مقالة منهجية

في المختبر تقييم إعادة برمجة القلب عن طريق قياس تدفق الكالسيوم القلب محددة مع مراسل GCaMP3

DOI:

10.3791/62643

⸱

فبراير 22, 2022

 ,  , 
1Department of Cardiac Surgery, Cardiovascular Center, The University of Michigan, Ann Arbor, 2Department of Cardiovascular Medicine, Xiangya Hospital, Central South University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن نصف هنا، إنشاء وتطبيق TG (Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38 (CAG-GCaMP3)Hze/J (يشار إليه باسم αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 أدناه) خط مراسل الماوس لتقييم إعادة برمجة القلب. يتم تحويل الخلايا الليفية القلبية الوليدية (NCFs) المعزولة عن سلالة الماوس إلى خلايا قلبية مستحثة (iCMs) ، مما يسمح بتقييم مناسب وفعال لكفاءة إعادة البرمجة والنضج الوظيفي ل iCMs عن طريق تدفق الكالسيوم (Ca2+).

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أصبحت إعادة برمجة القلب علاجا واعدا لإصلاح القلب التالف. من خلال إدخال عوامل نسخ متعددة ، بما في ذلك Mef2c ، Gata4 ، Tbx5 (MGT) ، يمكن إعادة برمجة الخلايا الليفية في خلايا القلب المستحثة (iCMs). هذه iCMs، عندما ولدت في الموقع في قلب متشح، ودمج كهربائيا وميكانيا مع عضلة القلب المحيطة بها، مما يؤدي إلى انخفاض في حجم ندبة وتحسين في وظيفة القلب. ونظرا للانخفاض النسبي في كفاءة إعادة البرمجة ونقاوتها وجودتها، فإن توصيف الأجهزة iCMs يظل تحديا. تركز الأساليب المستخدمة حاليا في هذا المجال، بما في ذلك قياس التدفق الخلوي والكيمياء المناعية وqPCR، بشكل رئيسي على التعبير الجيني والبروتيني الخاص بالقلب ولكن ليس على النضج الوظيفي ل iCMs. يؤدي فتح قنوات الكالسيوم ذات بوابات الجهد في خلايا القلب إلى تدفق سريع للكالسيوم إلى الخلية بسبب إمكانات العمل. لذلك ، فإن تحديد معدل تدفق الكالسيوم هو طريقة واعدة لتقييم وظيفة القلب. هنا، يقدم البروتوكول طريقة لتقييم وظيفة iCM عن طريق تدفق الكالسيوم (Ca2+). تم تأسيس سلالة ماوس αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 من خلال عبور Tg (Myh6-cre)1Jmk/J (يشار إليه باسم Myh6-Cre أدناه) مع Gt(ROSA)26Sortm38 (CAG-GCaMP3)Hze/J (يشار إليها باسم Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 أدناه) الفئران. تم عزل الخلايا الليفية القلبية الوليدية (NCFs) من فئران حديثي الولادة P0-P2 واستزراعها في المختبر ، وتم إدخال بناء متعدد الحسابات ل MGT إلى NCFs ، مما أدى إلى إعادة برمجتها إلى iCMs. لأن فقط إعادة برمجة iCMs بنجاح سوف تعبر عن مراسل GCaMP3، يمكن تقييم النضج الوظيفي لل iCMs بصريا من خلال تدفق Ca2+ مع المجهر الفلوري. وبالمقارنة مع الصناديق غير المبرمجة، أظهرت NCF-iCMs تدفقا عابرا كبيرا للكالسيوم وانكماشا عفويا، على غرار CMs. يصف هذا البروتوكول بالتفصيل إنشاء سلالة الماوس وعزل واختيار قلوب الفئران الوليدية وعزلة NCF وإنتاج الفيروس الرجعية لإعادة برمجة القلب ، وحث iCM ، وتقييم تدفق iCM Ca2 + باستخدام خط المراسل الخاص بنا ، والتحليل الإحصائي ذي الصلة وعرض البيانات. ومن المتوقع أن توفر الأساليب الموصوفة هنا منصة قيمة لتقييم النضج الوظيفي ل iCMs لدراسات إعادة برمجة القلب.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

