يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

5-إيثينيل-2'-Deoxyuridine/فوسفو-هيستون H3 بروتوكول وضع العلامات المزدوجة لتحليل تطور دورة الخلية في الخلايا الجذعية العصبية Drosophila

3.8K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/62642

⸱

مايو 4, 2021

 , 
1Cell Biology, University of Bern, 2Department of life sciences and medicine, University of Luxembourg

في هذه المقالة

ملخص

تحليل دورة الخلية مع 5-إيثيل-2'-deoxyuridine (EdU) وفوسفو-هيستون H3 (pH3) وضع العلامات هو إجراء متعدد الخطوات التي قد تتطلب التحسين واسعة النطاق. هنا، نقدم بروتوكول مفصل يصف جميع الخطوات لهذا الإجراء بما في ذلك تحليل الصورة وتحديد كميتها لتمييز الخلايا في مراحل دورة الخلية المختلفة.

الملخص

في الجسم الحي تحليل تطور دورة الخلية يتم إجراؤها بشكل روتيني في الدراسات على الجينات التي تنظم الانقسام وتكرار الحمض النووي. 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) وقد استخدمت للتحقيق في تطور النسخ المتماثلة / S-المرحلة, في حين استخدمت الأجسام المضادة ضد فوسفو-هيستون H3 للاحتفال نواة ميتوتيك والخلايا. ومن شأن الجمع بين كلا التسميتين أن يمكن من تصنيف مراحل G0/G1 (مرحلة الفجوة) و S (النسخ المتماثل) و M (mitotic) وأن يكون بمثابة أداة هامة لتقييم آثار الضربات المسقطة للجينات الميتوتيكية أو المسوخ الخالية على تطور دورة الخلية. ومع ذلك ، فإن الكواشف المستخدمة لوضع علامة على الخلايا الموسومة ب EdU لا تتوافق مع العديد من العلامات الثانوية الفلورية للأجسام المضادة. وهذا يعقد التثقين المناعي، حيث تستخدم الأجسام المضادة الثانوية الأولية والموسومة لوضع علامة على الخلايا الميتوتيكية الإيجابية لhH3. تصف هذه الورقة بروتوكولا تدريجيا لوضع العلامات المزدوجة ل EdU و pH3 في الخلايا الجذعية العصبية يرقات Drosophila ، وهو نظام يستخدم على نطاق واسع لدراسة العوامل الميتوتيكية. بالإضافة إلى ذلك، يتم توفير بروتوكول لتحليل الصورة وتحديد كميتها لتخصيص الخلايا المسماة في 3 فئات متميزة، G0/G1، S، S>G2/M (التقدم من S إلى G2/M)، ومراحل M.

المقدمة

وتتألف دورة تقسيم الخلية من مرحلة G1 (مرحلة الفجوة الأولى)، ومرحلة متماثلة/S، ومرحلة G2 (مرحلة الفجوة الثانية)، ومرحلة M (ميتوتيك). يمر عبر هذه المراحل, الخلية يخضع لتغيرات جذرية في النسخ الخلوي, ترجمة, وإعادة تنظيم الآلات الهيكل الخلوي1,2. استجابة للإشارات التنموية والبيئية، قد تتوقف الخلايا مؤقتا عن الانقسام وتصبح هادئة (G0) أو تفرق وتتوقف نهائيا عن تقسيم3. سيناريوهات أخرى، مثل تلف الحمض النووي، قد يسبب التمايز المبكر أو موت الخلايا المبرمج3،4. تتم الاستجابة لمثل هذه الإشارات عن طريق نقاط التفتيش دورة الخلية، والتي تعمل كنظام مراقبة لضمان سلامة العمليات الخلوية الأساسية قبل أن تلتزم الخلية إلى المرحلة التالية من دورة التقسيم5. لذلك، تحتاج الدراسات على الجينات التي تنظم تكرار الحمض النووي ونقاط التفتيش والآلات الميتوتيكية إلى تحليل عيوب تطور دورة الخلية المحتملة التي قد تحدث في الخلايا المتحولة أو عند ضربة قاضية من هذه الجينات. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذه التحليلات لاختبار الصحة العامة للخلايا وكذلك الاستجابات الخلوية للعلاج من المخدرات.

