تصور التفاعلات الأمعاء Microbiota المضيف عبر الفلورسينس في التهجين الموقع ، تلطيخ ليكتين، والتصوير

تقنيات التصور الميكروبي لها أصول قديمة قدم علم الأحياء المجهرية نفسه ، عندما استخدم أنتوني فان ليوينهوك مجهره لمراقبة البكتيريا (التي أطلق عليها اسم "الحيوانات") من لوحة الأسنان والبراز في القرن السابع ^عشر . ومنذ ذلك الحين، تم تطوير العديد من التقنيات لتصور التنظيم المكاني لاتحاد البكتيريا والفطريات والفيروسات التي تعيش مرتبطة بمضيف الكائنات الحية ^{الدقيقة1}. توضيح توطين هذه الميكروبات أمر ضروري لتحديد وظيفتها داخل مضيفها الحيواني. الجغرافيا الحيوية للبكتيريا مهمة في التصنيفات المشتركة والإمراضية على حد سواء ، حيث أن القرب من مواقع محددة (على سبيل المثال ، الظهارة) ، والركائز الغذائية ، والميكروبات المحددة قد يملي الإنتاج البكتيري من الأيض الكامنة وراء الأنواع والتفاعلات بين المملكة.

هيكل رئيسي يفصل بين البكتيريا والأنسجة المضيفة في العديد من مواقع الجسم المتباينة ، مثل تجويف الفم أو الأمعاء أو الرئة ، هو المخاط - طبقة منتجة من المضيف تمنع نقل الميكروبات إلى الخلايا الظهارية المضيفة وتعمل كمورد غذائي ^{للميكروبات2،3،4} . ويتسم توصيف الخروقات والتغيرات في هذا الحاجز بأهمية رئيسية، مما يؤدي إلى نظرة آلية إلى التفاعلات بين المضيف والميكروبيوتا التي لن يتم الحصول عليها عن طريق التسلسل ^{وحده5،6،7}. على سبيل المثال، مكن التصوير من اكتشاف أن التعرض للمضادات الحيوية يمكن أن يعطل طبقة المخاط ومنظمة الكائنات الحية ^{الدقيقة7،8}، وأن المسهلات قد تستنفد المخاط، وترتبط بتغيرات كبيرة في المعلمات ^{المناعية5}.

يحدد هذا البروتوكول إطارا عاما لإصلاح وتلطيخ وتصوير الكائنات الحية المجهرية والأنسجة المضيفة (الشكل 1) ، المبني على عمل يوهانسون وهانسون9. في حين أن هذا البروتوكول على غرار في سياق الأقسام المعوية، فإنه يمكن تكييفها بسهولة لأنواع الأنسجة الأخرى. ويمكن هذا البروتوكول من تجهيز عينات سريرية تجريبية من الحيوانات أو الإنسان؛ وقد أدرجت ملاحظات لمعالجة كلا النوعين من العينات. في المثال المعروض هنا ، تم تسمية ظهارة المضيف والبكتيريا الإنارة في وقت واحد مع 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) تلطيخ, المخاط مع الفلورسين (FITC) - الليكتين المقترنة, Ulex europaeus agglutinin I (UEA-1), وتصنيف بكتيري محدد باستخدام FISH. عادة ما يتم تصميم تحقيقات FISH مقابل جينات 16S rRNA الخاصة بالتصنيف لضمان الإشارة العالية من ربط نسخة عالية.

في هذا المثال، يستهدف المسبار 16S rRNA من عائلة موريباكولاسا البكتيرية (الشكل 2). ومع ذلك ، يتم استبدال البقع بسهولة بمسابير FISH مختلفة و / أو lectins لاستيعاب السؤال البيولوجي المناسب. يمكن العثور على تحقيقات FISH التي تم التحقق من صحتها سابقا على ^ProbeBase10 ، وهو مورد عبر الإنترنت لمسابير أوليغونوكليوتيد المستهدفة من rRNA ، أو على ^SILVA11 ، وهي قاعدة بيانات الحمض النووي الريبي الريبوسومي. لتصميم تحقيقات جديدة، يمكن للقارئ الرجوع إلى خطوط أنابيب جديدة مثل HiPR-FISH8 أو Oligominer12. باستخدام هذا البروتوكول ، من الممكن مراقبة التعبئة الدقيقة للبكتيريا في التجويف المعوي والميزات المختلفة للمخاط المعوي في جميع أنحاء الجهاز الهضمي. ويمكن سير العمل الموصوف هنا من التحليل الكمي للكائنات الحية المجهرية في السياق المكاني للبيئة المضيفة لها.

