Method Article

تصور تشكيل غشاء الكشكشة باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح

DOI:

10.3791/62658

⸱

May 27th, 2021

 ,  ,  , 
1Vascular Biology Center, Medical College of Georgia at Augusta University, 2Department of Cellular Biology and Anatomy, Medical College of Georgia at Augusta University, 3Department of Pharmacology and Toxicology, Medical College of Georgia at Augusta University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Macropinocytosis هي عملية داخل الخلايا محفوظة للغاية تبدأ من خلال تشكيل إسقاطات غشائية غنية بالصفائح F-actin ، والمعروفة أيضا باسم كشكشة الغشاء. وقد تورط معدل زيادة الاستيعاب المذاب macropinocytotic في مختلف الظروف المرضية. يقدم هذا البروتوكول طريقة لقياس تكوين كشكشة الغشاء في المختبر باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كشكشة الغشاء هي تكوين نتوءات غشاء البلازما المتحركة التي تحتوي على شبكة من خيوط الأكتين المبلمرة حديثا. قد تتشكل الكشكشة الغشائية تلقائيا أو استجابة لعوامل النمو والسيتوكينات الالتهابية واسترات الفوربول. قد يعاد تنظيم بعض نتوءات الغشاء في كشكشة غشائية دائرية تندمج في هوامشها البعيدة وتشكل أكوابا تغلق وتنفصل في السيتوبلازم على شكل فجوات كبيرة غير متجانسة تسمى macropinosomes. أثناء هذه العملية ، تحبس الكشكشة السائل خارج الخلية والمذابات التي تستوعب داخل macropinosomes. المجهر الإلكتروني الماسح عالي الدقة (SEM) هو تقنية تصوير شائعة الاستخدام لتصور وقياس تكوين كشكشة الغشاء ، والنتوءات الدائرية ، وأكواب المحببات الكبيرة المغلقة على سطح الخلية. يصف البروتوكول التالي ظروف زراعة الخلايا ، وتحفيز تكوين كشكشة الغشاء في المختبر ، وكيفية إصلاح الخلايا وتجفيفها وإعدادها للتصوير باستخدام SEM. كما يتم وصف القياس الكمي لكشكش الغشاء ، وتطبيع البيانات ، والمحفزات والمثبطات لتشكيل كشكشة الغشاء. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول دور ندرة الخلايا الكبيرة في العمليات الفسيولوجية والمرضية ، والتحقيق في الأهداف الجديدة التي تنظم تكوين كشكشة الغشاء ، وتحديد المحفزات الفسيولوجية غير المميزة حتى الآن بالإضافة إلى مثبطات دوائية جديدة ل macropinocytosis.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Macropinocytosis هي عملية endocytic مسؤولة عن استيعاب كمية كبيرة من السائل خارج الخلية ومحتواه عن طريق تشكيل نتوءات غشاء البلازما الديناميكية والمدفوعة بالأكتين والتي تسمى كشكشة الغشاء1. تشكل العديد من هذه الكشكشة الغشائية أكوابا تغلق وتندمج مرة أخرى على الخلية وتنفصل عن غشاء البلازما كإيدوسومات كبيرة غير متجانسة داخل الخلايا تعرف أيضا باسم macropinosomes1. على الرغم من أن ندرة الخلايا الكبيرة تسببها عوامل النمو مثل عامل تحفيز مستعمرة البلاعم (M-CSF) وعامل نمو البشرة (EGF) في مجموعة واسعة من أنواع الخلايا ، فقد لوحظت أيضا عملية إضافية فريدة تعتمد على الكالسيوم تعرف باسم macropinocytosis التأسيسي في الخلايا المناعية الفطر....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: فيما يلي بروتوكول عام يستخدم لقياس تكوين كشكشة الغشاء في البلاعم RAW 264.7 باستخدام الفحص المجهري SEM. قد يكون التحسين مطلوبا لأنواع الخلايا المختلفة.

