تحليل دورة الخلية مع 5-إيثيل-2'-deoxyuridine (EdU) وفوسفو-هيستون H3 (pH3) وضع العلامات هو إجراء متعدد الخطوات التي قد تتطلب التحسين واسعة النطاق. هنا، نقدم بروتوكول مفصل يصف جميع الخطوات لهذا الإجراء بما في ذلك تحليل الصورة وتحديد كميتها لتمييز الخلايا في مراحل دورة الخلية المختلفة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
5-إيثينيل-2'-Deoxyuridine/فوسفو-هيستون H3 بروتوكول وضع العلامات المزدوجة لتحليل تطور دورة الخلية في الخلايا الجذعية العصبية Drosophila
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
في الجسم الحي تحليل تطور دورة الخلية يتم إجراؤها بشكل روتيني في الدراسات على الجينات التي تنظم الانقسام وتكرار الحمض النووي. 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) وقد استخدمت للتحقيق في تطور النسخ المتماثلة / S-المرحلة, في حين استخدمت الأجسام المضادة ضد فوسفو-هيستون H3 للاحتفال نواة ميتوتيك والخلايا. ومن شأن الجمع بين كلا التسميتين أن يمكن من تصنيف مراحل G0/G1 (مرحلة الفجوة) و S (النسخ المتماثل) و M (mitotic) وأن يكون بمثابة أداة هامة لتقييم آثار الضربات المسقطة للجينات الميتوتيكية أو المسوخ الخالية على تطور دورة الخلية. ومع ذلك ، فإن الكواشف المستخدمة لوضع علامة على الخلايا الموسومة ب EdU لا تتوافق مع العديد من العلامات الثانوية الفلورية للأجسام المضادة. وهذا يعقد التثقين المناعي، حيث تستخدم الأجسام المضادة الثانوية الأولية والموسومة لوضع علامة على الخلايا الميتوتيكية الإيجابية لhH3. تصف هذه الورقة بروتوكولا تدريجيا لوضع العلامات المزدوجة ل EdU و pH3 في الخلايا الجذعية العصبية يرقات Drosophila ، وهو نظام يستخدم على نطاق واسع لدراسة العوامل الميتوتيكية. بالإضافة إلى ذلك، يتم توفير بروتوكول لتحليل الصورة وتحديد كميتها لتخصيص الخلايا المسماة في 3 فئات متميزة، G0/G1، S، S>G2/M (التقدم من S إلى G2/M)، ومراحل M.
المقدمة
وتتألف دورة تقسيم الخلية من مرحلة G1 (مرحلة الفجوة الأولى)، ومرحلة متماثلة/S، ومرحلة G2 (مرحلة الفجوة الثانية)، ومرحلة M (ميتوتيك). يمر عبر هذه المراحل, الخلية يخضع لتغيرات جذرية في النسخ الخلوي, ترجمة, وإعادة تنظيم الآلات الهيكل الخلوي1,2. استجابة للإشارات التنموية والبيئية، قد تتوقف الخلايا مؤقتا عن الانقسام وتصبح هادئة (G0) أو تفرق وتتوقف نهائيا عن تقسيم3. سيناريوهات أخرى، مثل تلف الحمض النووي، قد يسبب التمايز المبكر أو موت الخلايا المبرمج3،4. تتم الاستجابة لمثل هذه الإشارات عن طريق نقاط التفتيش دورة الخلية، والتي تعمل كنظام ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد الكواشف والمخزونات للنقرة عليه EdU المقايسة
ملاحظة: راجع جدول المواد والجدول 1 للحصول على تفاصيل حول المجموعة والكواشف المزودة مع المجموعة.
- جلب قوارير إلى درجة حرارة الغرفة قبل إعداد الحلول.
- إعداد 10 MM EdU (المكون A) حل الأسهم بإضافة 2 مل من ثنائي ميثيل سلفوإكسيد (DMSO، المكون C). تخلط جيدا وتخزينها في -20 درجة مئوية.
- إعداد حل عمل من اليكسا فلور 647-azide (المكون B) عن طريق إضافة 70μL من DMSO (المكون C). تخلط جيدا وتخزينها في -20 درجة مئوية.
