مقالة منهجية

منصة "محلية الصنع" ميسورة التكلفة وفعالة للدراسات السلوكية لذبابة الفاكهة ، وبروتوكول مصاحب لقياس تدفق الميتوكوندريا في اليرقات

1K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/62669

⸱

سبتمبر 24, 2021

 ,  ,  , 
1Departamento de Tecnologia, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, 2Faculdade de Ciências da Saúde, Biomedicina, Universidade do Oeste Paulista

في هذه المقالة

ملخص

نحن نقدم بروتوكولات لأي شخص لديه عقل "ثقافة الصانع" لبدء بناء flylab للتحليل الكمي لعدد لا يحصى من المعلمات السلوكية في ذبابة الفاكهة السوداء ، عن طريق الطباعة ثلاثية الأبعاد للعديد من المعدات الضرورية. نصف أيضا بروتوكول قياس إعادة التصفية عالي الدقة باستخدام اليرقات للجمع بين بيانات التمثيل الغذائي السلوكي والميتوكوندريا.

الملخص

لا جدال في فائدة ذبابة الفاكهة ككائن حي نموذجي لدراسة الأمراض والسلوكيات والبيولوجيا الأساسية التي تصيب الإنسان. على الرغم من عملية ، إلا أن أبحاث ذبابة الفاكهة تفتقر إلى الشعبية في البلدان النامية ، ربما بسبب الفكرة المضللة القائلة بأن إنشاء مختبر وإجراء تجارب ذات صلة بمثل هذه الحشرات الصغيرة أمر صعب ويتطلب أجهزة متخصصة باهظة الثمن. هنا ، نصف كيفية بناء flylab ميسور التكلفة لتحليل عدد لا يحصى من المعلمات السلوكية في D. melanogaster ، عن طريق الطباعة ثلاثية الأبعاد للعديد من المعدات الضرورية. نحن نقدم بروتوكولات لبناء رفوف قارورة داخلية ، وساحات مغازلة ، وأجهزة فحوصات حركية ، وما إلى ذلك ، لاستخدامها في الصيانة العامة للذباب وإجراء التجارب السلوكية باستخدام الذباب واليرقات البالغة. نقدم أيضا بروتوكولات حول كيفية استخدام أنظمة أكثر تعقيدا ، مثل أوكسيغراف عالي الدقة ، لقياس استهلاك الأكسجين في الميتوكوندريا في عينات اليرقات ، وإظهار ارتباطه بالتغيرات السلوكية في اليرقات عند التعبير الغريب للأوكسيداز البديل للميتوكوندريا (AOX). يزيد AOX من نشاط اليرقات وتنفس تسرب الميتوكوندريا ، ويسرع التطور في درجات حرارة منخفضة ، وهو ما يتوافق مع دور الإنزيم المولد للحرارة. نأمل أن تلهم هذه البروتوكولات الباحثين ، خاصة من البلدان النامية ، لاستخدام ذبابة الفاكهة للجمع بسهولة بين بيانات السلوك والتمثيل الغذائي للميتوكوندريا ، مما قد يؤدي إلى معلومات عن الجينات و / أو الظروف البيئية التي قد تنظم أيضا علم وظائف الأعضاء البشري وحالات المرض.

المقدمة

ذبابة الفاكهة السوداء تم تقديمه إلى المجتمع العلمي ككائن حي نموذجي قوي منذ أكثر من 100 عام. تم التحقق من صحة هذه الإمكانات بقوة في العديد من مجالات العلوم البيولوجية والطبية الحيوية ، مثل علم الوراثة ، والتطور ، والبيولوجيا التنموية ، وعلم الأحياء العصبي ، والبيولوجيا الجزيئية والخلوية. نتيجة لذلك ، تم منح ست جوائز نوبل في الطب أو علم وظائف الأعضاء لعشرة باحثين في ذبابة الفاكهة ساهموا بشكل كبير في فهمنا للوراثة ، والطفرات ، والمناعة الفطرية ، وإيقاعات الساعة البيولوجية ، والشم والتطور1. ربما الأهم من ذلك ، أن D. melanogaster لم يتوقف عن تزويدنا بنماذج جديدة لعلم الأحياء والأمراض البشرية ، حيث يكشف بحث سريع على PubMed عن ما يقرب من 600 منشور في السنوات الخمس الماضية ، باستخدام مصطلح البحث "ذبابة الفاكهة النموذج" (2 ، اعتبارا من فبراير 2021). في الولايات المتحدة ، حيث ذبابة الفاكهة هي كائن حي نموذجي واسع الانتشار في مجتمع الطب الحيوي ، تم تخصيص حوالي 2.2٪ من جميع جوائز أبحاث R01 الممنوحة من قبل المعاهد الوطنية للصحة في عام 2015 لباحثي ذبابة الفاكهة 3. في البرازيل ، من ناحية أخرى ، أظهر البحث عن المشاريع الممولة حاليا على الموقع الإلكتروني لمؤسسة ساو باولو للأبحاث (FAPESP) ، وهي أهم وكالة تمويل للبحث في جميع المجالات العلمية في ولاية ساو باولو ، 24 منحة وزمالة فقط مع ذبابة الفاكهة كموضوع رئيسي للدراسة4. بالنظر إلى جميع المشاريع البالغ عددها 13205 المشاريع الممولة حاليا من قبل FAPESP (5 ، اعتبارا من فبراير 2021) ، تمثل هذه المشاريع ال 24 ذبابة الفاكهة نسبة أقل من 0.2٪ من إجمالي المشاريع ، وهو ما يقرب من 12 ضعفا أقل من تلك الخاصة بالمعاهد الوطنية للصحة. إذا أزلنا المشاريع الممولة التي تهدف إلى دراسة ذبابة الفاكهة من وجهة نظر بيئية و / أو تطورية ، وافترضنا أن المشاريع المتبقية تستخدم هذا الكائن الحي كنموذج لفهم العمليات البيولوجية البشرية في الصحة والمرض ، فإن هذه النسبة تنخفض إلى ~ 0.1٪ صادمة.

في الواقع ، هناك ما يبرر إجراء تحقيق مناسب للكشف عن الأسباب التي تجعل أبحاث ذبابة الفاكهة في البرازيل / ساو باولو لا تبدو بنفس الأهمية في عدد المشاريع الممولة. زراعة ذبابة الفاكهة ليست مكلفة6،7،8 وهي بسيطة نسبيا ، على عكس الفقاريات ، لا يلزم الحصول على إذن من لجنة أخلاقيات علم الأحياء للتجربة9،10. ومع ذلك ، فإن الموافقة على العمل مع خطوط الذباب المعدلة وراثيا مطلوبة في البرازيل11 ، مما يضيف طبقة من البيروقراطية المتأصلة في جميع الأعمال التي تنطوي على كائنات معدلة وراثيا. ومع ذلك ، من المحتمل ألا يمنع هذا الباحثين المهتمين من بدء flylab. نتوقع أن المعلومات الخاطئة حول قوة النموذج ، وحول التكاليف المرتفعة المتوقعة المرتبطة بإنشاء flylab وإجراء تجارب ذات مغزى هي عوامل مهمة في هذا القرار. أما بالنسبة لمعظم المعدات والإمدادات العلمية ، فيجب استيراد الأجهزة المناسبة لإجراء الصيانة العامة للذباب والتحليلات السلوكية إلى البرازيل من أمريكا الشمالية وأوروبا و / أو أي مكان آخر ، وهي عملية مكلفة وتستغرق وقتا طويلاللغاية 12،13.