أجريت جميع التجارب على الحيوانات وجمع الأنسجة الموصوفة في هذا البروتوكول وفقا للمبادئ التوجيهية للمجلس الكندي لرعاية الحيوان (CCAC) ووافقت عليها لجنة رعاية الحيوان في جامعة كولومبيا البريطانية. تم استخدام فئران ويبستر السويسرية الخالية من الجراثيم. كانت جميع الحيوانات في الأسبوع 8-10 من العمر ، واستخدمت كلا الجنسين ، وشارك في إيواء جميع الفئران مع ما لا يقل عن اثنين من الفئران في القفص الواحد. تم قتل الحيوانات باستخدام ثاني أكسيد الكربون مع خلع عنق الرحم الثانوي أو ثقب القلب.

1. تصميم تجربة التصوير: الاعتبارات وجمع العينات

1. تصميم مسبار FISH
   1. إذا كان هناك مسبار FISH مناسب، حدد مسبارا منشورا موجودا مسبقا يظهر إشارة قوية في الخلايا المسماة مقارنة بالخلفية.
   2. التحقق من صحة المسابير الجديدة في المختبر لتحديد كفاءتها في الربط لعينات ثابتة من البكتيريا المستهدفة وربطها خارج الهدف بالبكتيريا الأخرى.
   3. تحقق من جميع مسابير FISH 16S لاستخدامها ضد تسلسل 16S من الكائن المستهدف أو ضد تسلسل 16S rRNA من العينات التي سيتم تحليلها لضمان وجود النسبة المتوقعة من المطابقات الإيجابية ، وأن المسابير لن ترتبط بشكل غير محدد بأعضاء الكائنات الحية الدقيقة الآخرين.
      1. محاذاة تحقيقات FISH ضد تسلسل كامل الطول أو المتغيرات تسلسل amplicon باستخدام أداة، مثل أوميغا ¹³ كلوستال، لتقييم الربط المحتمل للمسابير وأهدافها.
      2. بالإضافة إلى اختبار السيليكو، اختبر دقة ومستوى تلطيخ الأسماك للمسابير غير المناسخ على الثقافات النقية8,14.

ملاحظة: عند تلطيخ العديد من أفراد المجتمع، يمكن استخدام المسابير بشكل مشترك (على سبيل المثال، الجمع بين مسبار خاص بالعائلة ومسبار خاص بالجنس) إذا لم تتداخل الفلوروفوريس المستخدمة في أطياف الإثارة والانبعاثات (ما لم يكن التصوير على نظام لديه القدرة على أداء التوليف الخطي). وبالإضافة إلى ذلك، يمكن إثبات خصوصية من خلال تضمين ضوابط خصوصية / تحقيقات مشوشة أو عن طريق المنافسة مع مسابير غير فلورية.

1. أنواع العينة وجمع الأنسجة
   1. باستخدام أدوات حادة ونظيفة، وقطع شرائح الأمعاء من الفئران ويبستر السويسرية الغنوتوبيوتك للتصوير. تقليل إزعاج العينة قدر الإمكان، والتعامل مع المقاطع من حوافها لتجنب التأثير على منطقة التصوير. إصلاح العينة في أقرب وقت ممكن بعد تشريح لمنع تدهور.
      ملاحظة: بالنسبة للدراسات الحيوانية، يفضل وجود أقسام معوية سليمة وغير مطوقة؛ سيساعد الغشاء في الحفاظ على التنظيم الإنارة والملموس سليم.
   2. تنظيف الأدوات عن طريق مسحها مع الإيثانول 70٪ بين العينات والمواقع. الحصول على ما لا يقل عن ثلاثة تكرارات بيولوجية لكل قسم معوي / موقع خزعة ، مع الحرص على عينة مواقع الأمعاء متسقة ، كما المخاط والهندسة المعمارية المعوية ، فضلا عن الكائنات الحية الدقيقة تتغير بشكل كبير في مواقع مختلفة.

