مقالة منهجية

التمايز الماكروفياج والاستقطاب إلى النمط الظاهري M2 مثل باستخدام الإنسان Monocyte مثل THP-1 خط خلايا سرطان الدم

31.6K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/62652

⸱

أغسطس 2, 2021

 ,  ,  ,  , 
1Price Institute of Surgical Research, Department of Surgery, University of Louisville

في هذه المقالة

ملخص

ترتبط الضامة المرتبطة بالورم (TAM) الشبيهة ب M2 بتطور الورم وضعف التكهن في السرطان. يعمل هذا البروتوكول كدليل مفصل للتمييز والاستقطاب بشكل مستنسخ بين الخلايا الشبيهة بخلايا THP-1 الأحادية في الضامة الشبيهة ب M2 في غضون 14 يوما. هذا النموذج هو الأساس للتحقيق في الآثار المضادة للالتهابات من تام داخل البيئة الدقيقة الورم.

الملخص

الضامة المرتبطة بالورم (TAM) يمكن تبديل التعبير والسيتوكين الشخصي وفقا للمحفزات الخارجية. هذه اللدونة الرائعة تمكن TAM من التكيف مع التغيرات المستمرة داخل البيئة الدقيقة للورم. الضامة يمكن أن يكون إما في المقام الأول الموالية للالتهابات (M1 مثل) أو المضادة للالتهابات (M2 مثل) الصفات ويمكن التبديل باستمرار بين هاتين الولايتين الرئيسيتين. ترتبط الضامة الشبيهة ب M2 داخل بيئة الورم بتطور السرطان وضعف التكهن في عدة أنواع من السرطان. وتستخدم العديد من الطرق المختلفة لتحفيز التمايز والاستقطاب من الخلايا THP-1 للتحقيق في الآليات الخلوية وبين الخلايا وآثار تام داخل البيئة الدقيقة للأورام. حاليا، لا يوجد نموذج راسخ للاستقطاب الضامة M2 مثل باستخدام خط الخلية THP-1، ونتائج التعبير وملامح السيتوكين من الضامة بسبب بعض المحفزات في المختبر تختلف بين الدراسات. يعمل هذا البروتوكول كإرشادات مفصلة للتمييز بين الخلايا الشبيهة بالخلايا الأحادية THP-1 إلى الضامة M0 وزيادة استقطاب الخلايا إلى النمط الظاهري الشبيه ب M2 في غضون 14 يوما. نحن نظهر التغيرات المورفولوجية للخلايا الشبيهة بالخلايا الأحادية THP-1 ، الضامة المتمايزة ، والكوائش المستقطبة الشبيهة ب M2 باستخدام المجهر الخفيف. هذا النموذج هو الأساس لنماذج خط الخلية التحقيق في الآثار المضادة للالتهابات من TAM وتفاعلاتها مع مجموعات الخلايا الأخرى من البيئة الدقيقة الورم.

المقدمة

الضامة المرتبطة بالورم (TAM) ودورها في الالتهاب المزمن ، وظهور السرطان ، وتطور الورم هي أهداف مهمة في الأبحاث الحديثة1،2. الخلايا الأحادية الدم الطرفية التي يتم تجنيدها إلى البيئة الدقيقة الأنسجة من الورم النامية تفرق إلى الضامة ويمكن استقطابها إلى نوعين فرعيين رئيسيين من الضامة3. يمثل الماكروفاج المنشط كلاسيكيا النمط الظاهري المؤيد للالتهابات في المقام الأول M1 ، ويظهر النوع الفرعي المنشط بدلا من M2 خصائص مضادة للالتهابات في الغالب4. الضامة يمكن التبديل بشكل حيوي بين هذين النمطين الظاهريين الرئيسيين اعتمادا على التمثيل الغذائي الخلوي، مع الأنواع الفرعية المتوسطة وجود كل من الصفات الالتهابية والمضادة للالتهابات5. يمثل TAM مجموعة غير متجانسة من كلا النمطين الظاهريين. ومع ذلك ، فإن وظيفة تعزيز الورم وضعف التكهن في أنواع مختلفة من السرطانات ترتبط بشكل خاص بال الضامة الشبيهة ب M26و7و8.