احتشاء عضلة القلب (MI) هو مرض شديد في جميع أنحاء العالم. أمراض القلب والأوعية الدموية (CVDs) هي السبب الرئيسي للوفاة في جميع أنحاء العالم وتسبب ما يقرب من 18.6 مليون حالة وفاة في عام 20191،2. وقد انخفض مجموع الوفيات الناجمة عن الأمراض القلبية الوعائية خلال نصف القرن الماضي. ومع ذلك، تباطأ هذا الاتجاه أو حتى انعكس في بعض البلدان غير المتطورة1، مما يدعو إلى علاجات أكثر فعالية للأمراض القلبية الوعائية. باعتبارها واحدة من المظاهر القاتلة للأمراض القلبية الوعائية، يمثل MI حوالي نصف جميع الوفيات المنسوبة إلى الأمراض القلبية الوعائية في الولايات المتحدة2. خلال نقص التروية ، مع انسداد الشرايين التاجية والعرض المحدود لكل من العناصر الغذائية والأوكسجين ، يعاني عضلة القلب من تغيرات استقلابية حادة ، ويضعف الوظيفة الانقباضية لخلايا القلب (CMs) ، ويؤدي إلى موت CM3. وقد تم استكشاف العديد من النهج في أبحاث القلب والأوعية الدموية لإصلاح إصابة القلب واستعادة وظيفة القلب المصاب4. ظهرت إعادة برمجة القلب المباشرة كاستراتيجية واعدة لإصلاح القلب التالف واستعادة وظيفته5،6. من خلال إدخال Mef2c، Gata4، Tbx5 (MGT)، يمكن إعادة برمجة الخلايا الليفية إلى iCMs في المختبر وفي الجسم الحي، ويمكن لتلك iCMs تقليل منطقة ندبة وتحسين وظيفة القلب7،8.

على الرغم من أن إعادة برمجة القلب هي استراتيجية واعدة لعلاج MI ، لا يزال هناك عدد من التحديات. أولا، كفاءة إعادة البرمجة، والنقاء، والجودة ليست دائما عالية كما هو متوقع. يمكن أن يحقق إغراء MGT 8.4٪ فقط (cTnT+) أو 24.7٪ (αMHC-GFP+) من إجمالي CFs التي سيتم إعادة برمجتها على iCMs في المختبر7 ، أو ما يصل إلى 35٪ في vivo8 ، مما يحد من تطبيقها. حتى مع وجود المزيد من العوامل المستحثة في النظام ، مثل Hand29 أو Akt1 /PKB10 ، فإن كفاءة إعادة البرمجة لا تزال مرضية بالكاد لاستخدامها في بيئة سريرية. ومن ثم، يلزم إجراء المزيد من الدراسات التي تركز على تحسين كفاءة إعادة البرمجة في هذا المجال. ثانيا، تعتبر خصائص السلامة الكهربائية والانكماش لأجهزة iCMs مهمة لتحسين كفاءة وظائف القلب، ومع ذلك فإن تقييمها صعب. وفي الوقت الراهن، تركز أساليب التقييم المستخدمة على نطاق واسع في هذا المجال، بما في ذلك قياس التدفق الخلوي، والكيمياء المناعية، وqPCR لبعض التعبيرات الرئيسية لجينات CMs، على تشابه ال iCMs و CMs، ولكنها لا ترتبط مباشرة بالخصائص الوظيفية ل iCMs. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الأساليب لها إجراءات معقدة نسبيا وتستغرق وقتا طويلا. في حين أن دراسات إعادة البرمجة عادة ما تنطوي على فحص لعوامل إعادة البرمجة المحتملة التي تعزز نضوج iCMs11 ، تتطلب إعادة برمجة القلب طريقة سريعة ومريحة استنادا إلى وظيفة iCMs.