5-برومو-2'-deoxyuridine (BrdU) هو التناظرية التي يتم دمجها في الحمض النووي أثناء النسخ المتماثل6. وقد استخدمت هذه الطريقة على نطاق واسع لتحديد الخلايا في مرحلة S. ومع ذلك ، تخضع الخلايا بعد ذلك لإجراءات تشبع الحمض النووي القاسية للسماح بالكشف عن BrdU من خلال استخدام الأجسام المضادة المضادة ل BrdU6. قد يؤدي هذا العلاج القاسي إلى تلف الأسطح الخلوية ومنع المزيد من توصيف العينة من خلال التخبز المناعي. دمج EdU والكشف اللاحق من قبل النحاس الحفاز، 'انقر رد فعل' مع صغيرة، نفاذية الخلية، الأصباغ azide الموسومة فلوريا يلغي الحاجة إلى إجراءات التشبع قاسية7. ولذلك، برزت هذه الطريقة كبديل عملي أكثر لإدراج BrdU.

وعلاوة على ذلك، وقد وصفت pH3 كعلامة موثوق بها لخلايا المرحلة ميتوتيك / M8. الهستون H3 هو بروتين الهستون الأساسية المرتبطة بالحمض النووي الذي يصبح الفوسفوريلات في جميع أنحاء المرحلة المتأخرة G2 إلى مرحلة M في وقت مبكر ويتم إزالة الفوسفوريلات قرب نهاية anaphase8. يمكن استخدام العديد من الأجسام المضادة التجارية للكشف عن pH3 باستخدام بروتوكولات الاحتواء المناعي القياسية. ولذلك فإن التلطيخ المزدوج ل EdU وpH3 سيمكن من اكتشاف الخلايا في مرحلة S وكذلك في مرحلة M. بالإضافة إلى ذلك، فإن الخلايا في مرحلة G1 وG2 في وقت مبكر لا وصمة عار إيجابية لأي من علامات.

Drosophila الخلايا الجذعية العصبية أو الخلايا العصبية (NBs) تقدم نموذج الخلايا الجذعية تتميز جيدا حيث تنقسم الخلايا بشكل غير متماثل لإنتاج واحد متطابقة الذاتي تجديد NB وخلية الأم العقدة (GMC), الذي يقدر للتمايز9. بالإضافة إلى ذلك، العديد من الأدوات الوراثية والأجسام المضادة الخاصة NB جعل هذا النظام مناسبة للتلاعب الجيني والتصوير بالخلايا الحية. ونتيجة لذلك، استخدمت العديد من الدراسات NBs لدراسة الجينات التي تنظم الانقسامات غير المتماثلة وتحديد مصير الخلية9. توجد مجموعات متميزة من NBs في الدماغ المركزي (CB) والفص البصري (OL) في الدماغ اليرقات9؛ واستخدمت هيئة بناء الثقة في الدراسة الحالية. هذه اليرقات الإنستار الثالث CB NBs هي خلايا كبيرة مناسبة أيضا لدراسة العوامل التي تنظم تجميع المغزل الميتوتيكي. بروتوكول لتحليل عيوب تطور دورة الخلية سيكون أداة حيوية في مثل هذه الدراسات.

البروتوكولات التي نشرت في وقت سابق تستخدم مجموعات تجارية، مثل Click-iT EdU اليكسا فلور خلية انتشار كيت، والتي توفر العديد من مكونات التفاعل والأصباغ azide الموسومة مع مجموعة متنوعة من الأصباغ اليكسا فلور لدمج EdU والكشف10. ومع ذلك ، فإن الكواشف المزودة بهذه المجموعات غير متوافقة مع بعض العلامات الفلورية التي تستخدم في كثير من الأحيان مع الأجسام المضادة الثانوية. تم اختبار مجموعة الكشف عن EdU هذه (Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit المزودة بصبغة أزيد فلور 647-المقترنة) في Drosophila الثالثة NBs اليرقات instar ، وجرت محاولة التلطيخ المشترك مع الأجسام المضادة ضد pH3 وميراندا ، وهي علامة ل NBs. وعلاوة على ذلك، استخدمت اليكسا فلور 568- أو Cy3 الموسومة الأجسام المضادة الثانوية للكشف عن وضع العلامات ميراندا على غشاء البلازما من NBs11. ومع ذلك، لم يلاحظ شدة الإشارة المتوقعة ونمط التلطيخ (النتائج غير المنشورة) مع هذه الأجسام المضادة الثانوية عندما تم إجراء التصبغ المناعي بعد الكشف عن EdU.