الملامح الوظيفية لل الضامة وتفاعلها مع الخلايا الأخرى داخل البيئة الدقيقة الورم معقدة وصعبة لالتقاط في بيئة متغيرة باستمرار خلال تطور الورم المستمر. يمكن أن توفر خطوط الخلية مجموعة خلايا متجانسة مع قابلية مستقرة للحياة في الثقافة ، والتي يمكن أن تسهل عملية إظهار آليات خلوية وبين الخلايا المحددة. خط الخلية THP-1 الشبيه بالخلايا الأحادية هو نظام نموذج مشروع للخلايا الأحادية البشرية الأولية9. وقد تم الحصول على هذا الخط الخلية خلدت تلقائيا من الدم المحيطي لطفل رضيع يبلغ من العمر سنة واحدة مع سرطان الدم الأحادي الحاد9,10. تم الإبلاغ عن التمايز والاستقطاب من خلايا THP-1 من قبل العديد من الدراسات وتم تنفيذها بطرق مختلفة متعددة11،12،13،14. التنشيط ، وبالتالي ، فإن استقطاب الضامة إلى النمط الظاهري الشبيه ب M1 يتبعه آلية ارتداد تعويضية مضادة للالتهابات ، وتعزيز النمط الظاهري الشبيه ب M2 من خلال السيتوكينات التي تنتجها الضامة الالتهابية ، مثل interleukin 6 (IL-6) أو15،16. قد يكون هذا بمثابة آلية كسر لتوهين استجابة التهابية زائدة بعد تنشيط الخلية17. عملية التفريق والاستقطاب monocytes و THP-1 الخلايا الأحادية مثل في النمط الظاهري المضادة للالتهابات M2 مثل هو في حد ذاته يرافقه أيضا المحفزات الموالية للالتهابات التي يجب التغلب عليها. يمكن أن يكون سبب استجابة السيتوكين الالتهابي الإجهاد الميكانيكي18، مثل تغيير الوسائط لإعادة تغذية الخلايا ، أو إضافة مركبات كيميائية للتمييز بين خلايا THP-1 ، مثل phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) ، والحث على إنتاج عامل نخر الورم α (TNFα) ، إنترلوكين 1β (IL-1β) أو IL-619. هذا تغيير التشكيل الجانبي التعبير السيتوكين كاستجابة لPMA يمكن أن تؤثر على ومنع الاستقطاب الضامة اللاحقة20. فترات الراحة الكافية، كما ذكرت من قبل بعد العلاج PMA، تسمح لهذه الاستجابات الالتهابية لتقليل وتسهيل استقطاب الخلايا إلى النمط الظاهري M2 مثلمتميزة 21.

يوضح هذا البروتوكول طريقة لتمييز واستقطاب الخلايا الشبيهة بالخلايا الأحادية THP-1 إلى نمط الظاهري الشبيه ب M2 من الضامة في غضون 14 يوما.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ملاحظة: يتم عرض نظرة عامة على الخطوات الموضحة في هذا البروتوكول في الشكل 1. تم شراء خط خلايا سرطان الدم البشري الشبيه بالخلايا الأحادية THP-1. تم إجراء تحليل تكرار ترادفي قصير لمصادقة خط الخلية THP-1. تنفيذ جميع الخطوات في ظل ظروف معقمة. ينمو خط الخلية أحادية الكيسة THP-1 في التعليق ولا يلتصق بأسطح زراعة الخلايا. يمكن أن يحدث الالتزام عن طريق التمييز بين الخلايا الأحادية في خلايا تشبه الضامة من خلال ، على سبيل المثال ، الإجهاد الميكانيكي أو علاج محدد مع PMA.