CMs فتح قنوات أيونات الكالسيوم ذات بوابات الجهد على السيتوميمبران خلال كل دورة التعاقد، مما يؤدي إلى تدفق عابر من أيون الكالسيوم (Ca2+) من السائل بين الخلايا إلى السيتوبلازم للمشاركة في انكماش myofilament. مثل هذا التدفق Ca2 + ودورة اللوكس هو السمة الأساسية للانكماش عضلة القلب ويشكل وظيفة طبيعية من CMs12. وبالتالي، فإن الطريقة التي تكتشف تدفق Ca2+ يمكن أن تكون طريقة محتملة لقياس وظيفة CMs والخلايا الشبيهة ب CM، بما في ذلك iCMs. وعلاوة على ذلك، بالنسبة لأجهزة iCMs، توفر هذه الطريقة طريقة أخرى لتقييم كفاءة إعادة البرمجة.

تم تطوير مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا (GECIs) واستخدامها على نطاق واسع للإشارة إلى أنشطة الخلية، وخاصة إمكانات العمل. عموما، GECIs تتكون من مجال ربط Ca2 + مثل كالمودولين، ومجال الفلورسنت مثل GFP، وGCaMP3 هو واحد مع تقارب عالية وكثافة مضان. سيتم تنشيط مجال الفلورسينس GCaMP3 عند تغيير تركيز الكالسيوم المحلي13. في هذه الورقة، يتم وصف سلالة الماوس التي تعبر على وجه التحديد مراسل GCaMP3 في خلايا Myh6+. من خلال إدخال MGT إلى NCFs المعزولة من حديثي الولادة من هذه السلالة ، يمكن مراقبة إعادة البرمجة عن طريق الفلور ، والتي سيتم عرضها بنجاح iCMs المبرمجة. مثل هذه السلالة الماوس وطريقة سوف توفر منصة قيمة للتحقيق في إعادة برمجة القلب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع الإجراءات والممارسات التجريبية التي تنطوي على الحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة ميشيغان. يجب أن يتم تنفيذ جميع الإجراءات والممارسات التجريبية التي تنطوي على زراعة الخلايا BSL2 خزانة السلامة البيولوجية في ظل ظروف معقمة. وفيما يتعلق بالإجراءات والممارسات التي تنطوي على الفيروسات، اتبع المبدأ التوجيهي للتخلص السليم من الخلايا المتحولة جنسيا، ونصائح المصصة، والأنابيب لتجنب خطر المخاطر البيئية والصحية.

1. إنشاء TG (Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38 (CAG-GCaMP3)Hze /J (يشار إليه باسم Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3) سلالة الماوس (الشكل 1)

  1. إعداد Tg (Myh6-cre)1Jmk/J سلالة الماوس (جاكسون مختبر الأسهم 009074، ويشار إليها باسم Myh6-Cre) وGt(ROSA)26Sortm38 (CAG-GCaMP3)Hze/J سلالة الماوس (جاكسون مختبر الأسهم 014538، ويشار إليها باسم Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3)، على التوالي.
  2. تولد كل سلالة تصل إلى 8 أسابيع من العمر للحصول على الكبار Myh6-Cre و Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 الفئران، على التوالي.
  3. Crossbreed الكبار Myh6 - كري و Rosa26A - Flox - وقف - Flox - GCaMP3 الفئران.
    ملاحظة: إعداد Myh6-Cre الذكور / Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 أنثى أو العكس بالعكس. لا يوجد فرق كبير بين أحفادهم. عادة ، فإن الفئران الإناث تلد 8-10 الجراء 19-21 يوما بعد التهجين.

2. عزل واختيار المولودين Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 قلوب الفئران.