2. تثبيت عينة الأنسجة والتسلل

1. تثبيت
   1. إعداد methacarn الطازجة في حاوية متوافقة مع النسب التالية: 60٪ الميثانول المطلق، 30٪ الكلوروفورم، و 10٪ حمض الخليك الجليدي. الاستغناء عن كل من هذه المواد الكيميائية في غطاء الدخان. اختر حاوية يمكن تنفيسها عن طريق فتح الغطاء. بما أن الميثاكارن غير متوافق مع البوليسترين ، قم بإعداده في حاوية البولي إيثيلين ، باستخدام اسطوانات زجاجية متخرجة / ماصة مصلية لحمض الخليك الكلوروفورم والجليدي.
      ملاحظة: أثناء الخلط، يتم إنتاج الأبخرة وقد تتسبب في تراكم الضغط داخل الحاوية. من المستحسن إبقاء الحاوية مغلقة بإحكام نسبيا بمجرد إزالتها من غطاء الدخان إذا لم يتم إضافة العينات بنشاط. الكلوروفورم سامة. لا تستنشق أو تبتلع أو تمتص من خلال الجلد. الميثانول سامة واشتعالا عاليا. لا تستنشق أو تبتلع أو تمتص من خلال الجلد. حمض الخليك الجليدي قابل للاشتعال وتآكل شديد في الجلد والعينين.
   2. بعد الاستغناء، وإغلاق الحاوية، دوامة لخلط ثم تنفيس. كرر هذا حتى توقف خارج الغاز (والضغط لم يعد يتراكم بشكل ملحوظ تحت الغطاء).
      ملاحظة: لا تتخلص من الميثاكارن في المصارف؛ جمع النفايات الكيميائية الخطرة والتخلص منها وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية. استخدام قلم رصاص لتسمية أشرطة الأنسجة، كما العديد من الأحبار القلم سوف تأتي قبالة في حل ميثاكارن.
   3. ضع أقسام الأمعاء في أشرطة الأنسجة عن طريق عقد بدقة حافة الأنسجة مع ملاقط. إغلاق كاسيت وغمر تماما في محلول ميثاكارن الطازجة. تأكد من أن الحل لا يزيد عن بضع ساعات عند غمر أشرطة الكاسيت.
   4. بالنسبة للعينات السريرية التي سيتم جمعها في جناح سريري دون الوصول إلى غطاء الدخان ، استخدم حاوية تخزين البولي إيثيلين مع قطع رفرف في الغطاء الذي سيسمح بمرور أشرطة الأنسجة. الشريط هذا رفرف اغلاق عند عدم تمرير العينات لمنع هروب الأبخرة السامة.
      ملاحظة: من المهم استخدام الشريط اخفاء لتجنب انحلال الغراء على الحاوية بعض أنواع الشريط (على سبيل المثال، شريط التعبئة البلاستيكية) قد لا تصمد جيدا لأبخرة ميثاكارن.
   5. إصلاح عينات لمدة لا تقل عن 3 ساعة و بحد أقصى أسبوعين.
      ملاحظة: قد تتطلب عينات أكثر سمكا مرات التثبيت أطول من 3 ساعة. ويمكن اختيار وقت التثبيت لتمكين معالجة تسلل البارافين المتزامنة للأشرطة المثبتة في حلول مختلفة للميثاكارن (على سبيل المثال، إجراء تسلل البارافين في وقت واحد على مجموعات من العينات التي تم جمعها وإصلاحها على مدى أسبوعين).
2. تسلل البارافين وتضمينه