1. زراعة وصيانة الخلايا التي تشبه الخلايا الأحادية THP-1

  1. تعيين مؤقت لمدة 150 ثانية. إزالة القارورة المجمدة التي تحتوي على خط الخلية THP-1(جدول المواد)من النيتروجين السائل وتذوب على الفور في حمام مياه نظيفة (37 درجة مئوية). بدء تشغيل جهاز ضبط الوقت بمجرد وضع القارورة في حمام الماء. تخفيف الغطاء للافراج عن الضغط الذي يتراكم بسبب عملية ذوبان ولكن تأكد من أن فتح أنبوب لا يتصل بالماء، لتجنب التلوث. الفترة الزمنية المثلى لإذابة الخلايا تقع بين 120-150 s. مواصلة ذوبان تعليق الخلية حتى يتم ترك رقاقة الجليد من حجم حوالي 4 ملم داخل القارورة. ثم انتقل إلى الخطوة التالية فورا.
  2. نقل المرحلة السائلة من تعليق الخلية إلى أنبوب 15 مل يحتوي على 9 مل من وسائل الإعلام الدافئة (37 درجة مئوية) النمو(جدول المواد). ثم، نقل 1 مل من تعليق الخلايا المتوسطة الدافئة في قارورة THP-1 والعودة إلى أنبوب 15 مل لإذابة رقاقة الثلج المتبقية وتدفق القارورة لضمان عدم ترك أي خلايا وراءها.
  3. اخلط التعليق برفق عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا مع ماصة 1000 ميكرولتر. إزالة عينة صغيرة (حوالي 10 ميكرولتر) لحساب الخلايا من أجل البقاء (باستخدام تريبان الأزرق للاستبعاد) في حين أنها نسج. قم بتدفير تعليق الخلية الدافئ عند 200 × ز لمدة 7 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  4. إزالة supernatant تماما وإعادة الإنفاق مع حجم معين من المتوسطة النمو الدافئ لتحقيق كثافة الخلية من 5 × 105/ مل. مزيج تعليق بلطف ونقل 22 مل من حجم في قوارير T-75 ثقافة الخلية (جدول المواد). تخزين قوارير تستقيم في حاضنة في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون (CO2)تركيز. تبادل وسائل الإعلام النمو كل 3-4 أيام.

2. البذر من THP-1 الخلايا والتمايز في الضامة M0

  1. إعداد الخلية التي تحتوي على متوسط النمو مع كثافة الخلية المعنية لخلايا البذور في كثافة 3 × 105/ مل / جيدا في لوحات ثقافة الخلية 24 جيدا (جدول المواد). مزيج المتوسطة بلطف وإعداد aliquots من 26 مل، وضعت كل في أنبوب 50 مل. استخدام كل 26 مل aliquot لزرع الخلايا في لوحة كل منها.
  2. نقل 1 مل من الوسط المحتوي على الخلية إلى كل بئر من لوحة 24 جيدا. امزج الوسائط برفق عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا بين عمليات النقل.
  3. إعداد حل المخزون من PMA (حل 1 ملغ من PMA في 100 ميكرولتر من ديميثيل سلفوإكسيد (DMSO) = ~ 16 ملم حل PMA في DMSO) وتمييعه مع الفوسفات البارد العازلة المالحة (PBS) إلى تركيز العمل النهائي من 10 نانوغرام / ميكرول الحق قبل علاج الخلية(جدول المواد). الحفاظ على الحل على الجليد واستخدامه على الفور. لا تقم بإعادة التجميد. إضافة 100 نانوغرام من PMA لكل بئر. دع كل لوحة خلوية تجلس في الحاضنة دون أي علاج آخر لمدة 72 ساعة.
  4. بعد 72 ساعة، وإزالة المتوسطة النمو واستبداله مع 1 مل من متوسط النمو الطازج. لا تلمس الجزء السفلي من الآبار مع نصائح ماصة. دع الخلايا ترتاح لمدة 96 ساعة أخرى في الحاضنة.
  5. بعد 96 ساعة، كرر الخطوة 2.4 (تغيير الوسائط) والسماح للخلايا بقية لمدة 24 ساعة أخرى.
    ملاحظة: الضامة M0 جاهزة الآن لاستخدامها في التجارب (الشكل 2). مباشرة قبل علاج الخلايا كجزء من مزيد من التجارب, النظر في تغيير وسائل الإعلام مع RPMI فقط (جدول المواد) منذ نمو وسائل الإعلام ملاحق يمكن أن يسبب التدخل مع الكواشف التي تضاف لعلاج الخلايا. في حالة الحاجة إلى الضامة M2-like، انتقل إلى القسم 3.

3. استقطاب الضامة M0 إلى الضامة M2 مثل

  1. إعداد محلول المخزون من IL-4 و IL-13 (حل 20 ميكروغرام من IL-4 أو IL-13 في 200 ميكرولتر من المياه الخالية من النيوكليز) وتمييعه إلى تركيز عمل نهائي من 2 نانوغرام / ميكرولتر مع برنامج تلفزيوني مباشرة قبل علاج الخلية. الحفاظ على الحل على الجليد واستخدامه على الفور. لا تقم بإعادة التجميد.
  2. إزالة متوسط النمو واستبداله مع 1 مل من متوسط النمو الطازج. إضافة 20 نانوغرام من إنترلوكين 4 (IL-4) و 20 نانوغرام من إنترلوكين 13 (IL-13) لكل بئر. دع الخلايا ترتاح لمدة 48 ساعة في الحاضنة.
  3. بعد 48 ساعة، كرر الخطوة 3.2. دع الخلايا ترتاح لمدة 48 ساعة أخرى في الحاضنة.
  4. إزالة متوسط النمو واستبداله مع 1 مل من متوسط النمو الطازج. دع الخلايا ترتاح لمدة 48 ساعة في الحاضنة.
    ملاحظة: الضامة M2 تشبه الآن جاهزة للاستخدام للتجارب (الشكل 2). مباشرة قبل التعامل مع الخلايا كجزء من مزيد من التجارب, النظر في تغيير وسائل الإعلام مع RPMI فقط (جدول المواد) منذ نمو وسائل الإعلام ملاحق يمكن أن يسبب التدخل.

4. فصل وحصاد الضامة لتدفق قياس الخلايا

ملاحظة: استخدم طريقة ميكانيكية تجمع بين الصدمة الباردة وكشط الخلايا لفصل وحصاد الضامة المستقطبة من لوحات لقياس التدفق الخلوي.

  1. إزالة المتوسطة الخلية الدافئة واستبداله بمزيج من الجليد الباردة PBS (دون الكالسيوم والمغنيسيوم) و 5٪ مصل البقر الجنيني (FBS)، 1 مل لكل بئر. مباشرة بعد هذا، ضع لوحة الخلية على الجليد لمدة 45 دقيقة. لا تضع لوحة الخلية على الجليد قبل إزالة وسط الخلية الدافئة ، لأن هذا سيقلن من صلاحية الخلية بشكل كبير. إبقاء الخلايا على الجليد فقط بعد إحداث صدمة باردة مع الجليد الباردة PBS/5٪ خليط FBS.
  2. بعد 45 دقيقة على الجليد، كشط قبالة الخلايا باستخدام كاشطات الخلاياالمصغرة( جدول المواد ). نقل بلطف الضامة منفصلة في برنامج تلفزيوني الباردة / 5٪ FBS في أنبوب 15 مل. إبقاء الأنبوب على الجليد في جميع الأوقات حتى يتم تلطيخ الخلايا.
    ملاحظة: تجمع ثمانية آبار من الخلايا للوصول إلى عدد الخلايا الكافية للتلطيخ.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تم توصيف الضامة الشبيهة ب M2 ، وتم التحقق من صحة M2-الاستقطاب باستخدام قياس التدفق الخلوي لعلامات مجموعة التمايز (CD) CD14 و CD11b و CD80 (علامة تشبه M1) و CD206 (علامة تشبه M2). تم إجراء تلطيخ قياس التدفق الخلوي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تم غسل الضامة مع PBS /5٪ FBS واحتضانها مع كتلة مستقبلات Fcγ لتجنب الربط غير المحدد. ثم لطخت الخلايا مع FITC-المقترنة الماوس المضادة للإنسان CD14 وCD80 الأجسام المضادة، مع PE-المقترنة الماوس المضادة للأجسام المضادة CD11b الإنسان، ومع PE-جنبا إلى جنب الماوس المضادة للإنسان CD206 الأجس...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يوفر هذا البروتوكول الخاص بتمايز واستقطاب الخلايا الشبيهة بالخلايا الأحادية THP-1 في غضون 14 يوما طريقة للحصول على الضامة ذات النمط الظاهري المتميز الشبيه ب M2 بسبب حضانة العلاج الطويلة للخلايا ذات فترات الراحة الكافية بين الخطوات.

بعض الخطوات هامة لهذا البروتوكول. مضاعفة الوقت من الخلايا الأحادية THP-1 هو ما يقرب من 26 ساعة. يمكن تقسيم الخلايا عند كثافة خلايا 9 × 105/mL ويجب أن تكون مصنفة بكثافة 3 × 105/ مل أثناء كل انقسام. يمكن إجراء الانقسام دون إزالة جميع الخلايا المس...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن أي تضارب محتمل في المصالح.

شكر وتقدير

معهد برايس للبحوث الجراحية، جامعة لويز فيل، مدعوم ماليا من قبل جون دبليو برايس وباربرا قوة الدفع أتوود برايس ترست. ولم يكن لمصادر التمويل أي دور في تصميم الدراسة وتنفيذها وكذلك في جمع البيانات وإدارتها وتحليلها وتفسيرها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.4٪ تريبان بلوVWR ، رادنور ، الولايات المتحدة الأمريكية152-5061
1.5 مل أنبوب الطرد المركزي الدقيقالولايات المتحدة الأمريكية العلمية ، أوكالا ، الولايات المتحدة الأمريكية1615-5510
10 مل ماصة مصليةVWR ، رادنور ، الولايات المتحدة الأمريكية  ؛ 89130-898
1000 & L TipOne نصائح ماصةالولايات المتحدة الأمريكية العلمية ، أوكالا ، الولايات المتحدة الأمريكية1111-2821
15 مل & nbsp ؛ أنبوب الطرد المركزيVWR ، رادنور ، الولايات المتحدة الأمريكية89039-664
20 & L TipOne نصائح ماصةالولايات المتحدة الأمريكية العلمية ، أوكالا ، الولايات المتحدة الأمريكية1120-1810
200 مو ؛ L TipOne نصائح ماصةالولايات المتحدة الأمريكية العلمية ، أوكالا ، الولايات المتحدة الأمريكية1120-8810
25 مل ماصة مصليةVWR ، رادنور ، الولايات المتحدة الأمريكية& nbsp ؛ 89130-900
5 مل ماصة مصليةVWR, Radnor, الولايات المتحدة الأمريكية  89130-896
50 مل أنبوب الطرد المركزيVWR ، رادنور ، الولايات المتحدة الأمريكية89039-662
محلول Accutase 500 ملSigma ، سانت لويس ، الولايات المتحدة الأمريكيةA6964
محلول مضاد حيوي مضاد للفطريات (100x) ، مستقرسيجما ، سانت لويس ، الولايات المتحدة الأمريكيةA5955-100 ملمع 10,000 وحدة بنسلين ، 10 مجم من الستربتومايسين و 25 & mu ؛ ز من الأمفوتريسين ب لكل مل ، مفلتر معقم ، كاشف حيوي ، مناسب لزراعة الخلايا
حاضنة CO2 الموثقVWR ، رادنور ، الولايات المتحدة الأمريكيةC170-ULE3
قارورة CytoOne T-75 سم مع غطاء مرشحالولايات المتحدة الأمريكية العلمية ، أوكالا ، الولايات المتحدة الأمريكيةCC7682-4875
Dulbecco ' s محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)سيجما ، سانت لويس ، الولايات المتحدة الأمريكيةD8537-500 ملPBS بدون كلوريد الكالسيوم وكلوريد المغنيسيوم ، حيث يمكن أن يغير كلاهما استقطاب البلاعم
جهاز طرد مركزي Eppendorf 5804 R (مبرد)Eppendorf ، Enfield ، الولايات المتحدة الأمريكية-
الكحول الإيثيلي (70٪)-
FACSCalibur مقياس التدفقBD Biosciences ، سان دييغو ، الولايات المتحدة الأمريكية-يعمل مقياس التدفق الخلوي مع برنامج CellQuest (BD Biosciences)
Falcon 24-well plateVWR ، Radnor ، الولايات المتحدة الأمريكية353504
مصل الأبقار الجنيني (FBS)ATCC ، ماناساس ، الولايات المتحدة الأمريكية30-2020
FITC Mouse Anti-Human CD14BD Biosciences ، سان دييغو ، الولايات المتحدة الأمريكية555397قياس التدفق الخلوي ، علامة الخلايا النخاعية (100 اختبار)
FITC Mouse Anti-Human CD80BD Pharmingen ، سان دييغو ، الولايات المتحدة الأمريكية557226قياس التدفق الخلوي ، علامة M1 (100 اختبار) FITC
Mouse IgG1 & kappa ؛ التحكم في النمط المتماثلBD Pharmingen ، سان دييغو ، الولايات المتحدة الأمريكية555748قياس التدفق الخلوي ، التحكم في النمط المتماثل ل CD80 (100 اختبار)
FITC Mouse IgG2a ، & kappa ؛ التحكم في النمط المتشابهBD Biosciences ، سان دييغو ، الولايات المتحدة الأمريكية553456قياس التدفق الخلوي ، التحكم في النمط النظيري ل CD14 (100 اختبار)
Human BD Fc BlockBD Biosciences ، سان دييغو ، الولايات المتحدة الأمريكية564220قياس التدفق الخلوي ، كتلة Fc (0.25 مجم)
إنترلوكين بشري 13 (IL-13)R & د ، مينيابوليس ، الولايات المتحدة الأمريكيةIL-771-10 & mu ؛ ز
إنترلوكين بشري 4 (IL-4)R & د ، مينيابوليس ، الولايات المتحدة الأمريكيةSRP3093-20 & مو ؛ ز
خزانة السلامة الحيوية Labconco (سلسلة دلتا 36212/36213)Labconco ، كانساس سيتي ، الولايات المتحدة الأمريكيةمحلول
L-Glutamine ، 200 ملي مولارATCC ، ماناساس ، الولايات المتحدة الأمريكية30-2214
عديد السكاريد الدهني (LPS) من الإشريكية القولونية 0111: B4سيجما ، سانت لويس ، الولايات المتحدة الأمريكيةL2630-100 مجم
كاشطات الخلايا الصغيرةBiotium ، فريمونت ، الولايات المتحدة الأمريكية22003
Neubauer مقياس الدمفيشر العلمي ، والثام ، الولايات المتحدة الأمريكية02-671-5
نيكون كسوف المقلوب المجهر TS100نيكون ، ميلفيل ، الولايات المتحدة الأمريكية-
ماء خال من نوكليازإنفيتروجين ، كارلسباد ، الولايات المتحدة الأمريكيةAM9937
أوليمبوس مجهر خفيف RH-2مجهر سنترال ، فيسترفيل ، الولايات المتحدة الأمريكية40888
P10 ماصة متغيرة- جيلسونVWR ، رادنور ، الولايات المتحدة الأمريكية76180-014
P1000 متغير ماصة - جيلسونVWR ، رادنور ، الولايات المتحدة الأمريكية76177-990
P200 ماصة متغيرة - جيلسونVWR ، رادنور ، الولايات المتحدة الأمريكية76177-988
PE Mouse Anti-Human CD11bBD Biosciences ، سان دييغو ، الولايات المتحدة الأمريكية555388قياس التدفق الخلوي ، علامة الخلية النخاعية (100 اختبار) PE
Mouse IgG1 ، & kappa ؛ التحكم في النمط المتشابهBD Biosciences ، سان دييغو ، الولايات المتحدة الأمريكية555749قياس التدفق الخلوي ، التحكم في النمط النظير ل CD11b (100 اختبار)
PE-Cy 5 Mouse Anti-Human CD206BD Pharmingen ، سان دييغو ، الولايات المتحدة الأمريكية551136قياس التدفق الخلوي ، علامة M2 (100 اختبار)
PE-Cy 5 Mouse IgG1 & kappa ؛ التحكم في النمط المتماثلBD Pharmingen ، سان دييغو ، الولايات المتحدة الأمريكية555750التدفق الخلوي ، التحكم في النمط النظيري ل CD206 (100 اختبار)
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)Sigma ، سانت لويس ، الولايات المتحدة الأمريكيةP8139
ماصة Powerpette PlusVWR ، رادنور ، الولايات المتحدة الأمريكية75856-448
حمام مائي دقيق (موديل 183)Precision Scientific ، شيكاغو ، الولايات المتحدة الأمريكية66551
RPMI-1640 ATCCمتوسط ، ماناساس ، الولايات المتحدة الأمريكية30-2001
THP-1 خط الخلايا ، مجموعة الثقافة الأمريكية (ATCC)ATCC ، ماناساس ، الولايات المتحدة الأمريكيةTIB-202
الخلوي قياس

المراجع

  1. Zhang, R., et al. Cancer-associated fibroblasts enhance tumor-associated macrophages enrichment and suppress NK cells function in colorectal cancer. Cell Death and Disease. 10 (4), 273(2019).
  2. Wang, J., Li, D., Cang, H., Guo, B. Crosstalk between cancer and immune cells: Role of tumor-associated macrophages in the tumor microenvironment. Cancer Medicine. 8 (10), 4709-4721 (2019).
  3. Soncin, I., et al. The tumor microenvironment creates a niche for the self-renewal of tumor-promoting macrophages in colon adenoma. Nature Communications. 9 (1), 582(2018).
  4. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).
  5. Mazzone, M., Menga, A., Castegna, A. Metabolism and TAM functions-it takes two to tango. Federation of European Biochemical Societies Journal. 285 (4), 700-716 (2018).
  6. Eum, H. H., et al. Tumor-promoting macrophages prevail in malignant ascites of advanced gastric cancer. Experimental and Molecular Medicine. 52 (12), 1976-1988 (2020).
  7. Qian, B. Z., Pollard, J. W. Macrophage diversity enhances tumor progression and metastasis. Cell. 141 (1), 39-51 (2010).
  8. Scheurlen, K. M., Billeter, A. T., O'Brien, S. J., Galandiuk, S. Metabolic dysfunction and early-onset colorectal cancer - how macrophages build the bridge. Cancer Medicine. 9 (18), 6679-6693 (2020).
  9. Bosshart, H., Heinzelmann, M. THP-1 cells as a model for human monocytes. Annals of Translational Medicine. 4 (21), 438(2016).
  10. The American Type Culture Collection (ATCC). , Available from: https://www.atcc.org/products/all/TIB-202.aspx#generalinformation (2021).
  11. Baxter, E. W., et al. Standardized protocols for differentiation of THP-1 cells to macrophages with distinct M(IFNgamma+LPS), M(IL-4), and M(IL-10) phenotypes. Journal of Immunological Methods. 478, 112721(2020).
  12. Genin, M., Clement, F., Fattaccioli, A., Raes, M., Michiels, C. M1 and M2 macrophages derived from THP-1 cells differentially modulate the response of cancer cells to etoposide. BMC Cancer. 15, 577(2015).
  13. Starr, T., Bauler, T. J., Malik-Kale, P., Steele-Mortimer, O. The phorbol 12-myristate-13-acetate differentiation protocol is critical to the interaction of THP-1 macrophages with Salmonella Typhimurium. PLoS One. 13 (3), 0193601(2018).
  14. Lund, M. E., To, J., O'Brien, B. A., Donnelly, S. The choice of phorbol 12-myristate 13-acetate differentiation protocol influences the response of THP-1 macrophages to a pro-inflammatory stimulus. Journal of Immunological Methods. 430, 64-70 (2016).
  15. Yin, Z., et al. IL-6/STAT3 pathway intermediates M1/M2 macrophage polarization during the development of hepatocellular carcinoma. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (11), 9419-9432 (2018).
  16. O'Neill, L. A. J., Artyomov, M. N. Itaconate: the poster child of metabolic reprogramming in macrophage function. Nature Reviews Immunology. 19 (5), 273-281 (2019).
  17. Luig, M., et al. Inflammation-induced IL-6 functions as a natural brake on macrophages and limits gn. Journal of the American Society of Nephrology. 26 (7), 1597-1607 (2015).
  18. Maruyama, K., Nemoto, E., Yamada, S. Mechanical regulation of macrophage function - cyclic tensile force inhibits NLRP3 inflammasome-dependent IL-1beta secretion in murine macrophages. Inflammation and Regeneration. 39, 3(2019).
  19. Gatto, F., et al. PMA-Induced THP-1 Macrophage Differentiation is Not Impaired by Citrate-Coated Platinum Nanoparticles. Nanomaterials (Basel). 7 (10), (2017).
  20. Maess, M. B., Wittig, B., Cignarella, A., Lorkowski, S. Reduced PMA enhances the responsiveness of transfected THP-1 macrophages to polarizing stimuli. Journal of Immunological Methods. 402 (1-2), 76-81 (2014).
  21. Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS One. 5 (1), 8668(2010).
  22. Raggi, F., et al. Regulation of human macrophage M1-M2 polarization balance by hypoxia and the triggering receptor expressed on myeloid cells-1. Frontiers in Immunology. 8, 11097(2017).
  23. Neutelings, T., Lambert, C. A., Nusgens, B. V., Colige, A. C. Effects of mild cold shock (25 degrees C) followed by warming up at 37 degrees C on the cellular stress response. PLoS One. 8 (7), 69687(2013).
  24. Kurashina, Y., et al. Enzyme-free release of adhered cells from standard culture dishes using intermittent ultrasonic traveling waves. Communications Biology. 2, 393(2019).
  25. Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunological Methods. 426, 56-61 (2015).
  26. Bailey, J. D., et al. Isolation and culture of murine bone marrow-derived macrophages for nitric oxide and redox biology. Nitric Oxide. 100-101, 17-29 (2020).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

M2 THP 1 CD14 CD206 4

مقالات ذات صلة