بالنسبة لدمج EdU ، يتطلب البروتوكول الذي وصفه Daul وزملاؤه تغذية اليرقات مع متوسط Kankel-White مختلط مع EdU وbroophenol blue (BPB)10. تتغذى اليرقات على EdU و BPB - ارتفعت المواد الغذائية ، والتي يمكن رؤيتها بلونها الأزرق عند الابتلاع في القناة الهضمية اليرقات. على الرغم من أن هذه الطريقة كانت تستخدم لدمج EdU في Mms19 فقدان الوظيفة(Mms19P) يرقات النجوم الثالثة ، إلا أن يرقات Mms19P لم تتغذى على ما يبدو حيث لم يتم اكتشاف أي لون أزرق في الأمعاء اليرقات (نتائج غير منشورة). تظهر يرقات Mms19P تشوهات تنموية شديدة وتعتقل في نهاية المطاف في المرحلة الثالثة من النجوم. قد يؤثر هذا بطريقة أو بأخرى على سلوك التغذية ليرقات النجوم الثالثة ويجعل بروتوكول تغذية EdU غير مناسب لمثل هذه الحالات.

بعد دراسة الأدبيات المتاحة والعمل على نطاق واسع على توحيد الخطوات الأساسية ، تم اقتراح نهج بديل لوضع العلامات المزدوجة EdU/pH3 في Drosophila NBs ، والتي لا تتطلب تغذية EdU إلى اليرقات. استخدمت دراسة سابقة تلطيخ ثنائي EdU/pH3 لتحليل دورة الخلية في NBs ، ولكنها لم تقدم بروتوكولا مفصلا4. وهذا يمثل عقبة لا داعي لها للمختبرات التي تحاول تنفيذ هذه الطريقة. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يكون تقييم توافق الكواشف المختلفة مع مجموعة أدوات EdU وإجراء المزيد من التحسين عملية تستغرق وقتا طويلا. تقدم هذه الورقة بروتوكولا خطوة بخطوة يغطي دمج EdU في أدمغة اليرقات المتشرذم والتبويب المناعي بالأجسام المضادة لpH3 ، يليه المجهر الكونفوج وتحليل الصورة لتخصيص NBs لأربع فئات متميزة: مرحلة G0/G1 ، مرحلة S ، S>G2 / M (التقدم من S إلى G2 / M) ، ومرحلة M. يتم تحديد الخطوات التي تحتاج إلى التحسين والنصائح المقدمة لتحليل الصور لمجموعات البيانات الكبيرة. بالإضافة إلى ذلك، يتم تحليل قراءات EdU/pH3 في NBs البرية من النوع ومقارنة مع MMS19P NBs، والتي تم الإبلاغ عنها مؤخرا لإظهار تأخير دورة الخلية11.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد الكواشف والمخزونات للنقرة عليه EdU المقايسة

ملاحظة: راجع جدول المواد والجدول 1 للحصول على تفاصيل حول المجموعة والكواشف المزودة مع المجموعة.

  1. جلب قوارير إلى درجة حرارة الغرفة قبل إعداد الحلول.
  2. إعداد 10 MM EdU (المكون A) حل الأسهم بإضافة 2 مل من ثنائي ميثيل سلفوإكسيد (DMSO، المكون C). تخلط جيدا وتخزينها في -20 درجة مئوية.
  3. إعداد حل عمل من اليكسا فلور 647-azide (المكون B) عن طريق إضافة 70μL من DMSO (المكون C). تخلط جيدا وتخزينها في -20 درجة مئوية.
  4. إعداد حل 1x من فوق iT EdU رد فعل العازلة (العنصر D) عن طريق خلط 4 مل من هذا الحل مع 36 مل من الماء deionized. تخزين الحل المتبقي في 2-6 درجة مئوية.
  5. جعل المخزون 10x (200 ملغ / مل) من فوق- iT EdU المضافة العازلة (المكون F) عن طريق إضافة 2 مل من الماء deionized. تخلط جيدا وتخزينها في -20 درجة مئوية.
  6. تخزين Hoechst 33342 (المكون G) في 2-6 درجة مئوية. تخزين DMSO (المكون C) في مجفف عند -20 درجة مئوية.
    ملاحظة: يجب استخدام قفازات لمعالجة DMSO و Hoechst.

2. تشريح العقول اليرقات نجمة الثالثة ودمج EdU

ملاحظة: وقد وصف بروتوكول لتشريح الدماغ سابقا12. قبل البدء في التشريح، تأكد من إعداد كميات كافية من حلول EdU وPFA وذوبانها كما هو موضح في 2.6 و 3.1.

