ترتبط الضامة المرتبطة بالورم (TAM) الشبيهة ب M2 بتطور الورم وضعف التكهن في السرطان. يعمل هذا البروتوكول كدليل مفصل للتمييز والاستقطاب بشكل مستنسخ بين الخلايا الشبيهة بخلايا THP-1 الأحادية في الضامة الشبيهة ب M2 في غضون 14 يوما. هذا النموذج هو الأساس للتحقيق في الآثار المضادة للالتهابات من تام داخل البيئة الدقيقة الورم.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التمايز الماكروفياج والاستقطاب إلى النمط الظاهري M2 مثل باستخدام الإنسان Monocyte مثل THP-1 خط خلايا سرطان الدم
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الضامة المرتبطة بالورم (TAM) يمكن تبديل التعبير والسيتوكين الشخصي وفقا للمحفزات الخارجية. هذه اللدونة الرائعة تمكن TAM من التكيف مع التغيرات المستمرة داخل البيئة الدقيقة للورم. الضامة يمكن أن يكون إما في المقام الأول الموالية للالتهابات (M1 مثل) أو المضادة للالتهابات (M2 مثل) الصفات ويمكن التبديل باستمرار بين هاتين الولايتين الرئيسيتين. ترتبط الضامة الشبيهة ب M2 داخل بيئة الورم بتطور السرطان وضعف التكهن في عدة أنواع من السرطان. وتستخدم العديد من الطرق المختلفة لتحفيز التمايز والاستقطاب من الخلايا THP-1 للتحقيق في الآليات الخلوية وبين الخلايا وآثار تام داخل البيئة الدقيقة للأورام. حاليا، لا يوجد نموذج راسخ للاستقطاب الضامة M2 مثل باستخدام خط الخلية THP-1، ونتائج التعبير وملامح السيتوكين من الضامة بسبب بعض المحفزات في المختبر تختلف بين الدراسات. يعمل هذا البروتوكول كإرشادات مفصلة للتمييز بين الخلايا الشبيهة بالخلايا الأحادية THP-1 إلى الضامة M0 وزيادة استقطاب الخلايا إلى النمط الظاهري الشبيه ب M2 في غضون 14 يوما. نحن نظهر التغيرات المورفولوجية للخلايا الشبيهة بالخلايا الأحادية THP-1 ، الضامة المتمايزة ، والكوائش المستقطبة الشبيهة ب M2 باستخدام المجهر الخفيف. هذا النموذج هو الأساس لنماذج خط الخلية التحقيق في الآثار المضادة للالتهابات من TAM وتفاعلاتها مع مجموعات الخلايا الأخرى من البيئة الدقيقة الورم.
المقدمة
الضامة المرتبطة بالورم (TAM) ودورها في الالتهاب المزمن ، وظهور السرطان ، وتطور الورم هي أهداف مهمة في الأبحاث الحديثة1،2. الخلايا الأحادية الدم الطرفية التي يتم تجنيدها إلى البيئة الدقيقة الأنسجة من الورم النامية تفرق إلى الضامة ويمكن استقطابها إلى نوعين فرعيين رئيسيين من الضامة3. يمثل الماكروفاج المنشط كلاسيكيا النمط الظاهري المؤيد للالتهابات في المقام الأول M1 ، ويظهر النوع الفرعي المنشط بدلا من M2 خصائص مضادة للالتهابات في الغالب4. الضامة يمكن التبديل بشكل حيوي بين هذين النمطين الظاهريين الرئيسيين اعتمادا على التمثيل الغذائي الخلوي، مع الأنواع الفرعية المتوسطة....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: يتم عرض نظرة عامة على الخطوات الموضحة في هذا البروتوكول في الشكل 1. تم شراء خط خلايا سرطان الدم البشري الشبيه بالخلايا الأحادية THP-1. تم إجراء تحليل تكرار ترادفي قصير لمصادقة خط الخلية THP-1. تنفيذ جميع الخطوات في ظل ظروف معقمة. ينمو خط الخلية أحادية الكيسة THP-1 في التعليق ولا يلتصق بأسطح زراعة الخلايا. يمكن أن يحدث الالتزام عن طريق التمييز بين الخلايا الأحادية في خلايا تشبه الضامة من خلال ، على سبيل المثال ، الإجهاد الميكانيكي أو علاج محدد مع PMA.
1. زراعة وصيانة الخلايا التي تشبه الخلايا الأحادية THP-1
- تعيين مؤقت لمدة 150 ثانية. إزالة القارورة المجمدة التي تحتوي على خط الخلية THP-....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تم توصيف الضامة الشبيهة ب M2 ، وتم التحقق من صحة M2-الاستقطاب باستخدام قياس التدفق الخلوي لعلامات مجموعة التمايز (CD) CD14 و CD11b و CD80 (علامة تشبه M1) و CD206 (علامة تشبه M2). تم إجراء تلطيخ قياس التدفق الخلوي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تم غسل الضامة مع PBS /5٪ FBS واحتضانها مع كتلة مستقبلات Fcγ لتجنب الربط غير المحدد. ثم لطخت الخلايا مع FITC-المقترنة الماوس المضادة للإنسان CD14 وCD80 الأجسام المضادة، مع PE-المقترنة الماوس المضادة للأجسام المضادة CD11b الإنسان، ومع PE-جنبا إلى جنب الماوس المضادة للإنسان CD206 الأجس.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يوفر هذا البروتوكول الخاص بتمايز واستقطاب الخلايا الشبيهة بالخلايا الأحادية THP-1 في غضون 14 يوما طريقة للحصول على الضامة ذات النمط الظاهري المتميز الشبيه ب M2 بسبب حضانة العلاج الطويلة للخلايا ذات فترات الراحة الكافية بين الخطوات.