  1. الحصول على الجراء P0-P2. تأكد من وجود 8-10 جراء لعزل 10 ملايين NCFs بهذا البروتوكول.
  2. تخدير عميق الجراء عن طريق انخفاض حرارة الجسم. ضع الجراء في قفاز اللاتكس وانغمس حتى الرقبة في الثلج والماء المسحوق (2 درجة مئوية - 3 درجات مئوية).
  3. تعقيم الجراء لفترة وجيزة مع الإيثانول 75٪.
  4. التضحية الجراء بقطع الرأس مع مقص معقم.
  5. إجراء شق أفقي بالقرب من القلب، والضغط على القلب، ومن ثم عزله عن طريق فصل في جذور الشريان الأورطي مع مقص.
  6. مراقبة ضربات القلب تحت المجهر الفلوري. ضمان قلوب مع Myh6- Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 النمط الجيني يظهر Ca2 + تدفق المشار إليها من قبل GCaMP3 مع ضربات القلب. لا تظهر الأنماط الجينية الأخرى الفلورسينس (الشكل 2، الفيديو 1، والفيديو 2).

3. عزل الخلايا الليفية القلبية الوليدية (NCFs)

ملاحظة: لهذا الجزء، تم اعتماد بروتوكول من Lab14 الدكتور لي تشيان مع تحسينات طفيفة عند الاقتضاء لهذه الدراسة.

  1. بعد عزل قلوب αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3، قطعها إلى أربع قطع متصلة بشكل فضفاض. غسلها في الجليد الباردة DPBS في لوحة 6 سم جيدا عدة مرات للحد من تلوث خلايا الدم في الخلايا المعزولة.
  2. نقل القلوب إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
  3. هضم قلوب مع 8 مل من الحارة 0.25٪ تريبسين-EDTA في 37 °C لمدة 10 دقيقة.
  4. تجاهل التريبسين الفائق وإضافة 5 مل من الكولاجينز الدافئ من النوع الثاني (0.5 ملغم / مل) في HBSS.
  5. دوامة الخليط جيدا، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  6. بعد الحضانة ، دوامة تماما والسماح للأنسجة غير المهضومة يستقر عن طريق الجاذبية.
  7. جمع supernatant في أنبوب مخروطي 15 مل مع 5 مل ليفية باردة (FB) المتوسطة (IMDM مع 20٪ FBS و 1٪ البنسلين / العقدية).
  8. كرر الخطوات 3.4-3.7 للأنسجة غير المهضومة 4-5 مرات.
  9. جمع كل supernatant معا وتصفية supernatant مع مصفاة 40 ميكرومتر.
  10. جهاز الطرد المركزي في 200 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية والتخلص من supernatant.
  11. إعادة إنفاق الخلايا في 10 مل من المخزن المؤقت لفرز الخلايا المنشط مغناطيسيا (MACS المؤقت؛ 1x PBS مع EDTA 2 mM و 0.5٪ BSA).
  12. تحديد عدد الخلايا قابلة للحياة عن طريق تلطيخ الأزرق تريبان.
    1. خذ 10 ميكرولتر من الخلايا من 10 مل من تعليق الخلية في الخطوة 3.11.
    2. مزيج مع 10 ميكرولتر من 0.4٪ حل أزرق تريبان واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    3. إضافة الخليط إلى مقياس الدم وتحديد عدد الخلايا قابلة للحياة. الخلايا الميتة ملطخة باللون الأزرق، في حين أن الخلايا القابلة للحياة غير ملطخة.
  13. طرد مركزي الخلايا في 200 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية والتخلص من supernatant.
  14. إعادة إنفاق الخلايا مع 10 ميكروغرام من الميكروبات Thy1.2 في 90 ميكرولتر من العازلة MACS المبردة لأقل من 10 مليون خلية قابلة للحياة. إضافة المزيد من الخرز نسبيا إذا كان هناك أكثر من 10 مليون خلية قابلة للحياة. ماصة الخليط جيدا واحتضان في 4 درجة مئوية لمدة 30-60 دقيقة.
  15. إضافة 10 مل من المخزن المؤقت MACS وتخلط جيدا.
  16. الطرد المركزي في 200 × ز لمدة 5 دقائق، والتخلص من supernatant.
  17. كرر الخطوات 3.15-3.16 مرة واحدة.
  18. Resuspend الخلايا والخرز مع 2 مل من MACS العازلة.
  19. إعداد فاصل MACS في غطاء محرك السيارة. إدراج عمود LS إلى الفاصل وتوازن العمود مع 3 مل من المخزن المؤقت MACS.
  20. عندما يكون العمود LS متساويا، مرر الخلايا عبر العمود.
  21. اغسل عمود LS مع 2 مل من المخزن المؤقت MACS ثلاث مرات.
  22. قم بخلع العمود عن الفاصل، ثم قم بتهيئة 2 مل من المخزن المؤقت MACS ثلاث مرات، ثم اجمع elution إلى أنبوب 50 مل.
  23. الطرد المركزي في 200 × ز لمدة 5 دقائق والتخلص من supernatant.
  24. إعادة إنفاق الخلايا مع 5 مل من وسائل الإعلام FB.
  25. تحديد رقم الخلية باستخدام مقياس الدم.
  26. تمييع الخلايا مع وسائل الإعلام FB والبذور الخلايا إلى أطباق أو لوحات على النحو المطلوب. تأكد من أن كثافة بذر الخلايا حوالي 2-2.5 × 104 خلايا / سم2 (تحسين الكثافة استنادا إلى التجارب الفردية). تأكد من أن الخلايا الليفية المرفقة لها شكل بيضاوي إلى مستدير في اليوم الثاني بعد البذر (الشكل 3).

