين من المواد الهلامية فصل، ماصة 5.1 مل من الماء المقطر المزدوج (ddH₂O)، 3.75 مل من تريس-HCl (درجة الحموضة 8.8)، 7.5 مل من 20٪ (ث / v) SDS، 6 مل من 30٪ من مادة الأكريلاميد/بيساكريلاميد (29:1) محلول، و75 مل من 10٪ ث/v الأمونيوم كبريتات، و10 مل من رباعي ميثيل إيثيلينديامين (TEMED) في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل وخلطه برفق دون إدخال فقاعات الهواء. صب هلام باستخدام ماصة 1 مل داخل لوحات زجاجية، وترك العليا 2 سم خالية من الخليط. إضافة الإيثانول 70٪ على الجزء العلوي من هلام فصل والسماح لواجهة حتى بين الطبقتين.
   2. بعد بلمرة من هلام فصل، وإعداد هلام التراص عن طريق الأنابيب 1.535 مل من ddH₂O، 625 مل من تريس-HCl (pH 6.8)، 12.5 مل من 20٪ (ث / v) SDS، 335 مل من 30٪ من الأكريلاميد / بيساكريلاميد (29:1) الحل، 12.5 مل من 10٪ ث / v كبريتات الأمونيوم، و 2.5 مل من TEMED. إزالة الإيثانول من المواد الهلامية فصل وإضافة محلول هلام التراص. أدخل مشطا مع العدد المطلوب من الجيوب دون إدخال فقاعات الهواء. السماح البلمرة لمدة 20-30 دقيقة.
2. تحميل 4 ميكرولتر من كل عينة وسلم البروتين في آبار منفصلة وتشغيل هلام (ق) في تريس الجليسين تشغيل العازلة (الجدول 1) في 144 V لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة: إيقاف الجل عندما الفرقة بروموفينول على وشك الهجرة من هلام.
3. وصمة عار الجل (ق) في حل فيربانكس قبل الحرب ألف (الجدول 1) لمدة 30 دقيقة على الروك.
4. Decolor الجل (ق) في حل فيربانكس قبل الحرب D (الجدول 1) حتى الخلفية المطلوبة (على سبيل المثال، بين عشية وضحاها) على الروك.

الشكل 5: فصل البروتين والتصور. يتم فصل العينات من قبل SDS-PAGE وتصورها تلطيخ Coomassie. اختصار: SDS-PAGE = الصوديوم دودسيل كبريتات البولي أكريلاميد هلام الكهربائي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6:النتائج التمثيلية لتجميع البروتين الناجم عن مضادات الميكروبات في سلالة الإشريكية القولونية COMMENSAL Escherichia MG1655 وسلالة UPEC CFT073. سلالات الإشريكية القولونية MG1655 وCFT073 نمت عند 37 درجة مئوية و300 دورة في الدقيقة إلى OD600= 0.5-0.55 في وسائط MOPS-g قبل علاجها بالتركيزات المشار إليها (-، 0 ملغم/مل؛ +، 175 ملغم/مل؛ ++، 200 ملغم/مل) من مضادات الميكروبات لمدة 45 دقيقة. تم إعداد عينات البروتين القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان كما هو موضح في البروتوكول والشكل 1والشكل 2 والشكل 3 والشكل 4 وتصور على هلام البولي أكريلاميد SDS 12٪ (الشكل 5). تم زيادة تكوين البروتين الكلي (جزء غير قابل للذوبان) في كلتا السلالات في وجود مضادات الميكروبات في حين تم تقليل كميات البروتينات القابلة للذوبان. بشكل عام، كان لمضادات الميكروبات تأثير أقوى بكثير على MG1655 مما كان عليه على CFT073. الاختصارات: M = علامة البروتين; UPEC = الإشريكية القولونية المسالك البولية؛ MOPS-g = 3-(N-morpholino) حمض البروبانسولفونيك (MOPS)-الجلوكوز; SDS = كبريتات دودسيل الصوديوم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

هنا، تم استخدام نوعين من الإشريكية القولونية يختلفان في قابليتهما للإصابة بمضادات الميكروبات المحتوية على الفضة الروثينيوم للبروتوتوكسي لإثبات هذا البروتوكول. وكشفت بيانات البقاء على قيد الحياة الأولية أن سلالة القولونية COMMENSAL E. MG1655 هي أكثر حساسية بكثير لمضادات الميكروبات المولدة ل ROS من سلالة UPEC CFT073 (البيانات غير المعروضة). وقد نمت كلتا السلالات في وسائط MOPS-g عند 37 درجة مئوية و 300 دورة في الدقيقة. وفي مرحلة منتصف السجل، تركت الخلايا إما دون علاج أو عولجت ب 175 ميكروغرام/مل و200 ميكروغرام/مل من مضادات الميكروبات، على التوالي، واحتضنت لمدة 45 دقيقة. في وقت لاحق، تم التحلل الخلايا، والمجاميع البروتين الخلوي فصلها عن البروتينات القابلة للذوبان. ثم تم فصل البروتينات في كلا الكسور من قبل SDS-PAGE وتصورها تلطيخ Coomassie. يمثل الكسر غير القابل للذوبان المبين في الشكل 6 كمية مجاميع البروتين التي تشكلت، والتي زادت عندما تم احتضان الخلايا في وجود مضادات الميكروبات مقارنة بالخلايا غير المعالجة. كانت الزيادة في تكوين البروتين الكلي مستقلة عن خلفية السلالة ، على الرغم من اكتشاف زيادة أكثر وضوحا في التكوين الكلي في السلالة الأكثر حساسية MG1655. وعلى العكس من ذلك، لوحظ انخفاض كميات البروتينات القابلة للذوبان (جزء قابل للذوبان) بعد العلاج المضاد للميكروبات للخلايا مقارنة بالنظير غير المعالج. وكانت هذه النتيجة متوقعة بالنظر إلى البيانات الأولية التي أظهرت تحملا أكبر بكثير لمضادات الميكروبات في CFT073 من MG1655.

الجدول 1: المخزن المؤقت الوسائط والحلول. وصفات للتخزين المؤقت والوسائط والحلول المستخدمة في هذا البروتوكول.

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.