بعض الخطوات هامة لهذا البروتوكول. مضاعفة الوقت من الخلايا الأحادية THP-1 هو ما يقرب من 26 ساعة. يمكن تقسيم الخلايا عند كثافة خلايا 9 × 105/mL ويجب أن تكون مصنفة بكثافة 3 × 105/ مل أثناء كل انقسام. يمكن إجراء الانقسام دون إزالة جميع الخلايا المس.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ولا يعلن صاحبا البلاغ عن أي تضارب محتمل في المصالح.
شكر وتقدير
معهد برايس للبحوث الجراحية، جامعة لويز فيل، مدعوم ماليا من قبل جون دبليو برايس وباربرا قوة الدفع أتوود برايس ترست. ولم يكن لمصادر التمويل أي دور في تصميم الدراسة وتنفيذها وكذلك في جمع البيانات وإدارتها وتحليلها وتفسيرها.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 0.4٪ تريبان بلو | VWR ، رادنور ، الولايات المتحدة الأمريكية | 152-5061 | |
| 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي الدقيق | الولايات المتحدة الأمريكية العلمية ، أوكالا ، الولايات المتحدة الأمريكية | 1615-5510 | |
| 10 مل ماصة مصلية | VWR ، رادنور ، الولايات المتحدة الأمريكية | ؛ 89130-898 | |
| 1000 & L TipOne نصائح ماصة | الولايات المتحدة الأمريكية العلمية ، أوكالا ، الولايات المتحدة الأمريكية | 1111-2821 | |
| 15 مل & nbsp ؛ أنبوب الطرد المركزي | VWR ، رادنور ، الولايات المتحدة الأمريكية | 89039-664 | |
| 20 & L TipOne نصائح ماصة | الولايات المتحدة الأمريكية العلمية ، أوكالا ، الولايات المتحدة الأمريكية | 1120-1810 | |
| 200 مو ؛ L TipOne نصائح ماصة | الولايات المتحدة الأمريكية العلمية ، أوكالا ، الولايات المتحدة الأمريكية | 1120-8810 | |
| 25 مل ماصة مصلية | VWR ، رادنور ، الولايات المتحدة الأمريكية | & nbsp ؛ 89130-900 | |
| 5 مل ماصة مصلية | VWR, Radnor, الولايات المتحدة الأمريكية& | nbsp; 89130-896 | |
| 50 مل أنبوب الطرد المركزي | VWR ، رادنور ، الولايات المتحدة الأمريكية | 89039-662 | |
| محلول Accutase 500 مل | Sigma ، سانت لويس ، الولايات المتحدة الأمريكية | A6964 | |
| محلول مضاد حيوي مضاد للفطريات (100x) ، مستقر | سيجما ، سانت لويس ، الولايات المتحدة الأمريكية | A5955-100 مل | مع 10,000 وحدة بنسلين ، 10 مجم من الستربتومايسين و 25 & mu ؛ ز من الأمفوتريسين ب لكل مل ، مفلتر معقم ، كاشف حيوي ، مناسب لزراعة الخلايا |
| حاضنة CO2 الموثق | VWR ، رادنور ، الولايات المتحدة الأمريكية | C170-ULE3 | |
| قارورة CytoOne T-75 سم مع غطاء مرشح | الولايات المتحدة الأمريكية العلمية ، أوكالا ، الولايات المتحدة الأمريكية | CC7682-4875 | |
| Dulbecco ' s محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) | سيجما ، سانت لويس ، الولايات المتحدة الأمريكية | D8537-500 مل | PBS بدون كلوريد الكالسيوم وكلوريد المغنيسيوم ، حيث يمكن أن يغير كلاهما استقطاب البلاعم |
| جهاز طرد مركزي Eppendorf 5804 R (مبرد) | Eppendorf ، Enfield ، الولايات المتحدة الأمريكية | - | |
| الكحول الإيثيلي (70٪) | - | ||
| FACSCalibur مقياس التدفق | BD Biosciences ، سان دييغو ، الولايات المتحدة الأمريكية | - | يعمل مقياس التدفق الخلوي مع برنامج CellQuest (BD Biosciences) |
| Falcon 24-well plate | VWR ، Radnor ، الولايات المتحدة الأمريكية | 353504 | |
| مصل الأبقار الجنيني (FBS) | ATCC ، ماناساس ، الولايات المتحدة الأمريكية | 30-2020 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD14 | BD Biosciences ، سان دييغو ، الولايات المتحدة الأمريكية | 555397 | قياس التدفق الخلوي ، علامة الخلايا النخاعية (100 اختبار) |
| FITC Mouse Anti-Human CD80 | BD Pharmingen ، سان دييغو ، الولايات المتحدة الأمريكية | 557226 | قياس التدفق الخلوي ، علامة M1 (100 اختبار) FITC |