4. إنتاج الفيروسات الرجعية ترميز ناقلات MGT متعددة الأجهزة لإعادة برمجة القلب

  1. الحفاظ على بلات-E مع وسائط الثقافة بلات-E (تكمل DMEM مع 10٪ FBS، 1 ميكروغرام / مل من بوروميسين و 10 ميكروغرام / مل من blasticidin) في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
  2. في اليوم الأول، تقسيم بلات-E إلى لوحة 6-جيدا في حوالي 4-5 × 105 خلايا / كثافة البئر.
  3. في اليوم الثاني، يصل Plat-E عادة إلى التقاء بنسبة 80٪. تحويل الخلايا مع الإجراءات التالية. ضبط حجم وكمية كل عنصر موجود هنا على أساس كل بئر في لوحة 6-جيدا.
    1. تمييع 2 ميكروغرام من pMX-puro-MGT متعدد الأجهزة الرجعية التعبير plasmid ناقلات (أدجين 111809) إلى 500 نانوغرام / ميكرولتر مع العازلة TE.
    2. إعداد خليط العدوى عن طريق خلط 10 ميكرولتر من ليبولاثامين مع 150 ميكرولتر من انخفاض متوسط المصل. ماصة بعناية لخلط جيدا واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. كن حذرا لتجنب الفقاعات عند pipetting.
    3. وفي الوقت نفسه، وإعداد خليط البلازميد عن طريق خلط البلازميد مع 150 ميكرولتر من انخفاض متوسط المصل. ماصة بعناية لخلط جيدا واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. كن حذرا لتجنب الفقاعات عند pipetting.
    4. تخلط بعناية الخلائط اثنين واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. قد يبدو الحل غائما.
    5. إضافة الخليط قطرة قطرة إلى الخلايا ليتم تحويلها.
    6. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  4. في اليوم الثالث، قم بتغيير الوسط إلى وسيط جديد لثقافة الخلايا الكاملة يفتقر إلى البوروميسين والبوميسيدين.
  5. في اليوم 4، 48 ساعة بعد العدوى، وجمع supernatant التي تحتوي على الفيروسات الرجعية وتخزينها في 4 درجة مئوية.
  6. في اليوم 5، 72 ساعة بعد العدوى، وجمع supernatant التي تحتوي على الفيروس الرجعية.
  7. تصفية كل من 48 ساعة و 72 ساعة فائقة مع مرشح 0.45 ميكرومتر، تترسب بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية عن طريق إضافة حجم 1/5 من 40٪ بولي (جلايكول الإيثيلين) (PEG) حل لجعل تركيز النهائي من 8٪ PEG.
  8. جهاز طرد مركزي عند 4000 x g لمدة 30 دقيقة لتسريع الفيروس.
    ملاحظة: PEG8000-virus يشكل هطول الأمطار البيضاء الصغيرة.
  9. Resuspend الفيروس مع وسيطة iCM تحتوي على 8 ميكروغرام / مل البوليبرين على النحو المطلوب. استخدام الفيروس الرجعية على الفور.

