نقل الطاقة الفلوري جزيء واحد هو الأسلوب الذي يتتبع ديناميات الحمض النووي الريبي أثناء تخليق البروتين ريبوسومات. من خلال تتبع الريبوسومات الفردية ، يتم تحديد السكان غير المتجانسين ، مما يلقي الضوء على الآليات. ويمكن استخدام هذه الطريقة لتتبع التغيرات البيولوجية تشكيلية بشكل عام للكشف عن العلاقات الحيوية وظيفة في العديد من النظم الحيوية المعقدة الأخرى. يمكن لطرق جزيء واحد مراقبة الخطوات المقيدة غير المعدلة والمتوسطات الرئيسية منخفضة السكان ، والتي لا يمكن الوصول إليها عن طريق طرق الفرقة التقليدية بسبب متوسط التأثير.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
جزيء واحد فلورسينس دراسة نقل الطاقة من تخليق البروتين ريبوسوم
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الريبوسوم هو مجمع ريبونوكليوبروتين كبير يجمع البروتينات بشكل عملي على طول قوالب الحمض النووي الريبي. قطر الريبوسوم هو ما يقرب من 20 نانومتر لاستيعاب ركائز الحمض النووي الريبي كبيرة في A-, P- و E-المواقع. وبالتالي، فإن ديناميات الريبوسوم هي بطبيعة الحال دي التدريجي بسرعة. يمكن لطريقة جزيء واحد الكشف عن كل ريبوسوم بشكل منفصل وتمييز المجموعات السكانية غير الذاتية ، وهو أمر ضروري للكشف عن الآليات المعقدة للأنظمة متعددة المكونات. نحن تقرير تفاصيل طريقة smFRET على أساس المجهر نيكون Ti2 مقلوب للتحقيق في ديناميات ريبوسوم بين البروتين الريبوسوم L27 وTRNAs. وصفت L27 في موقفها الفريد Cys 53 وإعادة تشكيلها في ريبوسوم التي تم تصميمها لعدم وجود L27. وتوصف TRNA في منطقة الكوع. كما ينتقل tRNA إلى مواقع مختلفة داخل ريبوسوم خلال دورة الاستطالة، مثل ما قبل وبعد النقل، والكفاءة FRET وديناميات تظهر الاختلافات، والتي اقترحت عدد السكان الفرعي متعددة. هذه الخلايا الفرعية غير قابلة للكشف عن طريق أساليب الفرقة. تم بناء مجهر SMFRET القائم على TIRF على مجهر مقلوب يدوي أو آلي ، مع إضاءة ليزر منزلية الصنع. يتم تنقية عينات الريبوسوم عن طريق الطرد المركزي الفائق ، وتحميلها في خلية عينة متعددة القنوات منزلية الصنع ثم تضيء عبر حقل ليزر مبشر. يمكن استخدام بقعة الليزر انعكاس لتحقيق التحكم في ردود الفعل من التركيز المثالي. يتم فصل إشارات الفلورسينس بواسطة برج فلتر مزود بمحرك ويتم جمعها بواسطة كاميرتين رقميتين من CMOS. يتم استرداد الكثافات عبر برنامج NIS-Elements.
المقدمة
الريبوسوم هو ø 20 نانومتر مجمع ريبونوكليوبروتين كبير من وحدة فرعية كبيرة (50S) وصغيرة (30S). فإنه يجمع الببتيدات طويلة على طول قالب مرنا بشكل عملي وتعاوني. يرتبط ريبوسوم 30S إلى fMet-tRNAfMet و mRNA لبدء تخليق البروتين ، ثم ينضم 50S لتشكيل مجمع بدء 70S. الأحماض الأمينية جلب الحمض النووي الريبي إلى ريبوسوم في موقع A (أمينواسيل- TRNA موقع ملزم), في حين يتم عقد سلسلة بيبتيديل ممدود في موقع P (peptidyl- tRNA موقع ملزم). في مجمع ما قبل النقل ، يتم نقل سلسلة بيبتيديل إلى الحمض النووي الريبي في الموقع A مع إضافة حمض أميني واحد. وفي الوقت نفسه، فإن موقع P TRNA هو deacylated. ثم تنتقل ال A-، P-tRNAs إلى مواقع P-، E- لتشكيل مجمع ما بعد النقل، حيث يمثل الموقع الإلكترو....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد الريبوسوم المسمى و TRNA للكشف عن FRET
- عزل الريبوسوم دون L27 من E. القولونية سلالة IW312 وفقا للبروتوكولات القياسية20،21. استخراج الريبوسوم العادية من سلالة الإشريكية القولونية MRE600.