في الآونة الأخيرة ، ظهر بديل لاستيراد الأجهزة المتخصصة حيث أصبحت الطابعات ثلاثية الأبعاد ميسورة التكلفة ويمكن لأي شخص الوصول إليها ، بما في ذلك باحثي ذبابة الفاكهة في البلدان النامية. تم استخدام تقنية الطباعة ثلاثية الأبعاد على نطاق واسع في السنوات العشر الماضية من قبل أعضاء "ثقافة الصانع" ، والتي تستند إلى فكرة الاكتفاء الذاتي على الاعتماد حصريا على المنتجات المصنعة للشركة14. لطالما كانت هذه الفكرة موجودة في مختبرات البحث الأكاديمي في جميع أنحاء العالم ، لذلك ليس من المستغرب أن تصبح الطابعات ثلاثية الأبعاد معدات مختبرية قياسية في العديد من الأماكن15،16. لعدد من السنوات ، كنا نعمل على الطباعة ثلاثية الأبعاد لرفوف قارورة الذبابة ، وساحات التزاوج ، وأجهزة التسلق ، من بين أجهزة أخرى ، مقابل جزء بسيط من تكلفة المعادلات التي تحمل علامة تجارية. يتم تمثيل التكاليف المنخفضة لطباعة وتجميع معدات المختبرات محلية الصنع بشكل كلاسيكي بواسطة FlyPi ، والتي يمكن بناؤها بأقل من 100.00 يورو وتعمل كمجهر ضوئي ومضان قادر على استخدام التحفيز البصري والوراثي المتطور لأسماك الزرد القابلة للتتبع وراثيا ، ذبابة الفاكهة والديدان الخيطية15. هنا ، نقدم سلسلة من البروتوكولات لأي شخص مهتم بأن يصبح باحثا في ذبابة الفاكهة (أو في توسيع مختبر الطيران الحالي الخاص به) لطباعة العديد من المواد الضرورية ثلاثية الأبعاد. من خلال استثمار الوقت وتطوير القليل من الخبرة ، سيتمكن القارئ من تحسين البروتوكولات المعروضة هنا لأجهزة الطباعة التي تتكيف بشكل أفضل مع احتياجاته البحثية الخاصة.

ومع ذلك ، فإن flylab ليس مكانا للمعدات "الرخيصة" فقط ، خاصة عندما ينوي المرء ربط التحليلات السلوكية بظواهر التمثيل الغذائي الأساسية. لقد اهتممنا أيضا بأدوار الميتوكوندريا في تعديل الأنماط السلوكية ذبابة الفاكهة ، حيث أن هذه العضيات مسؤولة عن الإنتاج الأكبر ل ATP في معظم الأنسجة من خلال العديد من المسارات الأيضية التي تتلاقى منتجاتها مع الفسفرة المؤكسدة (OXPHOS). يتطلب تحليل استهلاك الأكسجين في الميتوكوندريا كوسيلة لفهم عملية التمثيل الغذائي للميتوكوندريا مقطعا ، وهو عبارة عن قطعة أكثر تطورا من المعدات التي للأسف لا يمكن طباعتها ثلاثية الأبعاد. نظرا لأن OXPHOS يؤثر عمليا على جميع العمليات الخلوية لأنه يعتمد على سلسلة من تفاعلات الأكسدة والاختزال الطاردة للطاقة التي تحدث في الخلية17،18 ، فإن معدلات استهلاك الأكسجين بناء على الركيزة القابلة للأكسدة المقدمة للميتوكوندريا قد تساعد في الكشف عما إذا كان عمل العضية سببا أو نتيجة لسلوك معين. لذلك ، نقدم هنا أيضا بروتوكولا لقياس استهلاك الأكسجين في الميتوكوندريا في عينات اليرقات ، حيث ندرك أن الغالبية العظمى من البروتوكولات المنشورة تركز على تحليل عينات البالغين. نظهر أن التغيرات في تنفس الميتوكوندريا ، الناجمة عن التعبير المعدل وراثيا للأوكسيداز البديل Ciona intestinalis (AOX) ، تؤدي إلى زيادة حركة اليرقات تحت الإجهاد البارد. ويرجع ذلك على الأرجح إلى توليد الحرارة ، نظرا لأن AOX عبارة عن أوكسيديز طرفي ضخ غير بروتوني يمكنه تجاوز نشاط مجمعات OXPHOS III و IV (CIII و CIV) ، دون المساهمة في إمكانات غشاء الميتوكوندريا (ΔΨm) وإنتاج ATP19،20،21. لا توجد حشرة ، بما في ذلك ذبابة الفاكهة ، أو الفقاريات تمتلك بشكل طبيعي AOX21،22،23 ، ولكن تعبيرها في عدد لا يحصى من الأنظمة النموذجية24،25،26،27،28،29 نجح في إظهار إمكاناتها العلاجية لحالات الإجهاد التنفسي العام للميتوكوندريا ، خاصة عندما يكون سببها CIII و / أو CIV الحمل الزائد. يمنح AOX مقاومة للمستويات السامة من مضادات المايسين A24 و cyanide24،25 ، ويخفف من الأنماط الظاهرية المتنوعة المتعلقة بخلل الميتوكوندريا24،25،30،31،32. حقيقة أن تعبير AOX يغير سلوك اليرقات ووظيفة الميتوكوندريا يبرر المزيد من الدراسات المتعمقة لأدوار هذا الإنزيم في التمثيل الغذائي وعلم وظائف الأعضاء لخلايا وأنسجة الميتازوان33،34.

نأمل أن نتمكن من خلال هذه المقالة في زيادة الوعي داخل المجتمع العلمي للبلدان النامية مثل البرازيل بأن استخدام مجموعة الأدوات الجينية الممتازة التي يقدمها D. melanogaster ، جنبا إلى جنب مع الأجهزة محلية الصنع الفعالة وبأسعار معقولة للتحليلات السلوكية ، يمكن أن تولد بيانات بحثية أساسية سريعة نسبيا حول العمليات البيولوجية المثيرة للاهتمام ذات التأثير الانتقالي الكبير ، دعم الدراسات العلاجية المستقبلية في البحوث السريرية. إن تطوير مثل هذه المثل المجتمعية من شأنه أن يفيد بشكل كبير ذبابة الحب والباحثين الطبيين والعلوم البيولوجية والطبية الحيوية. والأهم من ذلك ، أنه سيفيد المجتمع بشكل عام ، حيث يمكن استخدام التمويل العام بشكل أكثر ترجمة لفهم الأمراض البشرية وعلاجها.