  1. إعداد 10x الفوسفات العازلة المالحة (PBS) عن طريق إضافة 25.6 غرامنا 2HPO4.7H2 0،80 ز NaCl، 2 g KCl، و 2 ز KH2PO4 إلى 1 لتر من المياه deionized. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4، وإعداد حل 1x في الماء deionized بعد ذلك.
  2. إضافة شنايدرس تشريح المتوسطة (SM) إلى اثنين من المنخفضات المتتالية من الزجاج (3 أو 9) لوحة بقعة الزجاج الاكتئاب. إضافة 1x برنامج تلفزيوني للاكتئاب على التوالي المقبل.
  3. باستخدام زوج من ملقط، واختيار تجول يرقات نجمة الثالثة ومكان على الأنسجة مبللة مع برنامج تلفزيوني لتنظيف بقايا الطعام يطير. ضع اليرقة في الاكتئاب مع برنامج تلفزيوني ثم في الاكتئاب المتتالي مع SM.
  4. باستخدام زوج من ملقط ناعم ، قم بإزالة3/4 من الجزء السفلي من جسم اليرقة.
    1. أمسك بخطافات الفم اليرقة برفق مع زوج واحد من ملقط ، وأمسك بالقطعة في الطرف الآخر مع الزوج الآخر من ملقط.
    2. بدوره رأس اليرقات من الداخل الى الخارج عن طريق دفع الداخل خطاطيف الفم وتقشير في وقت واحد قبالة الأنسجة في الطرف الآخر.
  5. مراقبة الدماغ اليرقات مع أقراص التصوير المرفقة. إزالة الأنسجة الأخرى المرتبطة الدماغ، ونقل الدماغ إلى الاكتئاب على التوالي المقبل مع SM.
  6. قم بإذابة حل مخزون EDU 10 mM. إعداد حل 100 ميكرومتر عن طريق تخفيف هذا المخزون 10 mM في SM.
  7. إضافة 100 ميكرولتر من هذا الحل EDU + SM 100 ميكرومتر في الاكتئاب آخر على لوحة Pyrex. احتضان ~ 5-10 تشريح العقول في 100 ميكرولتر من 100 μM EdU + SM حل لمدة 2 ساعة في 25 درجة مئوية.
    ملاحظة: كما NBs تقسيم مرة واحدة في ~ 2 ساعة، ويهدف هذا البروتوكول لتحليل دورة خلية واحدة كاملة. فقط استخدام العقول سليمة لمزيد من الخطوات. تجاهل الأدمغة التالفة أثناء التشريح.

3. التثبيت و المناعة

  1. إعداد محلول paraformaldehydede (PFA) بنسبة 4٪ في غطاء الدخان.
    1. إضافة 4 غرام من مسحوق بارافورمالدهيد إلى 80 مل من برنامج تلفزيوني 1x في كوب وضعت على ستيرر المغناطيسي والحرارة إلى 60 درجة مئوية. لإذابة PFA، أضف بضع قطرات من 1 N NaOH. تحقق من درجة الحموضة، وضبط إلى 7.0 مع بضع قطرات من 1 M HCl إذا لزم الأمر.
    2. ضبط مستوى الصوت إلى 100 مل مع برنامج تلفزيوني 1x. Aliquot الحل PFA وتخزينها في 2-6 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 شهر. أضف 0.3٪ من المنظفات غير الأيونية (انظر جدول المواد)إلى محلول PFA لتثبيت فعال للأنسجة الكبيرة مثل دماغ اليرقات.
  2. بعد دمج EdU، نقل الأدمغة إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيق 0.6 مل التي تحتوي على 4٪ PFA. احتضان في درجة حرارة الغرفة على نوتاتور لمدة 15 دقيقة. اضغط على الأنبوب الموجود على مقاعد البدلاء في المختبر حتى تستقر الأدمغة في أسفل الأنبوب.
  3. إزالة PFA وغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني + 0.3٪ المنظفات غير الأيونية (PBST) في درجة حرارة الغرفة. تأكد من أن كل غسل يدوم لمدة 10 دقائق على الأقل على نوتاتور. بعد غسل الماضي، وإزالة PBST، إضافة حل حجب (PBST + 5٪ ألبوم مصل البقر)، واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  4. تمييع الأجسام المضادة ميراندا (1:250) والأجسام المضادة لpH3 (1:200) في PBST (كلا الأجسام المضادة في نفس الأنبوب). إزالة المخزن المؤقت حظر وإضافة الحل الأساسي للأجسام المضادة. حضانة بين عشية وضحاها في 2-6 درجة مئوية على نوتاتور.
    ملاحظة: ميراندا هو بروتين غشاء موجود على CB NBs. وهو يعمل على تحديد هذه الخلايا المستديرة الكبيرة في منطقة CB13.
  5. إزالة الحل الأساسي للأجسام المضادة وغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني. تأكد من أن كل غسل يدوم لمدة 10 دقائق على نوتاتور في درجة حرارة الغرفة.
  6. إعداد حل الأجسام المضادة الثانوية عن طريق إضافة 1:500 المخفف اليكسا فلور 488 المضادة الأرنب واليكسا فلور 568 المضادة للفئران في PBST. إزالة برنامج تلفزيوني، وإضافة حل الأجسام المضادة الثانوية إلى العقول تشريح. حضانة بين عشية وضحاها في 2-6 درجة مئوية في الظلام، على نوتاتور، ويغسل 3 مرات مع PBST (الخطوة 3.5).

