Method Article

نشر AAV لبنيات التعبير القائمة على المحسن في الجسم الحي في دماغ الفأر

DOI:

10.3791/62650

⸱

March 31st, 2022

 ,  , 
1Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, University of California, Davis, 2Department of Neurobiology, Physiology and Behavior, University of California, Davis

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول مقايسة مراسل محسن عابر جديد قائم على rAAV. يمكن استخدام هذا الفحص للحث على التعبير المدفوع بالمحسن في الجسم الحي في دماغ الفأر.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المعززات هي منصات ملزمة لمجموعة متنوعة من عوامل النسخ التي تقود أنماط تعبير محددة للجينات الخاصة بالأنسجة والخلايا. أثبتت الوسائل المتعددة لتقييم الحمض النووي غير المشفر وحالات الكروماتين المختلفة فائدتها في التنبؤ بوجود تسلسلات معززة في الجينوم ، ولكن التحقق من صحة نشاط هذه التسلسلات وإيجاد الأعضاء ومراحل النمو التي تنشط فيها هي عملية كثيفة العمالة. مكنت التطورات الحديثة في ناقلات الفيروسات المرتبطة بالغدي (AAV) من توصيل جينات التحوير على نطاق واسع إلى أنسجة الفئران ، مما مكن من اختبار محسن في الجسم الحي دون الحاجة إلى معدل وراثيا. يوضح هذا البروتوكول كيف يمكن استخدام بنية المراسل التي تعبر عن EGFP تحت سيطرة الحد الأدنى من المروج ، والتي لا تقود تعبيرا مهما من تلقاء نفسها ، لدراسة أنماط نشاط تسلسل محسن المرشح في دماغ الفأر. يتم تسليم بناء مراسل معبأ AAV إلى دماغ الفأر وحضنه لمدة 1-4 أسابيع ، وبعد ذلك يتم التضحية بالحيوان ، ويتم ملاحظة أقسام الدماغ تحت المجهر. يظهر EGFP في الخلايا التي يكون فيها المحسن الذي تم اختباره كافيا لبدء التعبير الجيني ، مع تحديد الموقع ومرحلة النمو التي ينشط فيها المحسن في الدماغ. إن طرق الاستنساخ القياسية ، وتغليف AAV منخفض التكلفة ، وتوسيع الأنماط المصلية AAV وطرق التوصيل في الجسم الحي وقراءات التصوير القياسية تجعل هذا نهجا متاحا لدراسة كيفية تنظيم التعبير الجيني في الدماغ.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المعززات هي عناصر تنظيمية جينومية لرابطة الدول المستقلة تعمل كمواقع ربط عامل النسخ ويمكنها دفع التعبير عن الجين المستهدف بطريقة محددة زمانيا مكانيا 1,2. وهي نشطة بشكل تفاضلي في أنواع الخلايا والأنسجة ومراحل التطور المختلفة ويمكن أن تكون ركائز للاختلاف الجينومي المرتبط بمخاطر المرض 3,4. وبالتالي ، فإن الحاجة إلى فهم ديناميكيات وظيفة المحسن أمر بالغ الأهمية للتقدم في كل من التطبيقات العلمية الانتقالية والأساسية في علم الجينوم. في السيليكو ، يمكن أن تكون تنبؤات نشاط المحسن بمثابة موارد ممتازة لتوليد فرضيات حول قدرة المحسن ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على هذا البروتوكول من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية بجامعة كاليفورنيا في ديفيس (البروتوكول # 22339) ولجنة السلامة الأحيائية المؤسسية بجامعة كاليفورنيا في ديفيس (BUA-R1903). تم اختبار هذا البروتوكول على الفئران C57BL / 6J من كلا الجنسين في يوم ما بعد الولادة 0-1.

1. استنساخ تسلسل مرشح محسن في البلازميد المتجه AAV.

ملاحظة: يتم إعطاء البروتوكولات التمثيلية ، ولكن استراتيجية الاستنساخ لديها درجة عالية من المرونة.