تم تصميم البروتوكولات التي نقدمها هنا للطباعة ثلاثية الأبعاد لأجهزة flylab للاستخدام مع طابعة RepRap 3D ، بناء على طراز Prusa I3 DIY المتاح في35. نستخدم خيوط حمض البولي لاكتيك الأبيض (PLA) مقاس 1.75 مم (SUNLU) كمادة خام للطباعة ، ومنصة Tinkercad36 لتصميم النموذج ، وبرنامج Repetier-Host37 لتحويل STL إلى G-Code ، وهي خطوة ضرورية لتوفير إحداثيات للطابعة. مطلوب مزيد من التحسين للبروتوكولات إذا أراد القارئ استخدام معدات ومواد وبرامج بديلة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تصميم نموذج 1. 3D

ملاحظة: يتكون سير عمل الطباعة ثلاثية الأبعاد من ثلاث خطوات أساسية: (1) النمذجة ثلاثية الأبعاد. (2) استيراد النموذج إلى برنامج التقطيع ؛ و (3) اختيار الفتيل الصحيح ، وتكوين الطابعة ، وأخيرا الطباعة. يظهر أدناه بروتوكول أساسي لنمذجة رف / صينية قارورة ذبابة صغيرة ؛ يستخدم هذا الرف مع قوارير الذباب القياسية ، التي يبلغ قطرها حوالي 2.5 سم وارتفاعها 9.8 سم. بالنسبة لتصميمات النماذج الجديدة ، تسمح الأدوات التي يوفرها برنامج Tinkercad بالتعامل السهل مع الهياكل ثلاثية الأبعاد ، من خلال إنشاء قطع ذات أشكال وأحجام وسمك مختلفة ، وفقا لاحتياجات الفرد الخاصة. بالنسبة للذبابة الذين يغامرون لأول مرة في عالم الطباعة ثلاثية الأبعاد ، فإن اتباع البروتوكولات أدناه ، حتى مع كل تفاصيلها ، قد لا يزال يمثل تحديا ، لذلك نوصي بشدة بالتعرف على البرنامج للحصول على أفضل النتائج.

  1. قم بتسجيل الدخول إلى Tinkercad عبر الإنترنت38 (الشكل 1 أ). التسجيل المسبق بالمعلومات الشخصية مطلوب للوصول إلى المنصة مجانا.
  2. انقر فوق إنشاء مشروع جديد لبدء تصميم جديد ، وأعد تسمية المشروع وفقا لذلك في الزاوية اليمنى العليا من النافذة. اضغط على Enter ليتم توجيهك إلى مستوى عمل المشروع (الشكل 1 ب).
  3. تحقق مما إذا كانت مستوى العمل يحتوي على الأبعاد الصحيحة 200 مم × 200 مم ، عن طريق النقر باستخدام الزر الأيسر للماوس على تحرير الشبكة في الزاوية اليمنى السفلية (المربع الأحمر في الشكل 1 ب). في النافذة المنبثقة (الشكل 1C) ، تأكد من أن "الوحدات" ملليمترات ، وأن "الإعدادات المسبقة" افتراضية. أدخل 200.00 في حقلي "العرض" و "الطول" ، وانقر فوق تحديث الشبكة لحفظ التغييرات.
  4. تحقق مما إذا كانت Snap Grid مضبوطة على 1.0 مم (مربع أحمر في الشكل 1B). إذا لم يكن الأمر كذلك ، فانقر فوق القائمة المنسدلة وحدد 1.0 مم.
  5. ضمن قائمة الأشكال الأساسية على اليمين (المربع الأزرق 2 في الشكل 1 ب)، حدد مربعا ثابتا واسحبه إلى منتصف مستوى العمل.
  6. انقر في أي مكان على المربع في مستوى العمل باستخدام الزر الأيسر للماوس لرؤية حوافه ورؤوسه. انقر فوق أي رأس (والذي سيتحول بعد ذلك إلى اللون الأحمر) لإظهار أبعاد المربع (المربعات الحمراء في الشكل 1D). انقر باستخدام الزر الأيسر للماوس على كل بعد واكتب 130 مم للطول (L) و 130 مم للعرض (W) و 40 مم للارتفاع (H). أعد توسيط الصندوق عن طريق سحبه إلى منتصف مستوى العمل.
  7. انقر فوق الأداة المسطرة في الزاوية اليمنى العليا من الشاشة (المربع الأحمر 1 في الشكل 1E). انقر على الفور على الرأس الأيسر السفلي للمربع ، كما هو موضح في الشكل 1E (المربع الأحمر 2) ، لتعيين النقطة الأولية (x = 0 ، y = 0 ، z = 0) لنظام إحداثيات ديكارتية ثلاثي الأبعاد. لاحظ أن المسافة بين الرأس المحدد والنقطة الأولية للإحداثيات ستظهر الآن (مربعات حمراء في الشكل 1F) ، حيث تمثل "A" و "B" و "C" المسافة إلى محاور x و y و z (والتي يجب أن تكون صفرا في هذه الحالة) ، على التوالي.
  8. بعد ذلك ، حدد مربعا فارغا (ثقب) من قائمة الأشكال الأساسية على اليمين (المربع الأزرق 2 في الشكل 1 ب) واسحبه إلى مستوى العمل. اضبط أبعاده على 30 (طول) × 30 (عرض) × 40 (ارتفاع) مم ، وارفعه 2 مم من مستوى العمل ، عن طريق كتابة "2.00" في مربع النص بجوار رأس السهم الأخضر في الزاوية اليمنى السفلية من المربع الفارغ (مربع أحمر في الشكل 1G). ضع المربع الفارغ داخل الصندوق الصلب على بعد 2 مم من النقطة الأولية لإحداثيات x ، y ، عن طريق كتابة "2.00" في مربعات النص بجوار الأسهم الخضراء في الزاوية اليسرى السفلية من المربع (المربعات الحمراء في الشكل 1H ؛ قارن مع الشكل 1G).
  9. مع استمرار تحديد المربع الفارغ ، اضغط على مفاتيح CtrL + D على لوحة المفاتيح لنشر الأمر "تكرار" وإنشاء مربع فارغ جديد بنفس الأبعاد بالضبط. ضع المربع الفارغ الجديد داخل المربع الثابت ، بجوار المربع الفارغ الأول ، عن طريق كتابة "34.00" في مربع النص بجوار السهم الأخضر على طول المحور y ، و "2.00" في مربعات النص بجوار السهمين الأخضر المتبقيين (المربعات الحمراء في الشكل 1I).
  10. كرر هذه الخطوة، مع ضبط المسافات الصحيحة من نقطة الإحداثيات الأولية، حتى يمتلئ الصندوق الصلب بأكمله بصناديق فارغة متباعدة بمقدار 2 مم عن بعضها البعض (الشكل 1J).
  11. حدد جميع المربعات (الصلبة والفارغة) بالنقر فوق الزر الأيسر للماوس والسحب إلى المنطقة بأكملها. اضغط على مفاتيح CtrL + G على لوحة المفاتيح لنشر الأمر "group" وإنشاء مربع واحد به 16 مساحة فارغة لقوارير الذباب (الشكل 1K). هذا هو التصميم النهائي لرف القارورة.
  12. انقر فوق تصدير في الزاوية اليمنى العليا من نافذة Tinkercad. في مربع النافذة المعروض (الشكل 1L)، حدد كل شيء في التصميم بجوار تضمين و . STL ضمن للطباعة ثلاثية الأبعاد كنوع الملف. اختر اسما مناسبا لملف التصميم واحفظه في مكان مناسب في الكمبيوتر.