- إعداد حل 1x من فوق iT EdU رد فعل العازلة (العنصر D) عن طريق خلط 4 مل من هذا الحل مع 36 مل من الماء deionized. تخزين ال....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
وقد استخدمت ثنائي الفصوص Drosophila الدماغ اليرقات نجمة الثالثة كنظام نموذجيلدراسةالعمليات الخلوية والإنمائية الأساسية 9 . وكان محور الدراسة الحالية لتقديم بروتوكول لتحليل تطور دورة الخلية في EDU- وHH3 المسمى NBs من منطقة CB (الشكل 1). وينقسم البنك المركزي إلى نوعين فرعيين هما النوع الأول والثاني، ويعرضان نمط التقسيم غير المتماثل المميز9. كل نوع I NB شعبة يولد NB، التي هي قادرة على التجديد الذاتي، وآخر GMC التي يقدر للتمايز
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
إدراج EdU ورد الفعل اللاحق "انقر فوق" مع azide نفاذية الخلية يقدم مزايا عملية لهذه التقنية على طريقة BrdU المستخدمة في وقت سابق7. ومع ذلك ، يتم تحفيز رد الفعل هذا من قبل أيونات Cu(I) ، وقد تكون العديد من الأصباغ غير مستقرة في وجود هذا المحفز النحاسي ، كما ينصح بوضوح مصنع مجموعة Click-it EdU. عندما تم إجراء تجارب التثبيط المناعي بعد تنفيذ خطوة الكشف عن EdU ، لم يتم ملاحظة كثافة الإشارة المتوقعة مع صبغات القناة الحمراء ، أليكسا فلور 568 و Cy3. ومع ذلك ، عمل البروتوكول عندما تم الانتهاء من ردود الفعل.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وقد أعلن صاحبا البلاغ أنه لا توجد مصالح متنافسة.
شكر وتقدير
وقد دعم هذا العمل بتمويل من المؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم (منحة المشروع 31003A_173188؛ www.snf.ch) وجامعة برن (www.unibe.ch) إلى بكالوريوس العلوم. لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة، وجمع البيانات، والتحليل، وقرار نشر المخطوطة، أو إعدادها.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| fly stocks | |||
| P{EPgy2}Mms19EY00797/TM3, Sb1 Ser1 (Mms19p) | Bloomington stock center | #15477 | P-element insertion in third exon of Mms19 |
| +; Mms19 :: eGFP ، Mms19p | تم إنشاؤه في المنزل | eGFP يحمل علامة بروتين Mms19 معبرا عنه في خلفية Mms19p | |
| w1118< / sup> | مخزون بلومنجتون | # 3605 | مخزون من النوع البري (ث ؛ + ؛ +) |
| الأجسام | تخفيف | ||
| الفئران المضادة لميراندا | Abcam | Ab197788 | 1/250 |
| إشارات خلية الأرنب المضادة للأرقم الهيدروجيني 3 | 9701 | 1/200 | |
| <قوي > الأجسام المضادة الثانوية < / قوي > | |||
| الماعز المضاد للفئران Cy3 | جاكسون إيمون | 112-165-167 | 1/150 |
| الماعز المضاد للفئران Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11077 | 1/500 |
| الماعز المضاد للأرانب Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A27034 | 1/500 |
| Reagent / Kit< / قوي> | |||
| Aqua Poly / Mount mount mount medium | Polysciences Inc | 18606-20 | |
| Click-it EdU incorporation kit ، Alexa Flour 647 | Thermo Fischer Scientific | C10340 | |
| Schneider ' s ذبابة الفاكهة المتوسطة | Thermo Fischer Scientific | 21720-024 | |
| جزء ألبومين مصل الأبقار (BSA) V | Merck | 10735078001 | |
| Triton X-100 | Fischer Scientific | 9002-93-1 | منظف غير أيوني |
| <قوي>Software | |||
| Fiji (Imagej) | https://imagej.net/Fiji | ||
| مجموعة تطبيقات Leica (LAS X) | برنامج لوحة الرسم البياني للأنظمة | ||
| الإصدار 5 | |||
| مايكروسوفت إكسل | مايكروسوفت أوفيس | 2016 | |
| <قوي>المعدات | |||
| Leica TCS SP8 مجهر متحد البؤر للمسح الضوئي بالليزر مع غمر بالزيت 63x، هدف 1.4 خطة NA | |||
| <قوي>المواد< / قوي> | |||
| أكوا بولي / جبل تصاعد متوسط | للذوبان في الماء ، غير فلوري تصاعد | ||
| متوسط بيركس 3 أو 9 لوحة بقعة | |||
| ورق ترشيح |
المراجع
- Harashima, H., Dissmeyer, N., Schnittger, A. Cell cycle control across the eukaryotic kingdom. Trends in Cell Biology. 23 (7), 345-356 (2013).
- Vermeulen, K., Van Bockstaele, D. R., Berneman, Z. N. The cell cycle: a review of regulation, deregulation and therapeut....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
