وصفنا طريقة لتوليد الورم الأرومي الشبكي البشري (RB) عن طريق إدخال طفرات RB1 ثنائية الأليل في الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESC). يمكن أيضا استزراع خطوط خلايا RB بنجاح باستخدام RB المعزول في طبق.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
إعادة بناء الورم الأرومي الشبكي البشري في المختبر
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
RB البشري هو سرطان الأطفال ، وهو قاتل إذا لم يتم إعطاء أي علاج. نظرا لأن RB ينشأ من السلائف المخروطية ، وهو أمر نادر نسبيا في نماذج القوارض ، وفي الوقت نفسه فيما يتعلق بالاختلافات بين الأنواع بين البشر والقوارض ، فإن نموذج المرض المشتق من البشر أكثر فائدة للكشف عن آليات RB البشرية والبحث عن أهداف العلاج. هنا ، يصف البروتوكول توليد خطين hESC معدلين جينيا مع طفرة نقطة RB1 ثنائية الأليل (RB1 Mut / Mut) وطفرة خروج المغلوب RB1 (RB1-/-) ، على التوالي. أثناء عملية تطور الشبكية ، لوحظ تكوين RB. يتم إنشاء خطوط خلايا RB أيضا عن طريق الفصل عن عضويات RB. إجمالا ، من خلال التمييز بين خطوط hESC المحررة جينيا في عضويات الشبكية باستخدام بروتوكول التمايز المشترك 2D و 3D ، نجحنا في إعادة بناء RB البشري في طبق وحددنا أصله المخروطي. ومن شأنه أن يوفر نموذجا مرضيا مفيدا لمراقبة نشأة الورم الأرومي الشبكي وانتشاره ونموه بالإضافة إلى تطوير عوامل علاجية جديدة.
المقدمة
الورم الأرومي الشبكي البشري (RB) هو ورم نادر ومميت مشتق من السلائف المخروطية الشبكية1،2،3 ، وهو النوع الأكثر شيوعا من الأورام الخبيثة داخل العين في مرحلة الطفولة4. التعطيل متماثل الزيجوت لجين RB1 هو الآفة الجينية البادئة في RB5. ومع ذلك ، فإن الفئران ذات طفرات RB1 تفشل في تشكيل ورم الشبكية2. على الرغم من أن أورام الفئران يمكن أن تتولد مع مزيج من طفرات Rb1 والتعديلات الجينية الأخرى ، إلا أنها لا تزال تفتقر إلى ميزات RB6 البشرية. بفضل تطور التمايز العضوي في....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات المؤسسية لمستشفى بكين تونغرن ، جامعة العاصمة الطبية. يتم الحصول على H9 hESCs من معهد أبحاث WiCell.
1. جيل من RB1 hESC المتحور
- ناقل استهداف CRISPR / Cas9 للضربة القاضية (KO) ل RB1.
- تصميم زوج من sgRNA. لاستئصال RB1 ، استهدف أول إكسون من هذا الجين. تسلسل التمهيدي الأمامي هو CACCGCGGTGGCGGCCGTTTTTCGG ، وتسلسل التمهيدي العكسي هو AAACCCGAAAAAACGGCCCCCCCCGC.
ملاحظة: بالنسبة لطفرة RB1 المحددة ، يلزم أيضا قالب تم إصلاحه. في هذا البروتوكول ، يتم استخدام خط خلية RB1-KO كمثال. - اهضم 1 ميكروغرام من pX330-U6-Chimeric BB-CBh-hS....
- تصميم زوج من sgRNA. لاستئصال RB1 ، استهدف أول إكسون من هذا الجين. تسلسل التمهيدي الأمامي هو CACCGCGGTGGCGGCCGTTTTTCGG ، وتسلسل التمهيدي العكسي هو AAACCCGAAAAAACGGCCCCCCCCGC.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يتم توضيح إجراء توليد RB في الشكل 1 ، الذي يجمع بين الثقافة الملتصقة والعائمة. كان من الممكن حصاد RB البشري من RB1-KO hESC ، والحصول على خط خلية RB عن طريق عزل المواد العضوية RB.