   1. ضعي البارافين في وعاء مقاوم للحرارة وذابه في فرن عند 60 درجة مئوية بين عشية وضحاها. كما الكريات البارافين تأخذ مساحة أكبر قبل ذوبان, ضمان أن يتم إذابة البارافين كافية لتغطية جميع أشرطة الكاسيت.
      ملاحظة: يجب أن لا تكون درجة الحرارة أعلى من 60 درجة مئوية لأنها يمكن أن تؤدي إلى القطع الأثرية.
   2. غسل الأنسجة عن طريق صب السائل في وعاء النفايات المناسبة واستبداله فورا مع المواد الكيميائية التالية.
      1. احتضان في الميثانول المطلق لمدة 30 دقيقة كرر مرة واحدة.
      2. احتضان الإيثانول المطلق لمدة 20 دقيقة.
      3. احتضان في xylenes لمدة 15 دقيقة.
      4. تبادل يغسل بسرعة، مع الحرص على تجنب السماح للأشرطة الجافة. تأكد من أن كل غسل يغطي تماما أشرطة في الكأس أو الحاوية.
         ملاحظة: الزيلين قابل للاشتعال، وإذا تم استنشاقه، قد تضعف الأبخرة الجهاز العصبي المركزي مع عواقب عصبية محتملة على المدى الطويل عند التعرض لتركيزات عالية (>200 ppm). التعامل مع xylenes فقط داخل غطاء الدخان. كما xylenes خطرة، والحرص على استخدام الحد الأدنى من المبلغ اللازم لتغطية أشرطة النسيجية.
   3. أثناء التضمين، وجه الأجزاء المعوية الموازية لطول الكاسيت (بدلا من الاستقامة) باستخدام ملاقط لتوفير مقاطع طولية عرضية بدلا من الدونات المقطعية لتوفير مساحة عينة محتملة أكثر للتصوير الكمي (الشكل 1B).
   4. فتح أشرطة قليلا (~ 1-2 سم أو 0.5 بوصة) للسماح للبارافين للدخول دون فقدان شرائح الأنسجة. استخدم قفازات مزدوجة لهذه الخطوة أو الملاقط لمنع ارتفاع درجة الحرارة أو حرق خفيف للأصابع. غمر وإغلاق أشرطة في حاوية من البارافين الذائب، ووضع الحاوية مرة أخرى في الفرن 60 درجة مئوية. تأكد من أن أشرطة مملوءة البارافين، وتبقى أي فقاعات الهواء الكبيرة.
   5. بعد الحضانة لمدة 2 ساعة في 60 درجة مئوية، قم بإزالة الحاوية من الفرن. باستخدام ملقط، وإزالة بعناية كاسيت ووضعها بشكل فردي على قطعة من رقائق الألومنيوم لتبرد. تخزينها في درجة حرارة الغرفة حتى تصبح جاهزة لتضمين والتقسم.
   6. قسم كتل البارافين مع microtome، مقطعة عميقا بما فيه الكفاية في كتلة أن تتعرض محتويات مضيئة، وتمكين قسم طولي من الزغب و / أو سرداب بالإضافة إلى محتويات مضيئة والمخاط. الحرص على استبدال ريش كما مواد البراز مملة شفرة بسرعة بالمقارنة مع الأنسجة. قطع المقاطع إلى 4 ميكرومتر من سمك للحدة الأمثل للصور. نقل المقاطع إلى الشرائح العادية غير المصقول.
   7. لتلطيخ الأسماك، وصمة عار في أقسام الأمعاء في أقرب وقت ممكن (أي، في غضون أسابيع قليلة من المقطع) لتحقيق إشارة الأسماك قوية. إذا حذف تلطيخ الأسماك، lectin + DAPI تلطيخ يمكن أن يؤديها على عينات أقل الطازجة (أي أشهر من العمر) دون فقدان كبير للإشارة.