4. الكشف عن وحدة EDU، تلطيخ الحمض النووي، وتصاعد

  1. لإعداد كوكتيل الكشف عن EdU، اخلط المكونات (انظر الجدول 2)في أنبوب سعة 1.5 مل.
  2. بعد غسل الماضي (الخطوة 3.6)، وإزالة PBST، وإضافة كوكتيل الكشف EdU إلى العقول تشريح. احتضان في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 30 دقيقة على نوتاتور. غسل 2 مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة لكل منهما، في الظلام.
  3. لتلطيخ الحمض النووي، تمييع Hoechst 33342 (المكون G) 1:2،000 في برنامج تلفزيوني لإعداد محلول 5 ميكروغرام / مل.
  4. إزالة PBST بعد غسل الثاني (الخطوة 4.2)، وإضافة 500 ميكرولتر من محلول Hoechst 5 ميكروغرام / مل إلى العقول تشريح. احتضان في الظلام لمدة 10 دقيقة. إزالة Hoechst، ويغسل مرة واحدة مع PBST لمدة 10 دقيقة.
  5. اضغط على الأنبوب على مقاعد البدلاء المختبر، والسماح للأدمغة يستقر. إزالة برنامج تلفزيوني من الأنبوب، ولكن ترك وراءه فقط 50-100 ميكرولتر.
  6. قطع نهاية طرف ميكروبايت 200 ميكروبايت، ونقل بعناية العقول على شريحة زجاجية نظيفة. إزالة برنامج تلفزيوني الزائدة من الشريحة عن طريق النشاف مع شرائط ورقة التصفية. يجب الحرص على عدم السماح للتصفية ورقة تلمس العقول.
  7. وضع قطرة من الماء للذوبان، غير الفلورية تصاعد المتوسطة على العقول، وتوجيه العقول بحيث الحبل العصبي البطني يواجه الشريحة، والفص مواجهة صعودا. ترتيب العقول في ملف واحد بحيث يكون من الأسهل لتصوير العقول بشكل متسلسل.
  8. ضع بلطف غطاء على رأس الأدمغة. ضع الشريحة عند 2-6 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: يصلب المتوسط المتصاعد عند التخزين بين عشية وضحاها بحيث لا تكون هناك حاجة لختم الغطاء بطلاء الأظافر.

5. التصوير

ملاحظة: راجع جدول المواد للحصول على تفاصيل حول المجهر المسح بالليزر وهدف الغمر الزيت المستخدمة في هذا البروتوكول.

  1. من برنامج الاستحواذ، حدد الهدف 63x.
  2. وضع قطرة من زيت الغمر على غطاء فوق العقول التي شنت فقط لجعله أسهل لتحديد موقع الأنسجة من خلال العدسة.
  3. باستخدام قناة DAPI / Hoechst 33342 ، ابحث عن الدماغ من خلال العدسة ، ثم انتقل إلى وضع الاستحواذ في البرنامج.
  4. قم بإعداد 4 قنوات لتصوير Hoechst 33342 (DNA) وأليكسا فلور 488 (pH3) وأليكسا فلور 568 (ميراندا) وأليكسا فلور 647 (EdU). استخدم أداة مساعد الصبغة، التي تقوم تلقائيا بإعداد ليزر الإثارة ومرشحات الانبعاثات للأصباغ المختارة.
  5. تعيين مجال الرؤية بحيث يشمل فص الدماغ بأكمله. صورة الحجم الكامل لفص الدماغ عن طريق الحصول على z-مداخن متباعدة 0.8 ميكرومتر عن بعضها البعض. تخزين كافة الصور من جلسة تصوير بتنسيق مكتبة *.lif.