طباعة 2. 3D

ملاحظة: في هذا القسم، نقدم إرشادات حول كيفية استخدام ملف STL الذي تم إنشاؤه في الخطوة 1 وتحويله إلى ملف G-Code الذي يحتوي على تعليمات الطباعة إلى طابعة ثلاثية الأبعاد. هذه هي عملية التقطيع ، والتي نستخدم من أجلها برنامج Repetier-Host.

  1. قم بتنزيل الملف التكميلي 1 واحفظه في مكان مناسب في الكمبيوتر. هذا ملف .rcp يحتوي على تكوينات الطابعة التي سيتم إستخدامها أدناه. للحصول على مزيد من المعلومات حول نوع ملف .rcp ، يرجى زيارة39.
  2. افتح برنامج Repetier-Host ، الذي يجب تثبيته بالفعل على الكمبيوتر ، باتباع التعليمات الواردة في37. اضغط على مفاتيح CtrL+O على لوحة المفاتيح لفتح ملف STL على الكمبيوتر الذي تم إنشاؤه في البروتوكول 1.
  3. بمجرد الفتح ، انقر فوق رف القارورة المصمم واضغط على مفتاح R على لوحة المفاتيح لفتح قائمة التحرير على الجانب الأيمن من الشاشة (المربع الأحمر 1 في الشكل 2 أ). قم بتركيز الكائن على جدول الطباعة بالنقر فوق الزر " كائن مركزي" ، المشار إليه بالمربع الأحمر 2 في الشكل 2A، في علامة التبويب "وضع الكائن ".
  4. انقر فوق علامة التبويب Slicer (المربع الأحمر 1 في الشكل 2 ب) بجوار علامة التبويب Object Placement ، ثم انقر فوق زر التكوين (المربع الأحمر 2 في الشكل 2 ب) أدناه. لاحظ أنه سيتم فتح نافذة جديدة على اليسار حيث يمكن تحديد معلمات الطابعة مثل السرعة وسمك الطبقة والحوامل (انظر المزيد من التفاصيل في المناقشة أدناه).
  5. انقر فوق الزر استيراد (المربع الأحمر 3 في الشكل 2E) ، وحدد الملف التكميلي 1 من الملفات ، واضغط على Enter. لاحظ أن ملف .rcp هذا (الذي تم تنزيله في الخطوة 2.1) يوفر معلمات التكوين التلقائي للطابعة التي قمنا بتحسينها لحامل القارورة هذا.
  6. لإنهاء تكوين معلمات الطباعة، حدد لا شيء لنوع الدعم في القائمة الموجودة على اليمين (المربع الأحمر 4 في الشكل 2E)، حيث لا تتطلب طباعة هذه القطعة دعما لمنع الانحناء أو التشوهات الأخرى. في كثافة الحشو (المربع الأحمر 5 في الشكل 2E) ، اختر 20٪ لإنشاء هيكل صلب (انظر المزيد من التفاصيل حول هذه المعلمات في المناقشة أدناه).
  7. انقر فوق شريحة باستخدام CuraEngine في الزاوية اليمنى العليا من الشاشة لتشغيل برنامج التقطيع وإنشاء G-Code ، الذي يحتوي على المعلومات اللازمة للطابعة لطباعة القطعة. لاحظ أنه ضمن علامة التبويب معاينة الطباعة في القائمة الموجودة على اليمين (بجوار علامة التبويب مقسم طريقة العرض)، ستظهر بعد ذلك معلومات حول الوقت وكمية المواد المطلوبة لإكمال مهمة الطباعة (المربع الأحمر 1 في الشكل 2F).
  8. انقر فوق حفظ للطباعة SD لحفظ ملف G-Code في بطاقة SD (المربع الأحمر 2 في الشكل 2F). لاحظ أن G-Code يحتوي على إحداثيات ثلاثية الأبعاد للقطعة المصممة ، مقطعة إلى طبقات ، لوظيفة الطابعة بشكل صحيح.
  9. أدخل بطاقة SD في طابعة RepRap 3D، ثم اتبع المعلومات المعروضة على شاشة الطابعة لتحديد الطباعة من بطاقة SD.
  10. حدد ملف G-Code الخاص بحامل القارورة. لاحظ أن الطابعة ستقوم تلقائيا بالإحماء والبدء في طباعة القطعة المصممة ، الأمر الذي يجب أن يستغرق عدة ساعات. يجب أن يكون الحامل (الشكل 3 أ) جاهزا للاستخدام فور اكتمال مهمة الطباعة.

3. أجهزة التحليل السلوكي

ملاحظة: يمكن تكرار الخطوات الموضحة في البروتوكولين 1 و2 مع إجراء التعديلات المناسبة لطباعة العديد من القطع المطلوبة من معدات المختبر. ومع ذلك ، فإننا ندرك أن تصميم قطع جديدة قد يكون صعبا ويستغرق وقتا طويلا للمستخدمين المبتدئين ل Tinkercad ، لذلك بدلا من توفير بروتوكولات خطوة بخطوة حول كيفية تصميم جميع النماذج ، فإننا نوفر للتنزيل العديد من نماذج التصميم التي أنشأناها كملفات STL (انظر الملفات التكميلية 2-11).