  1. حدد أو صمم بناء المراسل. هنا ، يتم إدخال مرشح المحسن في المنطقة غير المترجمة 3 '(UTR) لجين مراسل EGFP ، والذي يتم التعبير عنه تحت سيطرة المروج الأدنى Hsp6....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باستخدام هذه الطرق ، تم اختبار تسلسل 915 bp في الإنترون الثالث المرتبط بالمخاطر النفسية للجين CACNA1C19،49،50 لنشاط محسن في دماغ الفأر بعد الولادة. تم اكتشاف هذا التسلسل في MPRA من 345 تسلسلا محسنا مرشحا يركز على المخاطر النفسية والعصبية SNPs12 ويتم وصف تجارب التوصيف هنا كمثال عام. تم حقن الفئران C57BL / 6 في P0 مع بنية AAV9 معبأة كناقل مكمل ذاتيا51 يحتوي على EGFP تحت سيطر.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول طريقة قائمة على rAAV لنشر جينات التحوير التي يحركها المحسن في دماغ الفأر بعد الولادة. في هذا البروتوكول المعمم ، يتم استنساخ محسن مرشح ، ومروج بسيط ، وجين مراسل ، وتسلسل باركود اختياري في العمود الفقري البلازميد AAV. يمكن إجراء هذه التجارب باستخدام تسلسل محسن مرشح واحد أو باستخدام العديد من التسلسلات بالتوازي. يتم تعبئة البلازميد في rAAV وتسليمه إلى دماغ الفأر بعد الولادة. بعد فترة من الوقت للسماح بنقل الفيروس ، يتم جمع الدماغ وتصويره للتعبير الجيني للمراسل. يتم تضمين فيروس المراسل المعبر عنه بشكل أساس.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إجراء التسلسل في مركز تقنيات الحمض النووي بجامعة كاليفورنيا في ديفيس. نشكر مختبر لين تيان في جامعة كاليفورنيا في ديفيس على التدريب على تغليف rAAV وإهدائنا بسخاء مساعد AAV وبلازميدات مندوب / غطاء. تم دعم هذا العمل من قبل NIH / NIGMS R35GM119831.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10x Citrate BufferSigma-AldrichC9999-1000ML
5'-gatcactctcggcatggac-3'تقنياتالحمض النووي المتكاملةN / A:برايمر أمامي مصمم خصيصا للتحقق من المستنسخة بعد التحويل. هذه البادئات خاصة بالناقل المستخدم وقد تم تصميمها للمتجه المحدد المستخدم في تجاربنا.
5'-gatggctggcaactagaagg-3'تقنياتالحمض النووي المتكاملةN / A:برايمر عكسي مصمم خصيصا للتحقق من المستنسخة بعد التحويل. هذه البادئات خاصة بالناقل المستخدم وقد تم تصميمها للمتجه المحدد المستخدم في تجاربنا.
الشفاط AgaroseVWRVWRVN605-500G
Sigma-AldrichA5177-5EAللتوصيل عن طريق الفم
لأطباق بتري البكتريولوجيةrAAV Thermo Fisher Scientific08-757-100D
CarbenicillinSigma-AldrichC1389-5G
Chicken IgY anti-GFPThermo Fisher ScientificA10262
المجهر متحد البؤرZeissLSM900تم التقاط الصور على طراز LSM800 ، لكن Zeiss أطلقت طراز LSM900 في السنوات الأخيرة ليحل محل LSM800.
أنابيب الطرد المركزي المخروطية 15 ملثيرمو فيشر العلمي12-565-269
CryomoldsThermo Fisher ScientificNC9806558هذه القوالب مناسبة لدماغ الفأر P28. قد تكون الأحجام الأخرى أكثر ملاءمة للأنسجة الكبيرة أو الأصغر.
DAPISigma-AldrichD9542-10MG
مقص تشريح ، 4.5 بوصةVWR82027-578
حمار مضاد للدجاج AlexaFlour-488Jackson ImmunoResearch703-545-155
Dulbecco's PBS 1xThermo Fisher ScientificMT21031CV
أنابيب الطرد المركزي الدقيقة Eppendorf 2.0 ملThermo Fisher Scientific22431048
Falcon أنابيب مستديرة القاع 14 ملThermo Fisher Scientific352059
صبغة خضراء سريعةGraingerF0099-1G
مجموعة فرش الطلاء بالتفاصيلالدقيقة Artbrush TowerB014GWCLFO
Gibson Assembly Master MixNEBE2611S
أنابيب شعرية زجاجيةشركة دروموند العلمية5-000-2005
HiSpeed Plasmid Maxi KitQIAGEN12663طقم إعداد ماكسي للبلازميد التجاري
HyClone HyPure Molecular Biology Grade WaterVWRSH30538.03
IV مجموعة ضخ الفراشة مع أنابيب مقاس 12 بوصة وإبرة 25 جرامThermo Fisher Scientific26708
KimwipesKimberly Clark34155مسح LB Agar
خال من الوبرThermo Fisher ScientificBP1425-500LB أجار المزيج المسبق للوسائط الانتقائية
McPherson Vannas مقص قزحيةIntegra LifeSciences360-215
الزيوت المعدنيةSigma Life Science69794-500ML
NEB مستقرة المختصة الإشريكية القولونيةNEBC3040I
NucleoSpin Gel و PCR Clean-UpTakara740609.5Kit للتفاعل الأنزيمي التنظيف واستخراج الجل
OCT متوسطVWR25608-930
شاكر مداريكول بارمر60-100
بارافورمالدهايدسيجما-ألدريتش158127-500G
أنابيب شريط PCR 0.2 ملVWR490003-692
مضخة تمعجيةجيلسونF155005
ملحي مخزن الفوسفات (PBS) 10xThermo Fisher Scientific70011044
Phusion Hot Start II عالي الدقة DNA PolymeraseThermo Fisher ScientificF549L
حليب مجففSunny Select
ProLong Gold AntifadeMountant Thermo Fisher ScientificP36934
QIAquick PCR PurificationKit QIAGEN28106
rCutSmart BufferNEBB6004SBuffer لهضم التقييد مع PacI و AscI و XmaI
إنزيم التقييد: AscINEBR0558L
إنزيم التقييد: PacINEBR0547L
إنزيم التقييد: XmaINEBR0180L
SOC الناتج المتوسطNEBB0920Sوسط الاسترداد بعد التحول
السكروز ( RNase / DNase مجاني)Millipore Sigma033522.5KG
TAE bufferApex20-194
نقل الأنابيبجيلسونF1179941للمضخة التمعجية
Triton X100Sigma-AldrichX100-100ML
Wizard Plus SV Minipreps نظام تنقية الحمضالنووي Thermo Fisher ScientificA1460طقم إعداد صغير للبلازميد
تجميعات أنبوب محلول

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pennacchio, L. A., et al. In vivo enhancer analysis of human conserved non-coding sequences. Nature. 444 (7118), 499-502 (2006).
  2. Nord, A. S., et al. Rapid and pervasive changes in genome-wide enhancer usage during mammalian development. Cell.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

AAV DeliveryEnhancer TestingMouse BrainReporter ConstructEGFP ExpressionIn Vivo ExpressionGibson CloningBrain InjectionFluorescence ImagingSingle Cell RNA Sequencing

Related Articles