هنا ، يوفر البروتوكول تفاصيل التمايز في مراحل مختلفة (الشكل 2). تتشكل الكرات المجوفة في أول 3 أيام والتي تلتصق بسطح الاستزراع ثم تتوسع (الشكل 2A-E). من اليوم 15 فصاعدا ، ترتفع الخلايا وتكون الثقافة معلقة.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يحدث الورم الأرومي الشبكي البشري (RB) بسبب تعطيل RB1 واختلال بروتين Rb. في هذا البروتوكول ، يعد RB1-KO hESC الخطوة المحورية لتوليد RB في طبق. بينما حتى مع RB1-/- hESC ، من الممكن عدم وجود تكوين RB بسبب طرق تمايز الشبكيةالعضوية 10. في هذا البروتوكول ، يعد الانتقال من الثقافة الملتصقة إلى الثقافة العائمة أمرا ضروريا في عملية التمايز. كثافة الخراجات ، وأنواع الخلايا الجذعية متعددة القدرات ، ومعدل الانتشار هي جميع المتغيرات التي من شأنها أن تؤثر على توقيت الانفصال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
المؤلفون ليسوا على علم بأي انتماءات أو عضويات أو تمويل أو حيازات مالية قد تؤثر على موضوعية هذه الدراسة.
شكر وتقدير
نشكر فريق 502 على كل المساعدة. يتم دعم هذا العمل جزئيا من قبل مؤسسة العلوم الطبيعية لبلدية بكين (Z200014) والبرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2017YFA0105300).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Anti-ARR3 | Sigma | HPA063129 | الأجسام |
| المضادة المضادة ل CRX (M02) | Abnove | ABN-H00001406-M02 | الأجسام المضادة |
| Anti-Ki67 | Abcam | ؛ ab15580 | الأجسام المضادة |
| المضادة ل Syk (D3Z1E) | تقنية إشارات الخلية | 13198 | الأجسام المضادة |
| BbsI | NEB | R3539S | إنزيمات التقييد |
| المتباينة (1U / mL) | تقنيات الخلايا الجذعية | 7923 | |
| DMEM الأساسية | Gibco | 10566-016 | |
| DMEM / F-12-GlutaMAX | Gibco | 10565-042 | |
| DMSO | سيجما | D2650 | |
| DPBS | Gibco | C141905005BT | |
| EDTA | Thermo | 15575020 | |
| مصل الأبقار الجنينية (FBS) ، مؤهل للصناعة البيولوجية للخلايا الجذعية الجنينية البشرية | 04-002-1A | ||
| الجلوتامين | جيبكو | 35050-061 | |
| مزيج المغذيات من لحم الخنزير F-12 (Hams F12) | جيبكو | 11765-054 | |
| محلول الأحماض الأمينية غير الأساسي MEM (100X) | Sigma | M7145 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit S | Lonza | V4XP-3032 | Nucleofection |
| Kit Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Puromycin | Gene | Operation ISY1130- 0025MG | |
| طقم تنقية QIAquick PCR | QIAGEN | 28104 | |
| ncEpic-hiPSC / hESC متوسط ثقافة | Nuwacell | RP01001 | ncEpic-hiPSC / hESC وسط ثقافة في 1.2.1 |
| عامل النمو المخفض مصفوفة الغشاء القاعدي | BD | 356231 | Matrigel في 1.2.1 |
| إنزيم تفكك الخلية | Gibco | 12563-011 | TrypLE Express في 1.2.8 |
| RNeasy Midi Kit | QIAGEN | 75144 | |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
| Supplement A | Life Technologies | 17502-048 | N-2 Supplement (100X) ، سائل ، مغطى في Medum I |
| الملحق B | Life Technologies | 17105-041 | B-27 Supplement (50X) ، سائل ، مغطى في Medum I ، II ، III |
| T4 Polynucleotide Kinase | Life Technologies | EK0032 | |
| تورين | سيجما | T-8691-25G | |
| Y-27632 2HCl | Selleck | S1049 | |
| pX330-U6- Chimeric BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro | Addgene | 42230 | |
| Nucleofector 4D | Lonza | ||
| RPMI | Sigma | R0883-500ML |
المراجع
- Liu, H., et al. Human embryonic stem cell-derived organoid retinoblastoma reveals a cancerous origin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (52), 33628-33638 (2020).
- Singh, H. P., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