3. تلطيخ البكتيريا وميزات المضيف

1. اعداد
   1. سخني الفرن إلى 60 درجة مئوية. ما قبل الحارة جرة كوبلين فارغة وحجم كاف لتغطية الشرائح الزجاجية في جرة مرتين مع xylenes في زجاجة، مع الحرص على parafilm حول الغطاء لمنع تبخر xylenes. السماح لدرجة حرارة xylenes لتصل إلى 60 درجة مئوية.
      ملاحظة: تناسب جرة كوبلين القياسية 8 شرائح، ويمكن تغطية الشرائح بما يقرب من 50 مل من السائل (قد تتراوح بين 40 و60 مل اعتمادا على العلامة التجارية). بدائل الزيلين أقل سمية وقد استخدمت بنجاح من قبل مجموعات أخرى لخطوة إزالة الصبح (الخطوة 3.2)^8,9.
   2. إذا كان هناك فرن منفصل متوفر، قم بتدفئة فرن التهجين مسبقا إلى 50 درجة مئوية. وإلا، يمكن تنفيذ هذه الخطوة مع نفس الفرن المستخدم في خبز الشرائح بعد الخطوة 3.2.3.
   3. إعداد حل التهجين FISH: 20 mM تريس-HCl، pH 7.4; 0.9 م كلوريد الناكل; 0.01٪ ²⁶ - 0.1٪⁹ (ث/5) دودسيلسلبريتات الصوديوم (SDS) في مياه خالية من النيوكليز. إذا لزم الأمر، إضافة 5-50٪ (v/v) formamide. قبل الحارة هذا الحل التهجين في 50 درجة مئوية أثناء إزالة البارافينين.
      ملاحظة: Formamide هو وسطي يعمل كمسخ; التعامل مع فورماميد مع قفازات ونظارات واقية. في جرعات صغيرة وعند التعرض للعيون والجلد، أو الأغشية المخاطية، فإنه مزعج. وبكميات كبيرة، يمكن أن يتطلب بخار الفورماميد تدخلا طبيا. يمكن تخزين فورماميد بنسبة 100٪ في ثلاجة -20 درجة مئوية.
2. إعداد الشرائح للتلطيخ: إزالة التلطيخ
   1. ضع الشرائح في جرة كوبلين، مع التأكد من أن الأقسام لا تتصل بالشرائح الأخرى أو الجرة، واخبز الشرائح عند 60 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
   2. في غطاء الدخان، وملء جرة كوبلين مع xylenes قبل الحارة من الفرن، مع الحرص على عدم صب مباشرة على رأس العينات ويحتمل أن طرد الأنسجة. ضع جرة كوبلين مرة أخرى في الفرن 60 درجة مئوية. اترك الزجاجة مع الزيلين المتبقية في غطاء الدخان.
   3. صب xylenes المستخدمة في حاوية النفايات المناسبة للتخلص منها، مع الحرص على عدم تعكير صفو أقسام الأنسجة على الشرائح الزجاجية واستخدام زوج من ملقط للحفاظ على الشرائح من السقوط من جرة كوبلين. تجديد جرة كوبلين مع xylenes المتبقية واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في غطاء محرك السيارة الدخان.
   4. احتضان الأقسام في الإيثانول 99.5٪ لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد خطوة الحضانة هذه، قم بإزالة الشرائح من جرة كوبلين، ومسح الجزء الخلفي من الشرائح على مسح مختبر أو منشفة ورقية، وتجفيف الهواء لفترة وجيزة حتى تختفي قطرات الإيثانول.
      ملاحظة: مسح الجزء الخلفي من الشرائح يتيح تصور أفضل للتقدم التجفيف.
3. تلطيخ البكتيريا مع FISH
   1. استخدم مانع سائل أو قلم PAP للحد من مساحة التوسع السائل عن طريق الدوران حول منطقة كل قسم من أقسام الأنسجة. تأكد من عدم اتصال الحبر بالقسم نفسه. إنشاء دائرة أقرب إلى كل قسم الأنسجة ممكن دون الاتصال الأنسجة لتقليل مساحة السطح التي تحتاج إلى أن تغطيها الحل التهجين.