  1. قم بتنزيل الملف التكميلي 2 لنموذج قمع صغير (الشكل 3 ب) ، يستخدم بشكل روتيني في flylabs للمساعدة في نقل الذباب البالغ إلى قوارير أو زجاجات جديدة عن طريق تجنب ذباب الزحف إلى الجدران الداخلية لهذه الحاويات للهروب.
  2. قم بتنزيل الملف التكميلي 3 للحصول على دعم حصيرة التنصت (الشكل 3C) ، والذي يمكن أن يحمل رغوة أسيتات الإيثيلين والفينيل أو حصيرة قطنية سميكة يمكن النقر عليها قوارير زجاجية أو زجاجات عندما يقلب المرء الذباب في حاويات جديدة مع طعام طازج.
  3. قم بتنزيل الملف التكميلي 4 والملف التكميلي 5 لطراز حامل الكاميرا الذي أطلقنا عليه اسم Stalker (الشكل 3D).
    ملاحظة: يسمح الجهاز بوضع أي كاميرا (احترافية ، كاميرات ويب ، هواتف محمولة ، إلخ) فوق قاعدة حيث يمكن تصوير طبق بتري يحتوي على يرقات أو ذباب بالغ أو تسجيل الفيديو. يسمح Stalker بتصوير سلوك الذي يحدث أفقيا ، دائما على نفس المسافة من طبق بتري ، مما يتجنب إدخال التباين في القياسات التجريبية إذا كان يجب إجراء التسجيلات في أيام مختلفة ، على سبيل المثال ، أو إذا كانت الكاميرا بحاجة إلى استخدامها لغرض آخر بين التسجيلات. الجهاز معياري بشكل ملائم ويمكن تجميعه بسهولة بعد طباعة القاعدة والجزء العلوي من الملف التكميلي 4 ، والجوانب من الملف التكميلي 5. تساعد المربعات التي تبلغ مساحتها 1 سم2 في القاعدة ، والتي يمكن تمييزها باستخدام علامة دائمة ، على تتبع المسافة التي تقطعها الفردية. اطبع الجهاز (على الأقل القاعدة) باستخدام خيوط بيضاء ، بحيث يكون هناك تباين كاف بين الخلفية لبرنامج التتبع لتحديد كل ذبابة.
  4. قم بتنزيل الملف التكميلي 6 للتصميم القابل للطباعة لموتيل Fly (الشكل 3E) ، والذي يحتوي على عشر ساحات للتغازل والتزاوج (غرف) منظمة بطريقة لتسهيل تسجيلات الفيديو لعشرة أزواج تزاوج فردية في وقت واحد. لاحظ أن Fly Motel يعتمد على الجهاز المنشور فيعام 40 ، حيث تم العثور على شرح مفصل لاستخدامه في الدراسات السلوكية. بالإضافة إلى الأجزاء المطبوعة ثلاثية الأبعاد ، يتطلب الجهاز 12 برغيا (3 × 8 مم) لتثبيت الجزء العلوي على الجزء السفلي لتثبيت الجهاز المجمع ، ولوحة أكريليك (60 × 60 × 3 مم) ، وسحاب محكم. نظرا لأن هيكل Fly Motel أكثر تعقيدا ، فإننا نقدم أيضا مقطع فيديو تعليميا (ملف تكميلي 7) حول كيفية تجميعه بشكل صحيح ، نظرا لتوفر جميع القطع المطلوبة ومفك البراغي.
  5. قم بتنزيل الملف التكميلي 8 لنموذج T-Maze (الشكل 3F) ، والذي يستخدم لمقايسات الذاكرة باستخدام الذباب البالغ. تم العثور على شرح مفصل لكيفية استخدام T-Maze لجعل الذباب يربط محفزات الرائحة المثيرة للاشمئزاز بسلوكهم الضوئي في المنشور الأصلي41. يستخدم الجهاز أيضا أنبوبين مخروطيين شفافين سعة 15 مل ، وهما موجودان بشكل شائع في أي مختبر ومتصلان بالفتحات الدائرية التي يبلغ عرضها 2 سم في كل جانب من جوانب القطعة المركزية. لاحظ أن طباعة T-Maze تتطلب دعما (انظر مزيد من التفاصيل في وسيلة الإيضاح في الشكل 2). حدد "في كل مكان" لنوع الدعم (المربع الأحمر 4 في الشكل 2E) بعد اتباع الخطوات 2.1-2.6 أعلاه.
  6. قم بتنزيل الملف التكميلي 9 والملف التكميلي 10 لتصميم الأجزاء القابلة للطباعة من نسختنا من الجهاز لمقايسات التاكسي الجيولوجي السلبي التكراري السريع (RING) (الشكل 3G) ، المستخدمة لإجراء فحوصات التسلق مع الذباب البالغ من عدة أنماط وراثية أو ظروف بيئية في وقت واحد ، مما يولد نتائج بطريقة أكثر توحيدا وإنتاجيةأعلى 42. جهاز RING معياري أيضا ، بالإضافة إلى الأجزاء المطبوعة ثلاثية الأبعاد ، فإنه يتطلب قطعا أخرى يمكن شراؤها بسهولة عبر الإنترنت أو في متجر لاجهزة الكمبيوتر بتكلفة منخفضة: عمودان مصححان Φ8 × 300 مم ، وأربعة محامل خطية Φ8 مم ، وأشرطة مطاطية (أو قطع من خيط) ، قطعة من الخشب 240 × 60 × 20 مم للقاعدة ، وثمانية مسامير خشبية (8 مم) لتثبيت الأجزاء المطبوعة على القاعدة الخشبية. قم بتنزيل الملف التكميلي 11 للحصول على إرشادات حول كيفية تجميع الجهاز بمجرد طباعة جميع الأجزاء أو شرائها. تم العثور على شرح مفصل لكيفية استخدام جهاز RING في المنشور الأصلي42.

4. فحص حركة اليرقات

ملاحظة: لقد قمنا بتحسين هذا البروتوكول ، الذي اعتمد في الأصل على Nichols et al.42 ، لدراسة تأثيرات تعبير AOX على تطور ذبابة الفاكهة تحت الإجهاد البارد. تم استزراع الخطين 3xtubAOX25 و w1118 ، المستخدمة كأمثلة على يرقات AOX التعبيرية عن AOX والتحكم ، على التوالي ، على النظام الغذائي القياسي24 عند 12 درجة مئوية ، وفقا ل Saari et al.34. نوصي بهذا البروتوكول لتحليل حركة عينات اليرقات من أي حالة وراثية ، مستزرعة في أي ظروف بيئية ذات أهمية.

  1. قم بإعداد أطباق أجار بنسبة 2٪ عن طريق غلي الكمية المكافئة من الأجار في الماء منزوع الأيونات ، وصبها في أطباق بتري Φ90 × 15 مم ، والسماح لها بالتصلب في درجة حرارة الغرفة. بالنسبة للأطباق ذات الحجم النهائي 20 مل لكل منها ، استخدم 0.4 غرام من أجار.
  2. اجمع يرقات L3 المتجولة بعناية من جانب قوارير / قوارير الاستزراع باستخدام زوج من ملقط الأطراف المستديرة أو فرشاة ، وضع الأفراد في طبق بتري Φ90 × 15 مم مع ماء منزوع الأيونات لمدة تقل عن 10 ثوان لشطف جزيئات الطعام المتصلة بأجسامهم.
  3. انقل اليرقة الفردية إلى أطباق مع الاغاروز وانتظر 5 دقائق حتى تتأقلم.
  4. ضع الأطباق التي تحتوي على اليرقة الفردية فوق ورقة رسم بياني (0.2 سم2 شبكة) ، واحسب عدد الخطوط التي عبرها لمدة دقيقة واحدة ، وهو يتحرك فوق الأجار. يمثل كل خط متقاطع مسافة 2 مم. كرر الإجراء مع نفس الفرد 10-15 مرة للحصول على التكرارات الفنية.
  5. كرر الخطوة 4.4 مع ما لا يقل عن 8-10 أفراد من أنابيب / قوارير مختلفة ، يتم استزراعها في أوقات مختلفة للحصول على مكررات بيولوجية من نفس الخط.
  6. كرر الخطوتين 4.4 و 4.5 للحصول على بيانات لخط الطيران الآخر (أو لأكبر عدد من الأسطر التي ينوي المرء تحليلها).
  7. يمكن استخدام نفس اليرقات الفردية المستخدمة في الخطوات 4.4-4.6 للحصول على بيانات إضافية عن حركة الجسم عن طريق وضع أطباق أجار مع يرقة فردية تحت مجهر مجسم وحساب عدد الانقباضات التمعجية لجدار الجسم لمدة دقيقة واحدة. الحصول على التكرارات التقنية والبيولوجية لتقدير متوسط التنقل بين خطوط الذباب التي تم تحليلها.
  8. قم بتطبيق الاختبار الإحصائي لحساب احتمالية تمييز قيم معلمات حركة اليرقات هذه بين خطوط الاهتمام. نظرا لأننا نقارن هنا البيانات من سطرين فقط ، فقد يتم تطبيق اختبار t للطالب.