5. إعادة برمجة NCFs إلى iCMs مع MGT ترميز عدوى الفيروس الرجعية

  1. تنمو أو مرور NCFs قبل عدوى الفيروس.
    ملاحظة: عادة، يمكن تمرير NCF مرتين.
  2. في اليوم 0، NCF البذور إلى الكثافة حول 1-2 × 104 خلايا/ سم2 في المتوسط FB.
  3. في اليوم الأول، استبدل وسيطة الثقافة بوسط يحتوي على فيروس لكل بئر كما هو مرغوب فيه. استخدام الفيروس من بئر واحدة Plat-E في لوحة 6-جيدا لتصيب بئرين في لوحة 24 جيدا. تيتر الفيروس لتحديد تركيز الفيروس الأمثل.
    ملاحظة: يمكن إدخال الفيروسات التي تحتوي على عوامل إعادة برمجة أخرى ذات أهمية مع الفيروسات الرجعية MGT.
  4. حضانة عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  5. في اليوم الثاني، بعد 24 ساعة من الإصابة بالفيروس، استبدل الوسط المحتوي على الفيروس إلى وسيط iCM منتظم.
  6. لمراقبة تعبير GCaMP3، قم بتصفيحه تحت مجهر مضان مقلوب. تحت 10x في قناة GFP، ومراقبة خفيفة GCaMP3 القاعدية الفلورية لجزء من الخلايا في وقت مبكر من اليوم 5.
  7. استبدل الوسط كل يومين إلى ثلاثة أيام أثناء إعادة البرمجة. إذا لزم الأمر، إجراء اختيار إيجابي للخلايا المصابة بالفيروس الرجعية MGT بإضافة 2 ميكروغرام / مل من البوريميسين إلى وسط الثقافة لمدة 3 أيام والحفاظ عليه في 1 ميكروغرام / مل.
    ملاحظة: إدخال المواد الكيميائية ذات الأهمية (على سبيل المثال، IGF-1، MM589، A83-01، و PTC-209، يشار إليها باسم IMAP كما أبلغنا سابقا15) جنبا إلى جنب مع تغيير متوسط.
  8. بعد 14 يوما من العدوى، استبدل الوسط ب B27 المتوسط للحث على نضوج iCM.

6. تقييم iCM النضج الوظيفي وإعادة برمجة الكفاءة من قبل Ca2 + تدفق

ملاحظة: إضافة 1 ميكرومتر إيزوبروتيرينول إلى الخلايا التي سيتم تقييمها قبل التقييم، إذا لزم الأمر.

  1. تقييم تدفق Ca2 + مع مجهر مضان مقلوب في درجة حرارة الغرفة.
  2. في قناة GFP، لاحظ خلايا GCaMP3+ تحت هدف 10x. تأكد من أنه يظهر ضرب الخلية التلقائي في قناة حقل مشرق.
  3. حدد عشوائيا ثلاثة حقول تحت 20x وتسجيل تدفق Ca2 + من iCMs لمدة 3 دقائق لكل حقل.
    ملاحظة: هنا، تزامن تدفق Ca2+ مع ضرب الخلايا التلقائي (الشكل 4، الشكل 5، والفيديو 3، فيديو 4، فيديو 5، فيديو 6، فيديو 7، فيديو 8).
  4. قياس الخلايا يدويا مع تدفق Ca2 + .