   2. إعداد حل التهجين: لكل 50 ميكرولتر من محلول التهجين قبل الإحماء، أضف مسبار 0.5 ميكروغرام (على سبيل المثال، 0.5 ميكرولتر من مسبار 1 ميكروغرام/ميكرولتر). ماصة حل التهجين على المقاطع على الشريحة (~ 20 ميكرولتر / مقطع، اعتمادا على حجم القسم / الدائرة). حماية حل التهجين والشرائح من الضوء من هذه النقطة فصاعدا خلال خطوات الحضانة والتخزين.
   3. تأكد من أن حجم السائل المستخدم يغطي القسم بأكمله عند التراكب مع غطاء بلاستيكي مرن. احتضان الشريحة في غرفة رطبة للحد من التبخر. إنشاء غرفة رطبة مع مربع تلميح ماصة مع مناديل أو مناشف ورقية في الجزء السفلي التي تم غارقة مع محلول التهجين الزائد أو المالحة الفوسفات المخزنة (PBS) لتوفير الرطوبة. احتضان الأقسام في 45-50 درجة مئوية، اعتمادا على مجموعة التحقيق، لمدة >3 ساعة.
   4. الاحماء المخزن المؤقت غسل الأسماك: 20 mM تريس-HCl، درجة الحموضة 7.4؛ 0.9 م NaCl إلى 50 درجة مئوية خلال فترة الحضانة. إعداد ما يكفي من العازلة الغسيل لتغطية الشرائح في جرة كوبلين.
   5. إزالة الأغطية البلاستيكية؛ احتضان الشرائح في المخزن المؤقت غسل FISH في جرة كوبلين، وكلاهما مسبقا تدفأ إلى 50 درجة مئوية. ضعي جرة كوبلين مرة أخرى في فرن 50 درجة مئوية لمدة 10-20 دقيقة. بالنسبة للعينات السميكة، قم بإزالة الأغطية في جرة كوبلين عن طريق إضافة العازلة وإزاحة الأغطية بلطف لتجنب تلطيخ الشريحة.
4. تلطيخ المخاط وميزات المضيف
   1. إعداد مضاد الحمض النووي / المخاط العاموقع في برنامج تلفزيوني: النهائي 10 ميكروغرام / مل DAPI + 40 ميكروغرام / مل مخاط وصمة عار UEA-1. إعداد ما يكفي من مضادة لتغطية البقع في غياب غطاء لتجنب تلف الأنسجة مع coverlips إضافية.
      ملاحظة: يتطلب تغطية البقع في حالة عدم وجود غطاء أحجام أكبر من 20 ميكرولتر المستخدمة في 3.3.2. بالنسبة للأقسام متوسطة الحجم (قطرها 10 مم تقريبا)، فإن 200 ميكرولتر كافية لتغطية بقعة واحدة؛ اختبار وحدة التخزين هذه مسبقا على شريحة وهمية.
   2. إزالة المخزن المؤقت غسل FISH واستبداله برنامج تلفزيوني في جرة كوبلين. مباشرة بعد إعادة ملء جرة كوبلين مع برنامج تلفزيوني ، decant برنامج تلفزيوني.
   3. إزالة الشرائح من جرة وماصة العداداتعلى رأس القسم مع ضمان عدم لمس الأنسجة مع طرف ماصة. تغطية القسم بأكمله مع فقاعة. حضانة في 4 °C لمدة 45 دقيقة في الظلام.
   4. غسل البقع 3 مرات بسرعة مع برنامج تلفزيوني جديد: في حين عقد الشرائح في مكان باستخدام ملاقط، صب برنامج تلفزيوني في بالوعة وإعادة ملء فورا مع برنامج تلفزيوني جديد.
   5. مسح الجزء الخلفي من الشرائح ضد مسح أو منشفة ورقية، والسماح لمعظم برنامج تلفزيوني تتبخر قبالة الأقسام، بمساعدة خط فراغ متصلة تلميح ماصة. مرة أخرى، تجنب لمس القسم مع طرف ماصة.
   6. قم بتركيب المقاطع باستخدام وسيطة تركيب (بدون DAPI) والسماح لها بتعيين درجة حرارة الغرفة التي تغطيها الأغطية الزجاجية ، مما يضمن أن الأغطية مسطحة ولا توجد فقاعات هواء في الوسط المتصاعد.
   7. ألصق الأغطية على الشريحة عن طريق الرسم على طول حواف الغطاء مع طلاء الأظافر الواضح ، مع الحرص على الابتعاد عن حافة الشريحة لضمان أن الشريحة ستجلس على مستوى حامل الشريحة المجهر أثناء التصوير.
   8. تخزين الشرائح في 4 درجة مئوية في الظلام لبضعة أسابيع قبل أن يتم استنفاد الفلورسينس.