1. خط الخلية وزراعة الخلايا

  1. تنمو البلاعم RAW 264.7 في وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco مع 10٪ (vol / vol) مصل البقر الجنيني المعطل حراريا (FBS) ، و 100 وحدة دولية / مل من البنسلين و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. استبدال وسائط النمو كل يومين.
  2. عندما تصبح الخلايا ملتقية بنسبة 80٪ ، اغسل اللوحة مرتين باستخدام PBS المعقمة.
  3. افصل الخلايا عن طريق إضافة 1000 ميكرولتر من 0.5٪ من التربسين-EDTA واحتضن لوح....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نصف النتائج من التقنية المقدمة. توضح صور SEM التمثيلية الموضحة في الشكل 1 تكوين كشكشة الغشاء في البلاعم RAW 264.7 بعد العلاج باستخدام PMA و M-CSF. تم التقاط الصور لأول مرة بتكبير 3,500x لأغراض القياس الكمي ثم عند مستويات أعلى من التكبير (8,500x إلى 16,000x) لإظهار غشاء البلازما بمزيد من التفاصيل. المعالجة المسبقة للبلاعم مع مثبط ندرة الخلايا الكبيرة EIPA تشكيل كشكشة الغشاء الموهن (الشكل 1). يمكن تقسيم أنشطة غشاء البلازما المرتبط بكثرة الخلايا الماكروبينية .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر بروتوكول التصوير SEM الحالي أداة لتصور وقياس تكوين كشكشة الغشاء ، والنتوءات الدائرية ، والأكواب ذات الخلايا الكبيرة على سطح الخلية في المختبر. على الرغم من أن البروتوكول الحالي يركز على البلاعم ، فقد أظهرت الدراسات أن تكوين كشكشة الغشاء يحدث أيضا على أنواع مختلفة من الخلايا الأخرى بما في ذلك الخلايا المتغصنة والخلايا الليفية والخلايا العصبية والخلايا السرطانية 11،12،14،21،

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكر المؤلفون ليبي بيري (جامعة أوغوستا) على مساعدتها في إعداد عينة SEM. تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة [R01HL139562 (G.C.) و K99HL146954 (B.S.)] وجمعية القلب الأمريكية [17POST33661254 (B.S.)].

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.5٪ Trypsin-EDTAGibco15400-054
2٪ علوم المجهر الإلكتروني الجلوتارالديهايد16320
4٪ بارافورمالدهيدسانتا كروز التكنولوجيا الحيوية281692
5- (N-ethyl-N-isopropyl) -AmilorideSigma Life ScienceA3085
Accuri C6 مقياس التدفق الخلوي
علامات تبويب لاصقة الكربونعلوم المجهر الإلكتروني77825-09
ثنائي ميثيل سلفوكسيدكورنينج25-950-CQC
Dulbecco's Modified Eagle MediumCytiva Life SciencesSH30022.01
Falcon 24-well Clear Flat Bottom Treated TC Multiwell Cell Culture PlateFalcon353047
مصل الأبقار الجنينGemini Bio900-108
FitC-dextرانThermo Fisher ScientificD1823
FM 4-64Thermo Fisher ScientificT13320
HERAcell 150i حاضنة CO2Thermo Fisher Scientific51026282
Hummer Model 6.2 Sputter CoaterAnatech USA58565
JSM-IT500HR مجهرإلكتروني المسح
غطاء مجهرزجاجي ثيرمو فيشر علمي12-545-82
قلم StrepGibco15140-122
phorbol 12-myristate 13-acetateMillipore Sigma524400
RAW 264.7 macrophageATCCATCC TIB-71
مؤتلف بشري M-CSFPeprotech300-25
Samdri-790 مجفف النقطة الحرجةأبحاث Tousimis8778B
SEM عينة الألومنيوم يتصاعد علومالمجهر الإلكتروني75220
المجهرالكاكوديلات الصوديوم12300
تكساس أحمر دإكستراثيرمو فيشر العلميD1864
تريبان الحل الأزرقثيرمو فيشر العلمي15250061
متحد البؤر Zeiss LSM 780
شركة علوم الإلكترونيمجهر

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bohdanowicz, M., Grinstein, S. Role of phospholipids in endocytosis, phagocytosis, and macropinocytosis. Physiological Reviews. 93 (1), 69-106 (2013).
  2. Canton, J. Macropinocytosis: New Insights Into Its Underappreciated Role....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Membrane Ruffle FormationScanning Electron MicroscopyMacropinocytosisPlasma Membrane ProtrusionsActin PolymerizationMacropinocytic CupsFlow CytometryConfocal MicroscopyCell Surface ImagingMacrophage Stimulation

Related Articles