- استنساخ الجين L27 دورة في الدقيقة مع C-المحطة له الوسم في pET-21b (+) البلازميد، والتي يتم تحويلها وأعرب عنها في BL21 (DE3) خلايا pLysS15. تنقية البروتين عن طريق عمود سيفاروز معبأة مسبقا.
- وضع العلامات على L27
- احتضان 20-100 ميكرومتر من L27 المنقى في 100 ميكرولتر مع 2-10 أضعاف الزائدة من TCEP (تريس-2-كاربوكسيثيل-فوسفين) في درجة حرارة الغرفة (RT....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
وكان smFRET ريبوسوم المسمى في الموقف الأوسط من حركة المرور TRNA، لتمييز نقل TRNA من A- إلى P-الموقع (الشكل 1)15. المسافة من بقايا وضع العلامات L27 إلى TRNA A- أو P-الموقع هو 52 أو 61 ألف، على التوالي، المقابلة لكفاءة FRET من 0.47 و 0.65. بعد جمع الصور، تم استرجاع وشدات الفلورسينس من قنوات المانح والمقبل ورسمها كهفوات زمنية(الشكل 1). تم حساب كفاءة FRET من خلال الصيغة التي أقبلها/(أنامقبول+أنا
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
SmFRET حساسة للإشارات الخلفية. أولا، فمن الضروري لمعطف غرفة عينة مع توين 0.05٪ ومن ثم تضاف بالتزامن مع الحل ريبوسوم لمنع ملزمة غير محددة من ريبوسوم إلى السطح. لرؤية الفلورسينس من انبعاث مقبول Cy5 ، يعد كوكتيل زبال الأكسجين (محلول ديوكسي والجلوكوز وترولوكس) ضروريا. بدون هذا الحل، التبييض سريع جدا في قناة المقبول للحصول على معلومات مفيدة. خطوة حاسمة أخرى لتجارب الريبوسوم ، على وجه التحديد ، هي طلاء PEG على السطح الزجاجي. النشاط الريبوسوم حساس للبيئة السطحية. لذلك ، البوليمرات بالفرشاة طويلة ضرورية لحماية الآثار السطحية غير.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ي. وانغ يعلن عدم وجود تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
ويدعم هذا العمل المعاهد الوطنية للصحة في الولايات المتحدة (R01GM111452) ومؤسسة ويلش (E-1721).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Aminosilane | Laysanbio | MPEG-SIL-5000 | |
| Biotin-PEG | Laysanbio | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| BL21 (DE3) خلايا PLysS | Novagen | 71403 | |
| Catalase | millipor sigma | C3515 | |
| CS150FNX Micro Ultra Centrifuge | nuaire | ||
| Cy3 / C5-maleimide | ApexBio | A8138 / A8140 | |
| ECLIPSE Ti2 مجهر مقلوب | نيكون | ||
| EdgeGARD Laminar Flow Hood | Baker | ||
| Glucose oxidase | millipor sigma | G2133 | |
| Histrap HP العمود (عمود سيفاروز معبأ مسبقا) | Cytiva | 17524701 | |
| غطاء المجهر زلة | VWR | 48393-230 | |
| شرائح زجاجية مجهرية | VWR | 470235-792 | |
| كاميرا ORCA-Flash4.0 V3 | Hamamatsu | ||
| PEG (5,000) | Laysanbio | MPEG-SVA-5000 | |
| pET-21b (+) بلازميد | Novagen | 69741 | |
| Sonicator | VWR CPX-952-518R | ||
| TCEP | Apexbio | B6055 | |
| Trolox | ميليبور سيجما | 238813 |
المراجع
- Ramakrishnan, V. What we have learned from ribosome structures. Biochemical Society Transactions. 36, Pt 4 567-574 (2008).
- Frank, J., Agrawal, R. K. A ratchet-like inter-subunit reorganization of the ribosome during translocation. Nature. 406 (6793....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