4. التصوير وتحليل الصور

1. تصور البقع
   1. حدد منطقة من الأنسجة التي تحتوي على كل من الأنسجة والتجويف لتصوير واجهة الكائنات الحية المجهرية المضيفة. للتصوير الكمي لسمك المخاط والجغرافيا الحيوية الإنارة، حدد مجالات الرؤية حيث تكون شرائح الزغب الظهاري و/أو السراديب طولية وليست مقطعية. تجنب المناطق التي بها فجوات كبيرة بين المخاط والظهارة لتجنب تقسيم القطع الأثرية.
   2. تحديد موقع الأنسجة وتصحيح المستوى البؤري، وذلك باستخدام إشارة DAPI لتحديد موقع والتركيز لتجنب تبييض الصور من إشارة مضان السمك.
   3. ضبط إعدادات التصوير. لتصور وصمة عار DAPI البكتيرية ، وزيادة قوة الليزر والحصول على النقطة التي تكون فيها إشارة DAPI من الخلايا الظهارية مشبعة أو "في مهب".
      ملاحظة: لا تفرط في التشبع، لأن هذا سيؤدي إلى photobleaching والتحف البصرية في النوى التي لا يمكن استردادها.
   4. لجميع القنوات الأخرى، استخدم الحد الأدنى من طاقة الليزر التي من شأنها أن توفر إشارة واضحة فوق الخلفية، وتوخي الحذر من عدم الإفراط في التشبع.
      ملاحظة: هذا مهم بشكل خاص عند إجراء عمليات مسح الإطارات المتجانبة، حيث أن إعادة اللؤم الضوئي ستكون مشكلة عند تصوير التداخل بين الإطارات المتجانبة.
   5. استخدام 40x أو أعلى التكبير لتصوير البكتيريا الفردية.
   6. الحصول على الصور.
      1. الحصول على مسح البلاط للحصول على بيانات كمية عن سمك المخاط والتوزيع المكاني للميكروبات داخل التجويف. تأكد من تداخل 15٪ بين البلاط والتحقق من الإضاءة التظليل / متفاوتة، والتي قد تتفاقم بسبب التكبير <1x. عند إعداد مسح البلاط، انتبه عن كثب إلى ما إذا كان النسيج في بؤرة التركيز في جميع المربعات، حيث لا يمكن تحليل الصور الضبابية/الخارجة عن التركيز (الشكل 3B).
      2. إذا كان ذلك ممكنا، تقليل عدد البلاط اللازمة لتصوير طول معين من الظهارة عن طريق تدوير منطقة المسح الضوئي بحيث طبقة الظهارة والمخاط موازية للبلاط وليس في زاوية. خلاف ذلك، ابحث عن جزء من الظهارة المتوازية أو المتعامدة مع منطقة التصوير لتحقيق تأثير مماثل.

للتحقيق في توطين البكتيريا commensal الأمعاء محددة في أمعاء الماوس، استخدمت الفئران السويسرية ويبستر خالية من الجراثيم التي كانت مستعمرة مع عزل البكتيرية الفردية في هذه الدراسة. لهذه التجربة، كانت الأنواع البكتيرية المسماة 1) عزل الإنسان من الأسرة Muribaculaceae5، Muribaculum المعوية، عائلة وفيرة وشائعة من البكتيريا في ميكروبيوتا 15 مورين، وكذلك 2) بكتيريا ثيتايوتاوميكرون، بكتيريا الأمعاء القابلة للسحب وراثيا وشائعة. بعد أسبوعين من التوازن ، تم قتل الفئران ، وتم تقسيم جزء من القولون يحتوي على بيليه البراز وإصلاحه في الميثاكارن الطازج. بعد يومين من التثبيت ، تم جفاف الأقسام عن طريق المعالجة من خلال الميثانول والإيثانول والزيلين ، وتسللت مع البارافين ، جزءا لا يتجزأ ، ثم قسمت إلى شرائح 4 ميكرومتر مضيئة. ثم لطخت هذه العينات مع مسبار FISH (3 'Cy3 الموسومة) محددة لعزل Muribaculum، مصممة باستخدام برنامج أوليغومينر12، وفحص للبنية الثانوية والثالثية والحد الأدنى من الربط غير محددة باستخدام NuPACK و mathFISH16،17. كما كانت العينات ملطخة بالليكتين UEA-1 المرتبط بالرودامين (الذي يلطخ الجليكانات المكواة في المخاط) وDAPI. تم تصوير المقاطع الملطخة باستخدام هدف زيت 40x ووحدة فائقة الدقة.