5. قياس إعادة التصنيعية للميتوكوندريا باستخدام متجانسات اليرقات

ملاحظة: تم تحسين البروتوكول التالي لقياس استهلاك الأكسجين في الميتوكوندريا من متجانسات اليرقات لخط AOX-expression 3xtubAOX والتحكم w1118 ، المستزرعة عند 12 درجة مئوية ، لكننا نوصي أيضا باستخدامه لعينات اليرقات من أي ظروف وراثية وبيئية. نحن ندرك أنه لا ينبغي تضمين إجراء مثل هذه التجارب كهدف "ميسور التكلفة" لمختبر الطيران "محلي الصنع" ، على عكس جميع البروتوكولات الأخرى التي نقدمها في هذه المقالة ، حيث يجب إجراء استثمار أولي كبير للمختبر للحصول على أوكسجراف عالي الدقة. سيتم استخدام البروتوكول مع Oxygraph-2k (O2k) وبرنامج DatLab من Oroboros Instruments ، لذلك يلزم إجراء مزيد من التحسين إذا أراد القارئ استخدام جهاز بديل.

  1. قم بتشغيل O2k وابدأ تشغيل برنامج DatLab في الكمبيوتر المتصل بالoxygraph. يجب أن تبدأ القضبان المغناطيسية داخل غرف الفحص في التقليب تلقائيا. قم بإزالة محلول تخزين الإيثانول من الغرف.
  2. اغسل الغرف 3 مرات على الأقل بالإيثانول بنسبة 100٪ و 3 مرات بالماء عالي النقاء.
  3. في DatLab ، سيتم فتح نافذة O2k Control تلقائيا. في درجة حرارة الكتلة [°C]، أدخل 12 درجة مئوية (أو درجة الحرارة المفضلة في حدود 2-47 درجة مئوية) واضغط على موافق.
  4. سيتم بعد ذلك فتح نافذة ثانية ، تحرير التجربة ، تلقائيا. أدخل أسماء العينات في حقول العينة ، وفقا لما سيتم إضافته في الغرفتين A وB، واضغط على حفظ.
  5. أضف 1800 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص (120 ملي مولار KCl ، 5 ملي مولار KH2PO4 ، 3 ملي هيبس ، 1 ملي مولار EGTA ، 1 ملي ملي MgCl2 ، 2٪ BSA ، درجة الحموضة 7.4) في كل غرفة وأغلقها جزئيا ، مع السماح بتبادل الأكسجين مع الهواء الخارجي. اسمح لتركيز الأكسجين وإشارات تدفق الأكسجين بالاستقرار ، مع إظهار الحد الأدنى من التقلبات لمدة 10 دقائق على الأقل. ستوفر هذه الخطوة معايرة الجهاز بالهواء الخارجي في يوم التجربة (انظر الخطوتين 6.3 و 6.4 أدناه للحصول على مزيد من التفاصيل حول المعايرة التجريبية).
  6. أثناء خطوة معايرة الهواء ، ابدأ في تحضير العينات عن طريق الجمع بعناية من أنابيب / قوارير الاستزراع 20 يرقة متجولة من النمط الجيني المناسب ، باستخدام زوج من الملقط أو فرشاة رسم صغيرة.
  7. اشطف كل يرقة بسرعة ولكن جيدا بالماء منزوع الأيونات أو 1x PBS (137 ملي كلوريد الصوديوم ، 2.7 ملي كلوريد الصوديوم ، 8 ملي Na2HPO4 و 2 ملي KH2PO4) وانقلها إلى الخالط الزجاجي سعة 1 مل على الثلج ، يحتوي على 500 ميكرولتر من عازل العزل المثلج البارد (250 ملي مولار سكروز ، 5 ملي مولار تريس حمض الهيدروكلوريك ، 2 ملي مولار EGTA ، درجة الحموضة 7.4)
  8. قم بتجانس اليرقات بأكملها ب 5 ضربات وصب التجانس في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل على الجليد.
  9. أضف 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للعزل إلى الخالط الزجاجي ، ونقع أنسجة اليرقات المتبقية ب 3 ضربات ، واسكب التجانس مرة أخرى في نفس أنبوب الطرد المركزي الدقيق على الجليد.
  10. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للعزل إلى الخالط الزجاجي ، ونقع أنسجة اليرقات المتبقية بضربتين ، واسكب الجانس مرة أخرى في نفس أنبوب الطرد المركزي الدقيق على الجليد.
  11. امزج المتجانس النهائي (~ 1 مل) عن طريق قلب الأنبوب مرتين برفق واحتفظ به على الجليد حتى تتم معالجة العينة الثانية.
  12. كرر الخطوات 5.6-5.11 للحصول على تجانس اليرقات للنمط الجيني الآخر.
  13. افتح غرفتي الأوكسيغراف A و B ، وانقل 200 ميكرولتر من كل متجانس إلى المخزن المؤقت للفحص في كل غرفة ، والذي يجب أن يكون بالضبط عند 12 درجة مئوية في هذه المرحلة. أغلق الغرف تماما واترك تركيز الأكسجين وإشارات تدفق الأكسجين تستقر لمدة 10 دقائق تقريبا.
  14. ابدأ قياسات استهلاك الأكسجين عن طريق إضافة 5 ميكرولتر من محلول 2 M pyruvate و 2 M proline (التركيز النهائي في الغرف = 5 ملي مولار لكل منهما) و 7.5 ميكرولتر من محلول 0.4 M malate (1.5 mM). اترك 5 دقائق على الأقل لتثبيت الإشارة. لاحظ أنه في هذه المرحلة ، سيتم شحن الميتوكوندريا بركائز قابلة للأكسدة لبدء تفاعلات دورة حمض ثلاثي الكربوكسيل (TCA). قد تكون أي زيادة في إشارة استهلاك الأكسجين ناتجة عن وظائف بروتينات الفصل (أو بسبب ظواهر فك الاقتران الأخرى) ، ويمكن استخدامها لحساب التنفس العام غير المقترن (يشار إليه أيضا باسم التنفس المتسرب في حالة عدم وجود الأدينيلات ، LN- انظر النتائج التمثيلية للحصول على التفاصيل).
  15. أضف إلى كل غرفة 4 ميكرولتر من محلول 0.5 M ADP (1 مللي مولار) واترك 5 دقائق على الأقل لتثبيت الإشارة. عادة ما يتم ملاحظة زيادة كبيرة في إشارة استهلاك الأكسجين على الفور ، والتي تمثل التنفس الفسفري المؤكسد (OXPHOS). الغالبية العظمى من تنفس OXPHOS مدفوع بالمركب I (CI).
  16. أضف إلى كل غرفة 2 ميكرولتر من محلول 0.05 M antimycin A (0.05 mM) لتثبيط CIII ، واترك 5 دقائق على الأقل لتثبيت الإشارة. يجب ملاحظة انخفاض في إشارة استهلاك الأكسجين وصولا إلى المستويات القاعدية التي شوهدت قبل إضافة البيروفات والبرولين والمالات لعينة التحكم w1118 . سيكون تنفس الميتوكوندريا من اليرقات التي تعبر عن AOX مقاوما جزئيا لمضادات المايسين-A ، حيث يمكن الآن توجيه الإلكترونات إلى AOX. يجب أن يبقى حوالي 40٪ من إجمالي تنفس OXPHOS بعد تثبيط CIII ، والذي يجب أن يكون مدعوما بالكامل بواسطة AOX فقط.
  17. أضف إلى كل غرفة 4 ميكرولتر من محلول 0.1 م بروبيل غالات (0.2 ملي مولار) لتثبيط AOX ، واترك 15 دقيقة على الأقل لتثبيت الإشارة. يجب أن تنخفض مستويات استهلاك الأكسجين في عينات اليرقات التي تعبر عن AOX الآن إلى المستويات القاعدية التي شوهدت قبل إضافة البيروفات والبرولين والمالات. يثبت هذا الانخفاض أن التنفس المقاوم لمضادات المايسين A الذي لوحظ يرجع إلى وظيفة AOX.
  18. أضف إلى كل غرفة 1 ميكرولتر 0.01 م روتينون (0.005 مللي مولار) لتثبيط CI ، واترك 5 دقائق على الأقل لتثبيت الإشارة للحصول على إشارة استهلاك الأكسجين للعينة المستقلة عن تنفس الميتوكوندريا. عادة ما تكون هذه الإشارة منخفضة مثل تلك التي لوحظت قبل إضافة البيروفات والبرولين والمالات.
  19. احفظ التجربة وأغلق برنامج DatLab.