6. تحليل الصور

ملاحظة: تصف الخطوات التالية تحليل الصور المكتسبة وكيفية فرز الخلايا إلى مرحلة G0/G1، ومرحلة S، وS>G2/M (التقدم من S إلى G2/M)، ومرحلة M باستخدام برنامج ImageJ.

  1. تحميل فيجي (فيجي هو ImageJ) من URL التالي: https://fiji.sc/. فتح فيجي، ثم اسحب وأسقط ملفات .lif في فيجي.
    ملاحظة: فيجي هو نسخة من ImageJ التي تأتي مثبتة مسبقا مع العديد من الإضافات14. سيؤدي نقل ملفات .lif إلى فيجي إلى فتح المكون الإضافي للتنسيقات الحيوية ، وهو أمر ضروري لمعالجة ملفات .lif. مطلوب أيضا المكونات الإضافية تنسيقات الحيوية لفتح ملفات الصور التي تم إنشاؤها من بعض العلامات التجارية المجهر الأخرى، على سبيل المثال، nd2 الملفات التي تم إنشاؤها من المجهر نيكون. يأتي هذا البرنامج المساعد مثبتة مسبقا مع فيجي.
  2. حدد مستعرض البيانات من علامة التبويب عرض المكدس، واستخدم المكدس الظاهري من علامة التبويب إدارة الذاكرة في المكون الإضافي للتنسيقات الحيوية.
    ملاحظة: ملفات Lif مع z-stacks من 8-10 العقول غالبا ما تكون 300-400 ميغابايت في الحجم. على أجهزة الكمبيوتر ذات ذاكرة الوصول العشوائي منخفضة، فتح عدد قليل من هذه الملفات يمكن أن تستنفد بسرعة ذاكرة الوصول العشوائي المتاحة على ImageJ ومنع أي معالجة الصور الأخرى. المكدس الظاهري هو "للقراءة فقط"، ولا يحتاج إلى ذاكرة وصول عشوائي عالية للمعالجة، وهو خيار مثالي لتحميل مجموعات البيانات الكبيرة على فيجي.
  3. مراقبة الصورة متعددة القنوات المعروضة في ImageJ. تغيير لون القنوات من شريط القوائم باستخدام أداة قنوات | | الصور. مراقبة NBs ميراندا المسمى كخلايا مستديرة كبيرة في منطقة CB.
  4. رسم منطقة الاهتمام (ROI) باستخدام أداة القطع الناقص على كل NB لتجنب عد NB مرتين.
    1. من شريط القائمة ImageJ، حدد تحليل أدوات | | مدير عائد الاستثمار. وضع علامة على كافة NBs في المقطع z الحالي، ثم اضغط t بعد وضع علامة على كل خلية.
  5. مرة واحدة يتم وضع علامة على جميع NBs في المقطع z الحالي، وتغيير القنوات إلى pH3 وEdU، وتحسب يدويا عدد NBs إيجابية EdU، NBs إيجابية الرقم 3، NBs تلطيخ إيجابي لكل من EdU وpH3، وNBs لا تلطيخ لكلا العلامات.
  6. ابحث عن NBs في المقاطع z اللاحقة، واحذف ROIs القديمة، وأضف ROIs جديدة لحساب NBs في مداخن مختلفة.
  7. إعداد جدول بيانات مع الأعمدة التالية: 1. EdU-pH3-: يمثل هذا المقطع الخلايا السالبة المزدوجة الموجودة في مرحلة G0/G1 من دورة الخلية; 2. EdU +: أدرجت الخلايا في هذه الفئة EdU وتخضع لتكرار الحمض النووي (S-المرحلة)؛ 3. EdU + pH3 +: أكملت هذه الخلايا ثنائية الإيجابية مرحلة S وتقدمت إلى مرحلة G2 أو M؛ 4. الرقم 3 +: هذه NBs تخضع للإصابة بالداء المتلازمي.
  8. حساب النسب المئوية من NBs موجودة في جميع الفئات 4 أعلاه لكل فص. قم بإعداد رسم بياني شريطي باستخدام برنامج جدول البيانات الذي يعرض البيانات المجمعة للحصول على نسب مئوية من NBs في كل فئة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وقد استخدمت ثنائي الفصوص Drosophila الدماغ اليرقات نجمة الثالثة كنظام نموذجيلدراسةالعمليات الخلوية والإنمائية الأساسية 9 . وكان محور الدراسة الحالية لتقديم بروتوكول لتحليل تطور دورة الخلية في EDU- وHH3 المسمى NBs من منطقة CB (الشكل 1). وينقسم البنك المركزي إلى نوعين فرعيين هما النوع الأول والثاني، ويعرضان نمط التقسيم غير المتماثل المميز9. كل نوع I NB شعبة يولد NB، التي هي قادرة على التجديد الذاتي، وآخر GMC التي يقدر للتمايز