7. التحليل الإحصائي وعرض البيانات

  1. تحليل الاختلافات بين المجموعات تحليل اتجاه واحد من التباين (ANOVA) وإجراء اختبارات المقارنة متعددة الطالب نيومان-Keuls.
    ملاحظة: النتائج هي كما متوسط ± S.E مع p < 0.05 تعتبر ذات دلالة إحصائية. تم إجراء كل تجربة ثلاث مرات على الأقل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويظهر في الشكل 1 سير العمل التجريبي لتوليد Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 سلالة الفئران والبنية الجينية للفئران المعدلة وراثيا. في حين يتم تأسيس سلالة الماوس ، تم عزل قلوب الجراء ومراقبتها تحت مجهر مضان عكسي لتأكيد النمط الجيني. قلوب مع النمط الجيني الصحيح تظهر Ca2 + تدفق متزامنة مع الضرب، تصور كما GCaMP3 مضان، في حين لوحظ عدم وجود مضان في قلوب السيطرة (الشكل 2، فيديو 1، والفيديو 2). سوف تعلق NCFs معزولة إلى ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقييم وظيفة iCMs ضروري لحقل إعادة برمجة القلب. في هذه المخطوطة، يصف البروتوكول سلالة TG (Myh6-cre)1Jmk/J/Gt(ROSA)26Sortm38 (CAG-GCaMP3)Hze/J Mouse التي تم إنشاؤها، وكيفية استخدام NCFs المعزولة عن الفئران الوليدية في هذه السلالة لإعادة برمجتها على iCMs، وتقييم وظيفة iCMs بواسطة تدفق Ca2+ . هذه طريقة de novo لتقييم النضج الوظيفي ل iCMs.

العديد من الخطوات الهامة مهمة لإعادة برمجة بنجاح وتقييم باستخدام هذا الأسلوب. أولا، يجب أن تكون صناديق NCFs معدة حديثا وصحية بعد ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدر جهود ليو جناتوفسكي في تحرير النص الإنجليزي لهذه المخطوطة. تم إنشاء الشكل 1 مع BioRender.com. وقد دعمت هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) في الولايات المتحدة (1R01HL109054) منحة للدكتور وانغ.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
15 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطيةالحرارية فيشر العلمية14-959-70C
50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطيةالحرارية فيشر العلمية14-959-49A
6 لوحات ثقافة خلايا الآبارالقلوية العلميةTP9006
A83-01Stemgent04 & ndash ؛ 0014
مجهر مضان الكل في واحدKeyenceBZ-X800Eمجهر مضان مقلوب
B-27 مكمل غذائي (50X) ، خال من المصلThermo Fisher Scientific17504044
Blasticidin S HCl (10 مجم / مل)Thermo Fisher ScientificA1113903
ألبومين مصل الأبقار (BSA) مسحوق خال من البروتيازThermo Fisher ScientificBP9706100
CD90.2 MicroBeads ، الماوسMiltenyi Biotec130-049-101Thy1.2 microbeads
Collagenase ، النوع 2Thermo Fisher ScientificNC9693955
Counting ChamberThermo Fisher Scientific02-671-51BHemocytometer
DMEM ، ارتفاع الجلوكوز ، لا الجلوتامينThermo Fisher Scientific11960069
DPBS ، الكالسيوم ، المغنيسيومثيرمو فيشر العلمي14-040-133
الإيثانول ، 200 دليل (100٪)ثيرمو فيشر العلمي04-355-451
حمض الإيثيلين ديامين رباعي الأسيتيك (معتمد من ACS)ثيرمو فيشر ScientificE478-500
مصل الأبقار الجنينيCorning35-010-CV
HBSS ، الكالسيوم ، المغنيسيوم ، بدون فينول أحمرثيرمو فيشر 14025092
IMDM وسائل الإعلامثيرمو فيشر العلمي12440053
IX73 المجهر المقلوبأوليمبوسIX73P2Fمجهر مضان مقلوب
Lipofectamine 2000 كاشفالتعداء الحراري فيشر العلمي11-668-019
أعمدةLS Miltenyi Biotec130-042-401
متوسط 199، Earle's SaltsThermo Fisher Scientific11150059
MidiMACS فاصل وأطقم بدءالتشغيل Miltenyi Biotec130-042-302
Millex-HV وحدة تصفية حقنة ، 0.45   ؛ ومايكرو. م ، PVDF ، 33   ؛ مم ، جاما معقمةMillipore SigmaSLHV033RB
MM589تم الحصول عليها من الدكتور Shaomeng Wang مختبر s في جامعة ميشيغان
Opti-MEM I مصل متوسطمتوسط ثيرمو فيشر العلمي31-985-070
PBS ، درجة الحموضة 7.4Thermo Fisher Scientific10-010-049
البنسلين الستربتومايسين (10,000 U / mL)Thermo Fisher Scientific15140122
Platinum-E (Plat-E) خلية خط خلية التعبئة والتغليف الفيروسي القهقري  ؛ BiolabsRV-101
pMx-puro-MGTAddgene111809
بولي (إيثيلين جلايكول)ميليبور سيجماP5413-1KGPEG8000
عدوى البوليبرين / كاشف التعديميليبور سيجماTR-1003-G
PTC-209سيجماSML1143 & ndash ؛ 5MG
Puromycin ثنائي هيدروكلوريدثيرمو فيشر ScientificA1113803
المؤتلف البشري IGF-IPeprotech100-11
RPMI 1640 متوسطالحرارية فيشر Scientific11875093
ST 16 سلسلة الطرد المركزيثيرمو فيشر العلمي75-004-381
مصافي الخلايا المعقمةالحرارية فيشر العلمية22-363-54740 & micro; م مصفاة
أطباق زراعة الأنسجة المعالجة السطحيةThermo Fisher ScientificFB012921
TE BufferThermo Fisher Scientific12090015
Trypan Blue solutionMillipore SigmaT8154
Trypsin-EDTA (0.05٪) ، الفينول الأحمرThermo Fisher Scientific25300054
Vortex MixerThermo Fisher Scientific02215365
علمي