6. معالجة بيانات قياس الميتوكوندريا

ملاحظة: يتم الحصول على قيم استهلاك الأكسجين كمتوسط لإشارات تدفق الأكسجين في فترة زمنية محددة ويتم التعبير عنها على أنها pmol O2 المستهلكة في الثانية لكل مجم من البروتين الكلي في العينة. تتم الإشارة إلى القيم أولا مقابل الحد الأقصى لتركيز الأكسجين المتاح في المخزن المؤقت للفحص في يوم التجربة ، بناء على درجة الحرارة التجريبية (يشار إليها باسم تشبع الهواء) ، والحد الأدنى لتركيز الأكسجين ، والذي تم تحديده مسبقا في كل غرفة عن طريق إضافة Na2S2O4 إلى المخزن المؤقت للفحص (انظر 43 لإرشادات الشركة المصنعة للحصول على معايرة الأكسجين الصفر). يتم تطبيع القيم أيضا من خلال كمية البروتين الكلي في متجانسات اليرقات المضافة إلى مخزن الفحص لكل غرفة.

  1. حدد تركيز البروتين الكلي لكل عينة باستخدام طريقة برادفورد44. أعد فتح التجربة المحفوظة على برنامج DatLab ، واضغط على تجربة في القائمة العلوية ، ثم تحرير. في النافذة المفتوحة ، حدد mg في قسم الوحدة وفي قسم الكمية أدخل كمية البروتين الموجودة في 200 ميكرولتر من العينة المضافة في كل غرفة. سيتم حساب التركيز تلقائيا بواسطة البرنامج ، مع الأخذ في الاعتبار الحجم الكلي للغرفة البالغ 2 مل. اضغط على زر حفظ .
  2. اضغط على الرسم البياني في القائمة العلوية، ثم حدد المخططات. في النافذة المفتوحة، حدد التدفق لكل كتلة لكل من الرسم البياني (1 و2، اللذين يشيران إلى الغرفتين A وB على التوالي). اضغط على موافق. يتم الآن تطبيع النتيجة التجريبية من خلال تركيز البروتين للعينات (بروتين إجمالي PMOLO 2 / s / mg).
  3. في الزاوية اليمنى العليا من كل رسم بياني (1 و 2) من صفحة النتائج التجريبية الرئيسية ، انقر فوق تركيز O2. على طول المحور x ، حدد نطاقا زمنيا قبل إضافة العينات في الغرف ، حيث يكون تركيز الأكسجين وإشارات التدفق مستقرة للغاية.
    1. اضغط مع الاستمرار على مفتاح Shift على لوحة مفاتيح الكمبيوتر ، وانقر بزر الماوس الأيسر في الوقت الأولي المحدد ، واسحب المؤشر على طول محور الوقت لتحديد المنطقة المطلوبة ، ثم حرر زر الماوس. قم بهذا الإجراء لكل رسم بياني على حدة.
    2. انقر نقرا مزدوجا فوق الأشرطة الزرقاء للمناطق المحددة في الجزء السفلي من الرسوم البيانية ، واكتب "الهواء" للإشارة إلى أن هذه هي المناطق المحددة المستخدمة لحساب تشبع هواء الأكسجين.
  4. انقر فوق معايرة في شريط القائمة العلوي ، وحدد A: Oxygen ، O2 لمعايرة الغرفة A. في النافذة المفتوحة، تحقق من تحديد O2 Calib (اللون الأصفر).
    1. للمعايرة الصفرية ، انقر فوق نسخ من ملف واختر الملف الذي يحتوي على معايرة الأكسجين الصفري التي تم إجراؤها مسبقا (انظر 43 للحصول على إرشادات الشركة المصنعة).
    2. لمعايرة الهواء، حدد الهواء في عمود تحديد علامة. انقر فوق معايرة وانسخ إلى الحافظة.
  5. انقر فوق معايرة في شريط القائمة العلوي ، وحدد B: Oxygen ، O2 وكرر الخطوة 6.4 لمعايرة الغرفة B.
  6. في الزاوية اليمنى العليا من كل رسم بياني (1 و 2) من صفحة النتائج التجريبية الرئيسية ، انقر فوق O2 التدفق لكل كتلة. حدد المناطق المستقرة المطلوبة لإشارة استهلاك الأكسجين عن طريق الضغط باستمرار على مفتاح Shift على لوحة المفاتيح، والنقر بزر الماوس الأيسر، وسحب المؤشر على طول المحور الزمني. تمثل المناطق المستقرة المختارة بين إضافات البيروفات/البرولين/مالات وADP LN. بين ADP وantimycin A, OXPHOS; بين antimycin A و propyl gallate (عند تثبيط CIII) ، التنفس المقاوم للمضادات المايسين A ؛ بين بروبيل غالات وروتينون (عند تثبيط CIII + AOX) ، التنفس المتبقي. بعد روتينون (عند تثبيط CI + CIII + AOX) ، التنفس المتبقي غير الميتوكوندريا. انقر نقرا مزدوجا فوق الأشرطة الحمراء للمناطق المحددة في أسفل الرسوم البيانية ، وأدخل التسميات المناسبة.
  7. انقر فوق علامات في شريط القائمة العلوي ، ثم الإحصائيات. في علامة التبويب إظهار في النافذة المفتوحة، قم بإلغاء تحديد جميع الخيارات باستثناء تدفق O2 لكل كتلة. في علامة التبويب تحديد في نفس النافذة ، حدد الغرفة A للحصول على بيانات التنفس للعينة الأولى. انقر فوق نسخ إلى الحافظة والصق البيانات في جدول بيانات. كرر الإجراء للحصول على بيانات العينة الثانية في الغرفة B.
  8. في جدول بيانات ، اطرح جميع قيم التنفس عن طريق التنفس المتبقي غير الميتوكوندريا (البيانات بعد إضافة الروتينون). احسب المتوسطات من النسخ المتماثلة التجريبية المتعددة وارسم البيانات حسب الرغبة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