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

إدراج EdU ورد الفعل اللاحق "انقر فوق" مع azide نفاذية الخلية يقدم مزايا عملية لهذه التقنية على طريقة BrdU المستخدمة في وقت سابق7. ومع ذلك ، يتم تحفيز رد الفعل هذا من قبل أيونات Cu(I) ، وقد تكون العديد من الأصباغ غير مستقرة في وجود هذا المحفز النحاسي ، كما ينصح بوضوح مصنع مجموعة Click-it EdU. عندما تم إجراء تجارب التثبيط المناعي بعد تنفيذ خطوة الكشف عن EdU ، لم يتم ملاحظة كثافة الإشارة المتوقعة مع صبغات القناة الحمراء ، أليكسا فلور 568 و Cy3. ومع ذلك ، عمل البروتوكول عندما تم الانتهاء من ردود الفعل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وقد أعلن صاحبا البلاغ أنه لا توجد مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

وقد دعم هذا العمل بتمويل من المؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم (منحة المشروع 31003A_173188؛ www.snf.ch) وجامعة برن (www.unibe.ch) إلى بكالوريوس العلوم. لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة، وجمع البيانات، والتحليل، وقرار نشر المخطوطة، أو إعدادها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
fly stocks
P{EPgy2}Mms19EY00797/TM3, Sb1 Ser1 (Mms19p)Bloomington stock center#15477P-element insertion in third exon of Mms19
 +; Mms19 :: eGFP ، Mms19pتم إنشاؤه في المنزلeGFP يحمل علامة بروتين Mms19 معبرا عنه في خلفية Mms19p
w1118< / sup>مخزون بلومنجتون# 3605مخزون من النوع البري (ث ؛ + ؛ +)
الأجسامتخفيف
الفئران المضادة لميرانداAbcamAb1977881/250
إشارات خلية الأرنب المضادة للأرقم الهيدروجيني 397011/200
<قوي > الأجسام المضادة الثانوية < / قوي >
الماعز المضاد للفئران Cy3جاكسون إيمون112-165-1671/150
الماعز المضاد للفئران Alexa Fluor 568InvitrogenA110771/500
الماعز المضاد للأرانب Alexa Fluor 488InvitrogenA270341/500
Reagent / Kit< / قوي>
Aqua Poly / Mount mount mount mediumPolysciences Inc18606-20
Click-it EdU incorporation kit ، Alexa Flour 647Thermo Fischer ScientificC10340
Schneider ' s ذبابة الفاكهة المتوسطةThermo Fischer Scientific21720-024
جزء ألبومين مصل الأبقار (BSA) VMerck10735078001
Triton X-100Fischer Scientific9002-93-1منظف غير أيوني
<قوي>Software
Fiji (Imagej)https://imagej.net/Fiji
مجموعة تطبيقات Leica (LAS X)برنامج لوحة الرسم البياني للأنظمة
الإصدار 5
مايكروسوفت إكسلمايكروسوفت أوفيس2016
<قوي>المعدات
Leica TCS SP8 مجهر متحد البؤر للمسح الضوئي بالليزر مع غمر بالزيت 63x، هدف 1.4 خطة NA
<قوي>المواد< / قوي>
أكوا بولي / جبل تصاعد متوسطللذوبان في الماء ، غير فلوري تصاعد
متوسط بيركس 3 أو 9 لوحة بقعة
ورق ترشيح
مركز المضادة الأولية الدقيقة من لايكا قابل زجاجية الاكتئاب واتمان