الشكل 1: سير عمل التصور للواجهة الميكروبيوتا المضيفة في الأمعاء. (أ) سير عمل مصور لخط الأنابيب. (ب) سوف ينتج عن مستويي المقطع إما مقاطع عرضية (مفضلة لخط الأنابيب هذا) أو "دونات" مقطعية. (ج) قد يؤدي تضمين أنسجة ذات سماكة مختلفة جدا إلى شرائح مثالية فقط لنسيج أو آخر. المختصرات: FISH = الفلورسينس في التهجين الموقعي ؛ DAPI = 4′,6-دياميدينو-2-فينيليندول. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: تصوير القولون يظهر توطين الأمعاء Muribaculum بالنسبة للمخاط في نموذج الماوس الغنوتوبيوتك. كانت الأقسام ملطخة DAPI (الأزرق) ، Muribaculaceae FISH التحقيق (الأحمر) ، وUEA - 1 (الأخضر). (أ) القولون البعيدة من الماوس أحادية المستعمر مع الأمعاء Muribaculum و (ب) القولون البعيدة من الماوس ثنائي المستعمر مع الأمعاء Muribaculum وbacteroides thetaiotaomicron. شريط المقياس = 20 ميكرومتر (C و D) Cy3-FISH (يسار) و DAPI (وسط) وقنوات Cy3-FISH + DAPI المدمجة لأجزاء الإنشاء من (A) و (B) على التوالي. شريط المقياس = 5 ميكرومتر. في (A) و (C) ، يتم تسمية جميع إشارات DAPI على شكل بكتيريا وحجم البكتيريا مع Cy3 (رؤوس الأسهم الفردية) ، وفي (B) و (D) ، بالإضافة إلى هذه الخلايا الإيجابية المزدوجة Cy3 و DAPI (رؤوس الأسهم الفردية) ، هناك خلايا بكتيرية ملطخة ب DAPI تكون سالبة Cy3 (رؤوس الأسهم المزدوجة) ، كما هو متوقع للدول أحادية والاستعمار الثنائي. وباستثناء البكتيريا الخيطية الأطول، فإن الهياكل الإيجابية (السهام الحادة) الأكبر حجما (>4 ميكرومتر) هي مواد نباتية أو نواة من الخلايا المضيفة. المختصرات: FISH = الفلورسينس في التهجين الموقعي؛ DAPI = 4′,6-دياميدينو-2-فينيليندول. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: المشاكل الشائعة. (أ) لن يوفر المقطع الضحل شرائح مضيئة من الأمعاء. (يسار) مقطع معوي تم تقسيمه على عمق يوفر إطلالة على التجويف بالإضافة إلى وجهات النظر الطولية للظهارة. (يمين) شريحة معوية تم تقسيمها بشكل ضحل للغاية ، مما يكشف فقط عن مقاطع عرضية من سرداب ولا توجد طبقة مخاط ثابتة أو بكتيريا. (ب) قد تؤدي تغطية الأنسجة/الأغطية غير المتساوية إلى مسح البلاط الباهت وغير المضاء بشكل غير متساو. تم إعداد فحص البلاط مع المواقف التي كانت خارج التركيز (الزاوية اليمنى العليا). (ج) مثال على الخلفية العادية (يسار) والخلفية العالية (يمين). في هذا المثال، لملاحظة إشارة DAPI الإشارة القادمة من الظهارة، خارج النوى. جميع أشرطة المقياس = 20 ميكرومتر. اختصار: DAPI = 4′,6-دياميدينو-2-فينيليندول. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ولا يوجد بين أصحاب البلاغ تضارب في المصالح.