| Mouse IgG1 & kappa ؛ التحكم في النمط المتماثل | BD Pharmingen ، سان دييغو ، الولايات المتحدة الأمريكية | 555748 | قياس التدفق الخلوي ، التحكم في النمط المتماثل ل CD80 (100 اختبار) |
| FITC Mouse IgG2a ، & kappa ؛ التحكم في النمط المتشابه | BD Biosciences ، سان دييغو ، الولايات المتحدة الأمريكية | 553456 | قياس التدفق الخلوي ، التحكم في النمط النظيري ل CD14 (100 اختبار) |
| Human BD Fc Block | BD Biosciences ، سان دييغو ، الولايات المتحدة الأمريكية | 564220 | قياس التدفق الخلوي ، كتلة Fc (0.25 مجم) |
| إنترلوكين بشري 13 (IL-13) | R & د ، مينيابوليس ، الولايات المتحدة الأمريكية | IL-771-10 & mu ؛ ز | |
| إنترلوكين بشري 4 (IL-4) | R & د ، مينيابوليس ، الولايات المتحدة الأمريكية | SRP3093-20 & مو ؛ ز | |
| خزانة السلامة الحيوية Labconco (سلسلة دلتا 36212/36213) | Labconco ، كانساس سيتي ، الولايات المتحدة الأمريكية | محلول | |
| L-Glutamine ، 200 ملي مولار | ATCC ، ماناساس ، الولايات المتحدة الأمريكية | 30-2214 | |
| عديد السكاريد الدهني (LPS) من الإشريكية القولونية 0111: B4 | سيجما ، سانت لويس ، الولايات المتحدة الأمريكية | L2630-100 مجم | |
| كاشطات الخلايا الصغيرة | Biotium ، فريمونت ، الولايات المتحدة الأمريكية | 22003 | |
| Neubauer مقياس الدم | فيشر العلمي ، والثام ، الولايات المتحدة الأمريكية | 02-671-5 | |
| نيكون كسوف المقلوب المجهر TS100 | نيكون ، ميلفيل ، الولايات المتحدة الأمريكية | - | |
| ماء خال من نوكلياز | إنفيتروجين ، كارلسباد ، الولايات المتحدة الأمريكية | AM9937 | |
| أوليمبوس مجهر خفيف RH-2 | مجهر سنترال ، فيسترفيل ، الولايات المتحدة الأمريكية | 40888 | |
| P10 ماصة متغيرة- جيلسون | VWR ، رادنور ، الولايات المتحدة الأمريكية | 76180-014 | |
| P1000 متغير ماصة - جيلسون | VWR ، رادنور ، الولايات المتحدة الأمريكية | 76177-990 | |
| P200 ماصة متغيرة - جيلسون | VWR ، رادنور ، الولايات المتحدة الأمريكية | 76177-988 | |
| PE Mouse Anti-Human CD11b | BD Biosciences ، سان دييغو ، الولايات المتحدة الأمريكية | 555388 | قياس التدفق الخلوي ، علامة الخلية النخاعية (100 اختبار) PE |
| Mouse IgG1 ، & kappa ؛ التحكم في النمط المتشابه | BD Biosciences ، سان دييغو ، الولايات المتحدة الأمريكية | 555749 | قياس التدفق الخلوي ، التحكم في النمط النظير ل CD11b (100 اختبار) |
| PE-Cy 5 Mouse Anti-Human CD206 | BD Pharmingen ، سان دييغو ، الولايات المتحدة الأمريكية | 551136 | قياس التدفق الخلوي ، علامة M2 (100 اختبار) |
| PE-Cy 5 Mouse IgG1 & kappa ؛ التحكم في النمط المتماثل | BD Pharmingen ، سان دييغو ، الولايات المتحدة الأمريكية | 555750 | التدفق الخلوي ، التحكم في النمط النظيري ل CD206 (100 اختبار) |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma ، سانت لويس ، الولايات المتحدة الأمريكية | P8139 | |
| ماصة Powerpette Plus | VWR ، رادنور ، الولايات المتحدة الأمريكية | 75856-448 | |
| حمام مائي دقيق (موديل 183) | Precision Scientific ، شيكاغو ، الولايات المتحدة الأمريكية | 66551 | |
| RPMI-1640 ATCC | متوسط ، ماناساس ، الولايات المتحدة الأمريكية | 30-2001 | |
| THP-1 خط الخلايا ، مجموعة الثقافة الأمريكية (ATCC) | ATCC ، ماناساس ، الولايات المتحدة الأمريكية | TIB-202 |
المراجع
- Zhang, R., et al. Cancer-associated fibroblasts enhance tumor-associated macrophages enrichment and suppress NK cells function in colorectal cancer. Cell Death and Disease. 10 (4), 273(2019).
- Wang, J., Li, D., Cang, H., Guo, B.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