المراجع

  1. Harashima, H., Dissmeyer, N., Schnittger, A. Cell cycle control across the eukaryotic kingdom. Trends in Cell Biology. 23 (7), 345-356 (2013).
  2. Vermeulen, K., Van Bockstaele, D. R., Berneman, Z. N. The cell cycle: a review of regulation, deregulation and therapeutic targets in cancer. Cell Proliferation. 36 (3), 131-149 (2003).
  3. Pardee, A. B. A restriction point for control of normal animal cell proliferation. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 71 (4), 1286-1290 (1974).
  4. Gogendeau, D., et al. Aneuploidy causes premature differentiation of neural and intestinal stem cells. Nature Communications. 6, 8894(2015).
  5. Barnum, K. J., O'Connell, M. J. Cell cycle regulation by checkpoints. Methods in Molecular Biology. 1170, 29-40 (2014).
  6. Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218 (4571), 474-475 (1982).
  7. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  8. Kim, J. Y., et al. The value of phosphohistone H3 as a proliferation marker for evaluating invasive breast cancers: A comparative study with Ki67. Oncotarget. 8 (39), 65064-65076 (2017).
  9. Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).
  10. Daul, A. L., Komori, H., Lee, C. Y. EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) labeling of Drosophila mitotic neuroblasts. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (7), 5461(2010).
  11. Chippalkatti, R., Egger, B., Suter, B. Mms19 promotes spindle microtubule assembly in Drosophila neural stem cells. PLoS Genetics. 16, 1008913(2020).
  12. Daul, A. L., Komori, H., Lee, C. Y. Immunofluorescent staining of Drosophila larval brain tissue. Cold Spring Harbor Protocols. (7), (2010).
  13. Mollinari, C., Lange, B., Gonzalez, C. Miranda, a protein involved in neuroblast asymmetric division, is associated with embryonic centrosomes of Drosophila melanogaster. Biology of the Cell. 94 (1), 1-13 (2002).
  14. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  15. Nag, R. N., Niggli, S., Sousa-Guimaraes, S., Vazquez-Pianzola, P., Suter, B. Mms19 is a mitotic gene that permits Cdk7 to be fully active as a Cdk-activating kinase. Development. 145 (2), (2018).
  16. Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), (2013).
  17. Hartenstein, V., Spindler, S., Pereanu, W., Fung, S. The development of the Drosophila larval brain. Advances in Experimental Medicine and Biology. 628, 1-31 (2008).
  18. Hebar, A., Rutgen, B. C., Selzer, E. NVX-412, a new oncology drug candidate, induces S-phase arrest and DNA damage in cancer cells in a p53-independent manner. PLoS One. 7, 45015(2012).
  19. Wyllie, F. S., et al. S phase cell-cycle arrest following DNA damage is independent of the p53/p21(WAF1) signalling pathway. Oncogene. 12 (5), 1077-1082 (1996).
  20. Xu, X., et al. Inhibition of DNA replication and induction of S phase cell cycle arrest by G-rich oligonucleotides. Journal of Biological Chemistry. 276 (46), 43221-43230 (2001).
  21. Duronio, R. J. Developing S-phase control. Genes & Development. 26 (8), 746-750 (2012).
  22. Turrero Garcia, M., Chang, Y., Arai, Y., Huttner, W. B. S-phase duration is the main target of cell cycle regulation in neural progenitors of developing ferret neocortex. Journal of Comparative Neurology. 524 (3), 456-470 (2016).
  23. Pereira, P. D., et al. Quantification of cell cycle kinetics by EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine)-coupled-fluorescence-intensity analysis. Oncotarget. 8 (25), 40514-40532 (2017).
  24. Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
  25. Zielke, N., et al. Fly-FUCCI: A versatile tool for studying cell proliferation in complex tissues. Cell Reports. 7 (2), 588-598 (2014).
  26. Shen, Y., Vignali, P., Wang, R. Rapid profiling cell cycle by flow cytometry using concurrent staining of DNA and mitotic markers. Bio-protocol. 7 (16), 2517(2017).
  27. Berger, C., et al. FACS purification and transcriptome analysis of drosophila neural stem cells reveals a role for Klumpfuss in self-renewal. Cell Reports. 2 (2), 407-418 (2012).
  28. Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing. Nature Protocols. 8 (6), 1088-1099 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

EdU Fiji DNA
5-إيثينيل-2'-Deoxyuridine/فوسفو-هيستون H3 بروتوكول وضع العلامات المزدوجة لتحليل تطور دورة الخلية في الخلايا الجذعية العصبية Drosophila
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.