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vos, T., et al. Global burden of 369 diseases and injuries in 204 countries and territories, 1990-2019: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019. The Lancet. 396 (10258), 1204-1222 (2020).
  2. Virani, S., et al. Heart disease and stroke statistics-2021 update: A report from the american heart association. Circulation. 143 (8), e254-e743 (2021).
  3. Frangogiannis, N. G. Pathophysiology of myocardial infarction. Comprehensive Physiology. 5 (4), 1841-1875 (2015).
  4. Tian, S., et al. HDAC inhibitor valproic acid protects heart function through Foxm1 pathway after acute myocardial infarction. EBioMedicine. 39, 83-94 (2019).
  5. Mohamed, T. M., et al. Chemical enhancement of in vitro and in vivo direct cardiac reprogramming. Circulation. 135 (10), 978-995 (2017).
  6. Liu, L., Lei, I., Wang, Z. Improving cardiac reprogramming for heart regeneration. Current Opinion in Organ Transplantation. 21 (6), 588-594 (2016).
  7. Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
  8. Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485 (7400), 593-598 (2012).
  9. Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
  10. Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances transcriptional reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11864-11869 (2015).
  11. Liu, L., et al. Targeting Mll1 H3K4 methyltransferase activity to guide cardiac lineage specific reprogramming of fibroblasts. Cell Discovery. 2, 16036(2016).
  12. Grant, A. O. Cardiac ion channels. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 2 (2), 185-194 (2009).
  13. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  14. Wang, L., et al. Improved Generation of Induced Cardiomyocytes Using a Polycistronic Construct Expressing Optimal Ratio of Gata4, Mef2c and Tbx5. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53426(2015).
  15. Guo, Y., et al. Chemical suppression of specific C-C chemokine signaling pathways enhances cardiac reprogramming. Journal of Biological Chemistry. 294 (23), 9134-9146 (2019).
  16. Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
  17. Stevenson, A. J., et al. Multiscale imaging of basal cell dynamics in the functionally mature mammary gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (43), 26822-26832 (2020).
  18. Ikeda, K., et al. UCP1-independent signaling involving SERCA2b-mediated calcium cycling regulates beige fat thermogenesis and systemic glucose homeostasis. Nature Medicine. 23 (12), 1454-1465 (2017).
  19. Golebiewska, U., Scarlata, S. Measuring fast calcium fluxes in cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3505(2011).
  20. Eng, G., et al. Autonomous beating rate adaptation in human stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Communications. 7, 10312(2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة