استخدام تحسين الفلورية المستحث بالبروتين الذي تم حله زمنيا لتحديد التركيبات المحلية المستقرة α-Synuclein Monomer في كل مرة

ملخص

الوقت حل واحد جزيء البروتين الناجم عن تعزيز الفلورية هو مفيد مضان مطيافية القرب الاستشعار حساسة للتغيرات الهيكلية المحلية في البروتينات. هنا نظهر أنه يمكن استخدامه للكشف عن تشكيلات محلية مستقرة في α-Synuclein ، والتي تعرف باسم غير منظم وغير مستقر كروي عند قياسه باستخدام مسطرة FRET طويلة المدى.

الملخص

استخدام المساطر الطيفية لتتبع تشكيلات متعددة من الجزيئات الحيوية واحدة ودينامياتها قد أحدثت ثورة في فهم الديناميات الهيكلية ومساهماتها في علم الأحياء. في حين أن المسطرة المستندة إلى FRET تقارير عن المسافات بين الصبغة في نطاق 3-10 نانومتر، تقنيات الطيفية الأخرى، مثل تعزيز الفلورية الناجمة عن البروتين (PIFE)، تقرير عن القرب بين صبغة وسطح البروتين في أقصر 0-3 نانومتر المدى. وبغض النظر عن الطريقة المفضلة، فإن استخدامها في قياس الجزيئات الحيوية المنتشرة بحرية واحدة تلو الثانية يسترجع المدرجات التكرارية للمعلمة التجريبية التي تسفر عن مجموعات فرعية منفصلة موزعة مركزيا من الجزيئات الحيوية، حيث يمثل كل مجموعة فرعية إما تشكيلا واحدا بقي دون تغيير داخل ميلي ثانية، أو تشكيلات متعددة تتقاطع أسرع بكثير من ميلي ثانية، وبالتالي مجموعة فرعية متوسطة. في FRET أحادي الجزيء ، حيث المعلمة المبلغ عنها في المدرجات التكرارية هي كفاءة FRET بين الصبغات ، تم الإبلاغ سابقا عن α بروتين فرعي متوسط واحد من التركيبات المتعددة التي تتشابك بسرعة. في حين أن هذه النتائج السابقة تعتمد على نطاق 3-10 نانومتر من المسطرة القائمة على FRET ، سعينا إلى وضع هذا البروتين على المحك باستخدام PIFE أحادي الجزيء ، حيث نتتبع عمر الفلورية لبروتينات sCy3 المحددة لموقع معين α-Synuclein واحدة في كل مرة. ومن المثير للاهتمام ، وذلك باستخدام هذا أقصر مدى مستشعر القرب الطيفي ، sCy3 المسمى α - Synuclein معارض عدة مجموعات فرعية مدى الحياة مع مختلفة بوضوح متوسط العمر التي تتقاطع في 10-100 مللي ثانية. وتبين هذه النتائج أنه على الرغم من أن α سينوكلين قد يكون مضطربا على الصعيد العالمي، فإنه يحقق مع ذلك هياكل محلية مستقرة. باختصار، في هذا العمل نسلط الضوء على ميزة استخدام أجهزة استشعار القرب الطيفية المختلفة التي تتبع التغيرات الهيكلية المحلية أو العالمية الجزيئات الحيوية واحد في وقت واحد.

المقدمة

على مدى العقدين الماضيين، أصبحت الأساليب القائمة على مضان جزيء واحد أداة قوية لقياس الجزيئات الحيوية^1،2، والتحقيق في كيفية توزيع المعلمات الجزيئية الحيوية المختلفة وكذلك كيف أنها تتقاطع ديناميكيا بين المجموعات الفرعية المختلفة من هذه المعلمات في قرار sub-millisecond^3،4،5. المعلمات في هذه التقنيات تشمل كفاءة نقل الطاقة في قياسات FRET ⁶,⁷, مضان anisotropy^8,9, مضان غلة الكم والعمر^10,11, كدالة من مختلف مضان إخماد¹² أو تعزيز¹³ آليات. واحدة من هذه الآليات، والمعروفة باسم تحسين الفلورية الناجمة عن البروتين (PIFE)¹⁴ يقدم تعزيز العائد الكم الفلوري والعمر كدالة لعرقلة steric إلى إيزوميريس الحرة من الفلوروفور عندما تكون في حالة متحمس، الناجمة عن أسطح البروتين في محيط الصبغة^{14،15،16،17،18،19} . وتعتبر كل من FRET وPIFE مساطر طيفية أو مستشعرات القرب لأن معلمتهما المقاسة ترتبط مباشرة بمقياس مكاني داخل الجزيئات الحيوية المسماة تحت القياس. في حين أن كفاءة FRET ترتبط بالمسافة بين زوج من الأصباغ ضمن نطاق 3-10 نانومتر²⁰، فإن مسارات PIFE تزيد في غلة الكم الفلوري أو العمر المرتبط بالمسافة بين الصبغة وسطح بروتين قريب في نطاق 0-3 نانومتر^19.

وقد استخدمت على نطاق واسع FRET جزيء واحد لتوفير رؤى الهيكلية في العديد من أنظمة البروتين المختلفة, بما في ذلك البروتينات المضطربة في جوهرها (النازحين)²¹, مثل α-سينوكلين (α-سين)²². α-Syn يمكن تشكيل هياكل مرتبة بعد ربط الجزيئات الحيوية المختلفة وتحت ظروف مختلفة^{23،24،25،26،27،28،29،30}. ومع ذلك ، عندما لا تنضم ، يتميز مونومر α سين بعدم التجانس العالي مع التوافق السريع^31،32.

وقد درست سابقا تشكيلات α سين باستخدام تقنيات مختلفة مختلفة تساعد في تحديد ديناميات تشكيلية من هذه النظم البروتين غير متجانسة للغاية وديناميكية^{33،34،35،36،37،38،39}. ومن المثير للاهتمام، جزيء واحد FRET (smFRET) قياسات α سين في العازلة ذكرت واحد FRET السكان^39،40 التي هي نتيجة لمتوسط الوقت من التوافقات بشكل حيوي في بعض الأحيان أسرع بكثير من وقت الانتشار النموذجي من α سين من خلال بقعة الكونفوار (مرات أسرع من بضع ميكروثانية وأسرع من ذلك ، بالنسبة لأوقات نشر ميلي ثانية نموذجية)^{40، 41}. ومع ذلك ، باستخدام مسطرة مطيافية FRET مع حساسية المسافة 3-10 نانومتر في بعض الأحيان تقارير فقط عن التغيرات الهيكلية الشاملة في بروتين صغير مثل α سين. ويمكن أن تبلغ قياسات جزيء واحد باستخدام أجهزة استشعار القرب الطيفي ذات الحساسيات الأقصر مسافة عن ديناميات الهياكل المحلية. هنا نقوم بإجراء قياسات PIFE جزيء واحد من α-Syn وتحديد مجموعات فرعية مختلفة من العمر الفلوري رسم الخرائط إلى هياكل محلية مختلفة مع التحولات بينهما بطيئة مثل 100 مللي ثانية. يلخص هذا العمل قياسات smPIFE التي تم حلها زمنيا لجزيئات α-Syn التي يتم نشرها بحرية واحدة في كل مرة ، في المخزن المؤقت وعندما تكون مرتبطة بالأغشية المستندة إلى SDS كمستشعر القرب الطيفي أحادي الجزيئات قصير المدى.

البروتوكول

1. التحول البلازميد

1. إعداد 0.5 لتر من SOC المتوسطة
   1. وزن 10 غرام من التريبتون، 2.5 غرام من استخراج الخميرة، 0.25 غرام من كلوريد الصوديوم (NaCl)، 0.1 غرام من كلوريد البوتاسيوم (KCl).
   2. أضف الماء المقطر المزدوج (DDW) حتى الحجم الإجمالي 0.5 لتر.
   3. ضبط درجة الحموضة 7 بإضافة هيدروكسيد الصوديوم (NaOH).
   4. إعداد aliquots الأسهم من 100 مل وautclave.
   5. قبل الاستخدام، أضف 0.5 مل من كلوريد المغنيسيوم المعقم (MgCl₂₎و 1.8 مل من الجلوكوز المعقم إلى 100 مل من SOC.
2. إذابة BL21 (DE3) خلايا الإشريكية القولونية المختصة على الجليد.
3. خلط الخلايا المختصة بلطف.
4. إعداد اثنين من أنابيب 15 مل. تسمية واحدة كما أنبوب رد فعل التحول والآخر كما أنبوب التحكم.
5. Aliquot 100 ميكرولتر من الخلايا المختصة في الأنابيب.
6. إضافة 1 ميكرولتر من البلازميد بتركيز 0.1 نانوغرام / ميكرولتر في أنبوب رد فعل التحول.
7. سخني SOC المتوسطة في 42 °C حمام مائي للاستخدام في الخطوة 1.8.
8. الحرارة نبض الأنبوبين في 42 °C حمام مائي لمدة 45 ثانية. (خطوة حاسمة!)
9. إضافة 900 ميكرولتر من SOC المتوسطة ساخنة إلى كل أنبوب.
10. احتضان الأنابيب عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة مع اهتزاز بسرعة 225 دورة في الدقيقة.
11. انتشار 200 ميكرولتر من الخلايا معplasmid تحول على واحد LB (لوريا-برتاني) -أغار لوحة تحتوي على 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين، وذلك باستخدام منتشر الخلايا العقيمة.
12. انتشار 200 ميكرولتر من الخلايا معplasmid تحول على لوحة واحدة LB-أجار دون أمبيسلين، وذلك باستخدام موزع معقمة (السيطرة الإيجابية).
13. انتشار 200 ميكرولتر من خلايا التحكم (لا تحتوي على بلازميد) على لوحة LB-agar واحدة تحتوي على 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين، وذلك باستخدام موزع معقم(السيطرة السلبية).
14. احتضان لوحات بين عشية وضحاها في 37 °C.

2. إعداد البروتين

1. إعادة تركيب α-Synuclein التعبير والتنقية
   1. اختيار مستعمرة واحدة وتنمو في 100 مل من LB autoclaved (لوريا-بيرتاني) المتوسطة السائلة التي تحتوي على 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين في 37 درجة مئوية (بداية).
   2. إعداد أربع قوارير 2 L Erlenmeyer، كل منها يحتوي على 1 لتر من المتوسط LB autoclaved و 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين (تلقيح كبير).
   3. قياس الكثافة البصرية (OD في λ = 600 نانومتر) من محلول الخلية. عندما تصل كثافة الخلية في البداية إلى OD_{λ= 600nm} من 0.6-0.7، أضف 10 مل من محلول المبتدئين لكل 1 لتر من متوسط LB الذي تم إعداده في الخطوة السابقة.
   4. زراعة الوسائط البكتيرية في شاكر حاضنة في 37 درجة مئوية وسرعة 200 دورة في الدقيقة.
   5. عندما تصل كثافة الخلية إلى OD_{λ= 600nm} من 0.6-0.8، حث تعبير البروتين عن طريق إضافة الأيزوبروبيل β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) لكل 1 لتر من متوسط النمو إلى تركيز نهائي قدره 1 مليون.
      ملاحظة: حل 0.96 غرام من IPTG في 4 مل من DDW وإضافة 1 مل من محلول IPTG الناتج لكل 1 لتر من النمو البكتيري.
   6. زراعة الخلايا لمدة 4 ساعات وجمعها عن طريق الطرد المركزي في أنابيب 50 مل بسرعة 5170 × ز لمدة 8 دقائق.
      ملاحظة: في كل جولة، تجاهل supernatant، والحفاظ على بيليه وملء مرة أخرى نفس الأنابيب مع النمو البكتيري.
   7. تخزين بيليه البكتيرية في تخزين التجميد العميق (على سبيل المثال، -80 درجة مئوية) لليوم التالي.
   8. في اليوم التالي، وإعداد 200 مل من العازلة تحلل: 40٪ (ث / الخامس) السكروز والعازل A، والذي يتضمن 30 mM تريس-HCl، 2 M إيثيلينديامينتتراستيك حمض (EDTA)، 2 mM dithiothreitol (DTT) في درجة الحموضة 8.0.
   9. إضافة 25 مل من العازلة تحلل إلى كل أنبوب مع بيليه البكتيرية.
   10. إعادة تعليق بيليه (استخدام المصاطب البستر البلاستيك العقيم) في العازلة Lysis (انظر 2.1.8).
   11. إعداد العقيمة 250 مل قارورة Erlenmeyer مع مغناطيس stirrer على الجليد.
   12. إضافة 5 مل من المخزن المؤقت للتحلل، ومن ثم نقل الخلايا المتجانسة إعادة تعليق إليها.
   13. يحرك الخلايا لمدة 20 دقيقة عند 200 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   14. تقسيم الحل إلى أنابيب 50 مل والطرد المركزي في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة بسرعة 17400 × غرام.
   15. تجاهل الناتنات الفائق.
   16. إعداد العقيمة 250 مل قارورة Erlenmeyer مع مغناطيس stirrer على الجليد.
   17. إضافة 15 مل من العازلة حل (90 مل تبريد العازلة A و 37 ميكرولتر من MgCl₂ حلها خارج الحد الذوبان وتصفيتها) في كل أنبوب. استخدام المصصات البستر البلاستيك العقيمة وحل بيليه.
   18. عندما يصبح جزء من الحل متجانسا ، نقله إلى قارورة Erlenmeyer التي تم تحريكها على الجليد.
   19. تحديد وحدة تخزين الحل في Erlenmeyer.
   20. إضافة 10 ملغ من كبريتات الستربتومايسين لكل 1 مل من الحل (قبل إضافة، حل كبريتات الستريبتومايسين في 2 مل من العازلة A).
       ملاحظة: يتم تنفيذ هذه الخطوة من أجل إزالة الحمض النووي والريبوسومات بعيدا.
   21. يحرك المحلول لمدة 10-20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   22. تقسيم الحل إلى أنابيب 50 مل والطرد المركزي في 4 درجة مئوية وسرعة 20700 × ز لمدة 30 دقيقة.
   23. جمع supernatant والتخلص من بيليه.
   24. إعداد قارورة Erlenmeyer 250 مل معقمة على الجليد مع ستيرر.
   25. تصفية supernatant باستخدام 0.22 ميكرومتر حقنة مرشح في قارورة Erlenmeyer نظيفة.
   26. تحديد حجم الحل ووزن 0.3 غرام من كبريتات الأمونيوم لكل مل واحد من الحل.
   27. تدريجيا، إضافة كبريتات الأمونيوم إلى الحل أثار.
       ملاحظة: يتم تنفيذ هذه الخطوة لتسريع البروتينات. عندما يربط كبريتات الأمونيوم البروتينات ، يصبح المحلول محجوبا ومشوشا ، والذي يظهر كاللون الأبيض.
   28. يحرك المزيج لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   29. تقسيم الحل إلى أنابيب 50 مل والطرد المركزي في 4 درجة مئوية وسرعة 20700 غرام لمدة 30 دقيقة.
   30. تجاهل بعناية supernatant والحفاظ على بيليه.
   31. حل بيليه مع 20 مل من العازلة A.
   32. توحيد جميع الحلول في أنبوب واحد، ومن ثم قياس الطيف امتصاص الأشعة فوق البنفسجية من الحل.
       ملاحظة: إذا أظهر الطيف توقيع التجميع (الامتصاص فوق طول موجي 300 نانومتر)، استمر في الخطوة التالية. إذا لم يكن كذلك، تخطي الخطوة التالية والانتقال إلى الخطوة 2.1.34.
       ملاحظة: مؤشر التجميع (A.I.) محسوب من أطياف الأشعة فوق البنفسجية كما OD_{λ = 350nm}/ (OD_{λ= 280nm} - OD_{λ = 350nm}) ×100. ⁴¹
   33. استخدم أنابيب centriprep وأجهزة الطرد المركزي التي تبلغ سرعتها 100 كيلودا بسرعة 3,590 x g عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. جمع السائل الذي مر من خلال مرشح.
   34. Dialyze الحل في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها، ضد العازلة A، وذلك باستخدام أكياس غسيل الكلى مع قطع 3.5 كيلودا.
   35. إجراء جولة أخرى من غسيل الكلى لمدة 4 ساعات على الأقل.
   36. تحميل نموذج dialyzed على عمود تبادل أنيون MonoQ 1 مل. استخدام 30 mM تريس هيدروكلوريد (تريس-HCl) العازلة في 7.5 pH كعازل الغسيل و 30 mM تريس-HCl العازلة pH 7.5 مع 500 م م NaCl كحاجز elution.
   37. قم بحقن العينة في العمود. ثم يغسل مع 20 حجم العمود (السير الذاتية) من 0٪ العازلة elution و100٪ غسل العازلة من أجل إزالة البروتينات غير منضم.
   38. غسل مع 7 السير الذاتية من 30٪ elution العازلة.
   39. Elute عينة بروتين α سين باستخدام التدرج الذي يتغير من 30٪ إلى 100٪ العازلة elution ل30 السير الذاتية، بمعدل تدفق 1.5 مل / دقيقة.
       ملاحظة: α-Syn elutes في 46-66 السير الذاتية في الموصلية 20-24 mS/cm، وهو ما يشير إلى 38-50٪ الغضوء العازلة.
   40. جمع كسور ذروة elution الرئيسية. تحقق من وجود α سين عن طريق تشغيل عينات في 15٪ من الصوديوم دودسيل كبريتات البولي أكريلاميد هلام electrophoresis (SDS-PAGE)، بعد تلطيخ إما مع حل تلطيخ Coomassie الأزرق أو سريع SeeBand. ومن المتوقع فرقة في 15 kDa.
   41. توحيد الكسور ذات الصلة و dialyze لهم بين عشية وضحاها، ضد العازلة A، وذلك باستخدام أكياس غسيل الكلى مع قطع 3.5 كيلودا في 4 درجة مئوية.
   42. إعداد aliquots من عينة البروتين وتخزينها في -20 درجة مئوية.
2. Cy3 المسمى α سينوكلين
   1. تقليل ثيول من بقايا السيستين في α-Syn A56C متحولة بإضافة DTT إلى تركيز نهائي من 2 mM لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
   2. إزالة DTT عن طريق إجراء جولتين من غسيل الكلى باستخدام 3.5 كيلودا قطع أكياس غسيل الكلى. للجولة الأولى، dialyze ضد 30 mM تريس-HCl الرقم الحموضة 8.0 و 2 MM EDTA. للجولة الثانية، dialyze ضد 50 mM HEPES الرقم الحموضة 7.2 و 2 MM EDTA.
   3. تقليل بقايا السيستين بإضافة Tris(2-carboxyethyl)فوسفين هيدروكلوريد (TCEP) إلى عينة البروتين، إلى تركيز نهائي قدره 50 ميكرومتر لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: TCEP هو عامل تقليل غير سلفهيدريل، وبالتالي فإنه يحافظ على مجموعات ثيول خفضت دون رد فعل مع الصبغة. أضفنا 0.5 ميكرولتر من محلول مخزون من 1 M TCEP.
   4. حساب كميات البروتين المطلوبة لحجم رد الفعل النهائي من 1 مل.
      ملاحظة: هنا مثال على الحساب الذي استخدمناه:
      20 ميكرومتر _{تركيز البروتين النهائي} × 1 مل الحجم _{النهائي} = 56 ميكرومتر تركيز _{البروتين الأولي} × البروتين الخامس _{لإضافتها}
   5. حساب كمية الصبغة المطلوبة لحجم رد الفعل النهائي من 1 مل. يجب إجراء وضع العلامات صبغ من السيستين واحد مع صبغ الزائدة، في نسبة الضرس dye:protein من 3:1 على الأقل.
      ملاحظة: مثال على الحساب الذي استخدمناه:
      60 ميكرومتر _{تركيز صبغ النهائي} × 1 مل الحجم _{النهائي} = 370 ميكرومتر _{تركيز الصبغة الأولية} × _صبغة V أن تضاف
   6. حساب مقدار المخزن المؤقت من dialysate المطلوبة لضبط حجم رد الفعل الإجمالي إلى 1 مل.
      ملاحظة: مثال الحساب: 1 مل - _{(V محسوبة من الخطوة 2.2.4} + V _{محسوبة من الخطوة 2.2.5)}
   7. إعداد قارورة رد الفعل مع المغناطيس على رأس stirrer.
   8. أولا، إضافة كمية محسوبة من البروتين والعازل. بعد ذلك، إضافة المبلغ المحسوب من الصبغة (سولفو-Cy3 maleimide).
   9. الحفاظ على رد الفعل في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 3-5 ساعات.
   10. إنهاء رد الفعل عن طريق إضافة 2 MM DTT وتستمر لمدة 1 ساعة.
   11. قم بإجراء ثلاث جولات من غسيل الكلى ضد Buffer A، باستخدام أكياس غسيل الكلى مع قطع 3.5 كيلودا لإزالة الصبغة الحرة الزائدة من المحلول.
   12. تحميل العينة على عمود استبعاد حجم لفصل مزيد من المسمى α-Syn من الصبغة الحرة.
   13. تحديد تركيز نقي المسمى α-Syn عن طريق قياس امتصاص الصبغة (معامل امتصاص لسولفو-Cy3 هو 162,000 M^-1سم^-1في λ=548 نانومتر).
   14. إذا لزم الأمر، ركز الحل α-Syn المسمى نقي باستخدام مركز فراغ (على سبيل المثال، SpeedVac). ثم، إجراء جولة واحدة من غسيل الكلى ضد العازلة A، وذلك باستخدام أكياس غسيل الكلى مع قطع 3.5 كيلودا وتحديد مرة أخرى تركيز البروتين المسمى.
   15. إعداد aliquots من عينة البروتين المسمى وتخزينها في -20 درجة مئوية.

3. القياسات

1. الإعداد التجريبي smPIFE
   ملاحظة: استخدم الإعداد المستند إلى confocal التالية أو ما شابه ذلك.
   1. استخدام مصدر ليزر نبضي (في حالتنا، λ= 532 نانومتر picosecond الليزر النبضي مع عرض نبض ~ 100 PS FWHM)، تعمل بمعدل تكرار مناسب (20 ميغاهرتز في حالتنا) وتوجيهها إلى SYNC من بطاقة العد الفوتون واحد المترابطة زمنيا (TCSPC)، كمصدر للسولفو-Cy3 (sCy3) الإثارة.
   2. استخدام مرآة ديكثروليك مع انعكاسية عالية في 532 نانومتر، لفصل الإثارة والتشتت من الفلورية.
   3. استخدم ثقب قطره 100 ميكرومتر في بؤرة الضوء المنبعث، بعد تركيز شعاع الانبعاثات المحصلة بواسطة عدسة، وقبل أن يتم إعادة تجميع شعاع الانبعاثات بعدسة أخرى.
   4. استخدام مرشح تمرير الفرقة (585/40 نانومتر في حالتنا) لمزيد من تصفية sCy3 مضان من مصادر الضوء الأخرى.
   5. الكشف عن الفلورسينس باستخدام كاشف (الصمام الثنائي الانهيار الجليدي الفوتون واحد أو فوتولتر الهجين، في حالتنا) توجيهها (من خلال جهاز التوجيه 4-إلى-1، في حالتنا) إلى وحدة TCSPC (بيكر وهيكل SPC-150، في حالتنا).
      ملاحظة: في حالتنا، يتم إجراء الحصول على البيانات عبر برنامج VistaVision (ISS^TM)بتنسيق ملف (TTTR) الذي تم حله بالوقت.
2. إعداد عينة smPIFE
   1. إعداد 25 pM sCy3 المسمى α-Syn في القياسات العازلة: خلات الصوديوم 10 mM, 10 م الصوديوم ثنائي هيدروجين فوسفات، 10 م غليسين درجة الحموضة 8.0، 20 م م NaCl، 10 mM السيستين و 1 M 6-هيدروكسي-2،5،7،8-tetramethylchroman-2-carboxylic حمض (TROLOX)، في أنبوب منخفض البروتين ملزمة.
      ملاحظة: إذا تم قياس α-Syn في وجود الحويصلات SDS إضافة مقدار SDS المناسبة أيضا.
   2. شطف شريحة أغطية مجهرية من 18 غرفة مع 100 ميكرولتر من 1 ملغم / مل ألبوم مصل البقر (BSA) لمدة دقيقة واحدة ، ثم إزالة BSA.
   3. أضف 100 ميكرولتر من عينة α-Syn التي تحمل علامة pM sCy3 إلى غرفة في الشريحة ذات الغطاء.
   4. قم بإجراء قياس smPIFE للعينة باستخدام الإعداد الموضح، كما يلي في الخطوات التالية.
3. الحصول على بيانات smPIFE
   1. استخدام عدسة عالية الفتحة العددية الغمر المياه الهدف (في حالتنا، أوليمبوس UPLSAPO 60x N.A. 1.2)، وإضافة قطرة من المياه فائقة النقاء على رأس العدسة الهدف.
   2. إصلاح الشريحة coverslip في غرفة المرحلة وتثبيته على رأس مرحلة المجهر.
   3. جلب العدسة الهدف صعودا ، حتى قطرة الماء على رأس مسحات العدسة الهدف في الجزء السفلي من الشريحة coverslip.
   4. افتح مصراع الليزر وارفع العدسة الهدف إلى الأعلى، بينما تفقد النمط على كاميرا CMOS، وجمع الضوء المتناثر من العينة. مراقبة نمط الحلقات متجدد الهواء: الأول يمثل التركيز في واجهة الماء والزجاج، ومن ثم الثاني يمثل التركيز في واجهة بين الزجاج والحل عينة.
   5. زيادة ارتفاع العدسة الهدف من قبل 75 ميكرومتر إضافية، وبذلك تركيز الليزر في عمق الحل، للحد من السيارات الفلورسينس من السطح الزجاجي للأغطية.
   6. ضبط قوة الليزر في عدسة الهدف ليكون ~ 100 μW.
   7. ابدأ في اقتناء الفوتونات المكتشفة لفترة محددة مسبقا (ساعتان، في قياساتنا).
      ملاحظة: يجب أن يكون لدى معظم إشارة الامتلاك معدل (يقاس بالتعول في الثانية، cps) مشابه للنسبة التي تم الحصول عليها عند قياس المخزن المؤقت فقط؛ يجب أن تظهر البيانات التي تحتوي على مللي ثانية أحداث انفجار الفوتون النادرة ، مع وجود معدل متوسط لمعدل خلفية الكاشف النموذجي (1000 cps < ، في حالتنا).

4. smPIFE انفجار التحليل

1. تحويل البيانات الخام
   ملاحظة: عادة ما يتم تخزين البيانات في ملف ثنائي بتنسيق تم تعريفه مسبقا من قبل الشركة التي تصنع بطاقة TCSPC (ملفات.spc في حالتنا).
   1. تحويل ملف البيانات الخام إلى شكل ملف عالمي فوتون HDF5⁴²، وذلك باستخدام برنامج جناح phconvert (https://github.com/Photon-HDF5/phconvert). استدعاء ملف البيانات الخام كمدخل وتحويلها إلى ملف البيانات الخام .hdf5 باستخدام رمز المناسبة في جناح phconvert (تحويل ns-ALEX بيكر-هيكل الملفات إلى فوتون HDF5.ipynb Jupyter دفتر الملاحظات، في حالتنا).
      ملاحظة: التحويل إلى ملف .hdf5 يتضمن: (1) تحديد تدفقات الفوتون ذات الصلة في البيانات الأولية (أي تدفقات الفوتونات من الفوتونات المسجلة من معرف الكاشف ذات الصلة)؛ (2) تحديد تدفقات الفوتونات ذات الصلة في البيانات الأولية (أي تدفقات الفوتونات من الفوتونات المسجلة ل ID الكاشف ذي الصلة)؛ (2) تحديد تدفقات الفوتونات ذات الصلة في البيانات الأولية.) (2) نانو تايمز فوتون ذات الصلة (مرات الكشف عن فوتون بالنسبة إلى الوقت SYNC الإثارة)؛ و (3) وأضاف البيانات الوصفية.
2. انفجار البحث والاختيار باستخدام FRETbursts⁴³
   ملاحظة: يتم تخزين كافة ملفات البيانات الأولية فوتون HDF5 من القياسات smPIFE، وكذلك رمز تلخيص تحليل البيانات الخام، في Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.4587698). جميع الخطوات أدناه مفصلة وتظهر داخل دفاتر Jupyter ، كما تم توفيرها في رابط مستودع Zenodo.
   1. افتح دفاتر Jupyter (ضمن إطار أناكوندا، في حالتنا).
   2. افتح دفتر الملاحظات smPIFE-aSyn 56C(Cy3) 25 pM newBuffer (دفتر ملاحظات نهائي).ipynb (يمكن العثور عليه في ارتباط Zenodo).
   3. تحميل FRETbursts.
   4. تحميل ملف بيانات HDF5 فوتون.
   5. تقييم معدل BG: باستخدام الرسم البياني للعصر بين الفوتونات، احسب معدلات الخلفية (BG) لكل 30 ثانية من الحصول على البيانات في ملف بيانات HDF5 الفوتون.
      ملاحظة: تصف الخطوات التالية البحث الاندفاع باستخدام خوارزمية إطار انزلاق^44،45،46.
   6. نقل إطار زمني من m = 20 فوتون متتالية، فوتون واحد في وقت واحد.
   7. جمع بيانات الفوتون فقط إذا كان معدل الفوتون الفوري، ( ) ، هو على الأقل F = 11 مرات أكبر من معدل BG لتلك الفترة من الحصول على البيانات.
      ملاحظة: يتم إنشاء انفجار من كافة فوتونات متتالية التي تم جمعها عن طريق انزلاق نافذة فوتون واحد في وقت واحد (الخطوة 4.2.6.) والاتفاق مع معيار معدل فوتون (الخطوة 4.2.7).
   8. حساب خصائص الاندفاع التالية:
      حجم الانفجار: كمية من فوتونات في انفجار.
      مدة الانفجار: الفرق الزمني بين آخر وأول أوقات الكشف عن فوتون في انفجار.
      انفجار السطوع: أكبر قيمة لمعدل فوتون فوري في انفجار.
      فصل الاندفاع: الفاصل الزمني بين رشقات نارية متتالية.
      ملاحظة: توضح النقاط التالية إجراء تحديد الاندفاع إضافية.
   9. رسم الرسم البياني لقيم سطوع الانفجار (أعلى معدل فوتون فوري في انفجار) ، مع محور الأحداث في مقياس لوغاريتمي.
   10. حدد عتبة سطوع الاندفاع على أنها قيمة سطوع الاندفاع الدنيا التي يعرض منها الرسم البياني نمطا متحللا.
   11. حدد الاندفاعات ذات قيم السطوع الأكبر من عتبة سطوع الاندفاع.
       ملاحظة: تصف الخطوات التالية الاندفاع متوسط العمر الفلوري.
   12. رسم الرسم البياني للنانوتايم فوتون لجميع فوتونات في جميع رشقات نارية مختارة مع محور العد فوتون في مقياس لوغاريتمي.
   13. حدد عتبة نانوتايم على أنها الحد الأدنى لقيمة نانوتايم التي يعرض منها الرسم البياني للنانوتيزمانات الضوئية نمطا متحللا.
   14. حدد فوتونات فقط ذات أوقات نانوية أكبر من عتبة نانوتايم.
   15. حساب المتوسط الجبري لجميع nanotimes فوتون مختارة.
   16. طرح عتبة نانوتايم من المتوسط الجبري نانوتايم فوتون. والنتيجة هي متوسط نانوتايم الفوتون للانفجار ، والذي يتناسب مباشرة مع متوسط عمر الفلورسينس.
   17. رسم الرسم البياني لجميع انفجار يعني العمر الفلوري. قد تظهر مجموعات فرعية موزعة مركزيا من العمر الفلوري. تمثل المجموعات الفرعية ذات المتوسطات المنخفضة القيمة أنواع الجزيئات مع sCy3 التي لم يتم عرقلتها بشكل نجمي ، في حين أن المجموعات الفرعية ذات المتوسطات ذات القيمة الأعلى تمثل أنواع الجزيئات مع sCy3 التي كانت أكثر عرقلة نجمية.
       ملاحظة: تصف الخطوات التالية ديناميكيات بطيئة بين الاندفاع استنادا إلى تحليل تكرار الاندفاع⁴⁷
   18. رسم الرسم البياني لوقت فصل الانفجار، مع محور وقت الفصل في مقياس لوغاريتمي.
       ملاحظة: سيظهر مجموعتان فرعيتان من أوقات الفصل المتفجرة:
       مجموعة فرعية رئيسية مع أوقات فصل من الثواني ، تمثل رشقات نارية متتالية تنشأ من جزيئات مختلفة تقاس على التوالي.
       مجموعة فرعية طفيفة مع أوقات الانفصال ~ <100 مللي ثانية ، تمثل رشقات نارية متتالية على حد سواء منشؤها من نفس الجزيء ، تتكرر مرة أخرى من خلال حجم confocal.
   19. حدد لحفظ جميع أزواج من رشقات نارية متتالية التي يتم فصلها بأقل من وقت الفصل الأقصى الذي يحدد نفس الجزيء الفرعية السكان (<100 مللي ثانية، في حالتنا).
   20. رسم رسم بياني أو قطعة مبعثرة من متوسط العمر الفلوري للانفجارات الأولى والثانية لجميع أزواج الرشقات التي تتكرر تحت عتبة زمنية معينة للفصل

النتائج

كما المشردين داخليا، عندما لا يكون ملزما إلى الجزيئات الحيوية آخر، α سين معارض الديناميات الهيكلية بين تشكيلات متعددة، مع التحولات في عدد قليل من ميكروثانية⁴⁰ وحتى في مئات نانو ثانية⁴¹. عندما يعبر α سين بقعة الكونفوجال ، قد يخضع لآلاف التحولات بين التركيبات. في الواقع ، كان هذا هو الحال عندما تم استخدام smFRET^39،40. هنا نقوم بإجراء قياسات smPIFE من أجل التحقيق في الديناميات التركيبية المحلية α سين.

المناقشة

أجريت دراسات كيميائية حيوية وبيولوجية واسعة لدراسة الخصائص الهيكلية αسين وطبيعته المضطربة^{33و34و35و36و37و38.} وقد استخدمت العديد من الأعمال بالفعل smFRET نشر بحرية للتحقيق في الديناميات داخل الجزيئية من α سين مونومر خالية من الربط. وأفادت هذه الأعمال عدم التجانس ديناميكية عالية من α سين، مما يؤدي إلى متوسط الخروج من الأنواع اله...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
وحدات تصفية الطرد المركزي Amicon Ultra-15	Merc	C7715	قطع: 100 كيلو دالتون
كبريتات الأمونيوم	سيجما-ألدريتش	A4418
BSA	سيجما-ألدريتش	A9647
سيستامين	سيجما-ألدريتش	30070
أكياس غسيل الكلى - MEGA GeBaFlex-tube	Gene Bio-Application	MEGA320
ديثيوثريتول (DTT)	سيجما ألدريتش	43815
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA)	سيجما ألدريتش	E5134
محلول تلطيخ سريع الفرقة	جيني التطبيق الحيوي	SB050
جلايسين	سيجما ألدريتش	50046
د-جلوكوز	سيجما ألدريتش	G7021
هيبس	سيجما ألدريتش	54457
تحلية HiTrap 5 مل	سيجما ألدريتش	GE17-1408
6-هيدروكسي-2،5،7،8-حمض رباعي ميثيل كرومان-2-كربوكسيل (TROLOX)	سيجما ألدريتش	238813
الأيزوبروبيل بيتا ؛ -د-1-ثيوغالاكتوبيرانوسيد (IPTG)	سيجما ألدريتش	I5502
مرق رطل	سيجما ألدريتش	L3152
المغنيسيوم كلوريد	سيجما ألدريتش	63068
عمود مونوك	سيجما ألدريتش	54807
بروتين أنبوب LoBind	سيجما ألدريتش	EP0030108094	0.5 مل
شطف شريحة صغيرة 18	نفس المصدر	81816
SDS	سيجما ألدريتش	75746
أسيتات الصوديوم	سيجما ألدريتش	S2889
هيدروكسيد الصوديوم	Sigma-Aldrich	S8045
فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة أحادي الهيدرات	Sigma-Aldrich	71507
موزعات الخلايا المعقمة ، ملاعق Drigalski	mini-plast	815-004-05-001
كبريتات الستربتومايسين	Sigma-Aldrich	S9137
sulfo-Cy3 & nbsp ؛ ماليميد	أبكام	AB146493
تريس (2-كربوكسي إيثيل) فوسفين هيدروكلوريد (TCEP)	سيجما ألدريتش	75259
تريس-هيدروكلوريك	سيجما ألدريتش	93363
تريبتون	سيجما ألدريتش	T7293
مستخلص الخميرة	سيجما ألدريتش	Y1625