باتباع الخطوات الواردة في البروتوكولين 1 و 2 ، يجب أن يكون المرء قادرا على تصميم رف قارورة ذبابة بسيط ، وتشغيل ملف STL النموذجي من خلال برنامج التقطيع لإنشاء إحداثيات للطابعة ثلاثية الأبعاد. يوضح الشكل 3 أ وحدة مطبوعة للنموذج بجوار تصميمه. نأمل أيضا أن توفر الخطوة 1 المهارات الأساسية للمرء لاستخدام الأشكال الأساسية المتوفرة في منصة Tinkercad لإنشاء أجهزة مفيدة للمختبر. ومع ذلك ، قد يتطلب تطوير هذه المهارات ممارسة مستمرة واستشارات متكررة من مركز مساعدة Tinkercad45. في ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تهدف بروتوكولات الطباعة ثلاثية الأبعاد وملفات STL المتوفرة هنا إلى تسهيل إعداد مختبر طيران جديد أو زيادة ذخيرة الأجهزة في منشأة سلوكية ذبابة الفاكهة الحالية ، باستخدام معدات "محلية الصنع". قد تكون استراتيجية الطباعة ثلاثية الأبعاد مفيدة بشكل خاص في البلدان النامية مثل البرازيل ، حيث يبدو أن البحث باستخدام ذبابة الفاكهة ككائن حي نموذجي لدراسة علم الأحياء البشري غير ممثل تمثيلا ناقصا ، والمعدات المتخصصة مكلفة. توفر بروتوكولاتنا إرشادات حول كيفية إنشاء الإطار البلاستيكي وت...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

نود أن نشكر إميلي أ. ماكيني على التحرير باللغة الإنجليزية للمخطوطة. تم دعم GSG من خلال زمالة من Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq، المنحة رقم 141001/2019-4). تود M.T.O. أن تعترف بالتمويل المقدم من Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP ، أرقام المنح 2014/02253-6 و 2017/04372-0) ، و CNPq (أرقام المنح 424562/2018-9 و 306974/2017-7). C.A.C.-L. أود أن نعرب عن تقديري للدعم المالي الداخلي من جامعة أويست باوليستا. تم التصريح بالعمل مع خطوط ذبابة الفاكهة المعدلة وراثيا من قبل اللجنة المحلية للسلامة البيولوجية (CIBio) التابعة لكلية العلوم الزراعية والبيطرية في جابوتيكال ، بموجب البروتوكولين 001/2014 و 006/2014 ، ومن قبل اللجنة الفنية الوطنية للسلامة البيولوجية (CTNBio) ، بموجب البروتوكولات 36343/2017 / SEI-MCTIC ، 01200.706019 / 2016-45 ، و 5488/2017.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
طابعة ثلاثية الأبعاد RapRepطابعة ثلاثية الأبعاد شهيرة تعتمد على وضع Prusa I3 DIY ، والتعليمات المتوفرة في https://www.instructables.com/Building-a-Prusa-I3-3D-Printer-Revisited/
3xtubAOX fly lineHowy Jacobs & acute ؛ s مختبر ، جامعةتامبيري ذبابة الفاكهة خط يعبر عن جين AOX من C. intestinalis تحت سيطرة المروج التأسيسي &alpha ;-tubulin. توجد 5 و 6 نسخ من هذا البناء في الذكور والإناث في homo / hemizigosity ، على التوالي ، واحدة في كل من الكروموسومات X و 2 و 3.< / em>
لوحة60 × 60 × 3 مم
ADPSigma-AldrichA2754الأدينوزين 5 & prime ;-ثنائي فوسفات الصوديوم sal (رقم CAS 20398-34-9) ؛ & جي ؛ 95%; الوزن الجزيئي = 427.20 جم / مول ؛ الذوبان في الماء عند 50 مجم / مل
Antimycin-ASigma-AldrichA8674Antimycin A من Streptomyces sp. (رقم CAS 1397-94-0) ؛ الوزن الجزيئي ~ 548.63 جم / مول ؛ الذوبان في 95٪ إيثانول عند 50 مجم / مل
AgarKasvK25-611001للاستخدام البكتريولوجي ؛ مسحوق ؛ عامل تصلب (12-20 جم / لتر)
ألبومين مصل البقر (BSA)سيجما ألدريتشA7030جزء الصدمة الحرارية ، خالي من البروتياز ، خالي من الأحماض الدهنية ، خالي من الجلوبيولين بشكل أساسي (رقم CAS 9048-46-8) ؛ الرقم الهيدروجيني 7 ؛ & جي ؛ 98%; الذوبان في الماء 40 جم / مل
منزوع الأيونات
EGTAسيجما ألدريتشE4378الإيثيلين جلايكول مكرر (2-أمينوإيثيل إيثر) -N ، N ، N '، N'-حمض رباعي الأسيتيك (رقم CAS 67-42-5) ؛ & ge ؛ 97%; الوزن الجزيئي = 380.35 جم / مول
الإيثانول 99.5٪
رغوةيمكن استبدالها بقطع سميكة من القطن
ورق0.2 سم 2 شبكة
HepesSigma-AldrichH40344- (2-Hydroxyethyl) بيبيرازين -1-حمض الإيثان سلفونيك (رقم CAS 7365-45-9) ، معتمد من BioPerformance ؛ & ge ؛ 99,5٪ (المعايرة), خلية مزرعة اختبار; الوزن الجزيئي = 238.30 جم / مول
الخالطSartoriusالخالط اليدوي للزجاج (S) ، 1 مل ؛ يتكون من أسطوانة مصنوعة من زجاج البورسليكات بالإضافة إلى المكبس S ؛ غالبا ما تستخدم لإعداد العينة البسيطة ، على سبيل المثال تكسير عينات الأنسجة.
KClAmresco0395-2كلوريد البوتاسيوم (رقم CAS 7447-40-7); ≥ 99,0%; الوزن الجزيئي = 74.55 جم / مول
KH2PO4سيجما ألدريتشP5379فوفات البوتاسيوم أحادي القاعدة (رقم CAS 7778-77-0) ؛ كاشف بلس. الوزن الجزيئي = 136.09 جم / مول
محامل خطية (LM8UU)8 مم ، أي علامة تجارية
MalateSigma-AldrichM1000L- (-) - حمض الماليك (رقم CAS 97-67-6) ؛ & ge ؛ 95-100%; الوزن الجزيئي = 134.09 جم / مول) ، الذوبان في الماء: 100 مجم / مل. يتم تعديل الرقم الهيدروجيني للمحلول إلى 7.0 تقريبا.
MgCl2Amresco0288-1KGكلوريد المغنيسيوم ، سداسي الهيدرات (رقم CAS 7791-18-6) ؛ 99٪ -102٪ ؛ الوزن الجزيئي = 203.3 جم / مول
الطرد المركزي الدقيقة1.5 مل ؛ تخرج كل 100 ميكرو ؛ L ، قابل للتعقيم
Na2HPO4Amresco0348-1KGفوسفات الصوديوم ، ثنائي القاعدة ، سباعي الهيدرات (رقم CAS 7782-85-6) ؛ 98-102٪ ؛ الوزن الجزيئي = 268.07 جم / مول
كلوريد الصوديومهانيويل31434-1 كجمكلوريد الصوديوم (رقم CAS 7647-14-5) ؛ & ge ؛ 99,5%; الوزن الجزيئي 58,44 جم / مول. للاستخدام المختبري فقط.
Oxigraph-O2kOroboros10000-02Series D-G ؛ O2k-Core: يتضمن O2k-Main Unit مع غلاف من الفولاذ المقاوم للصدأ ، ومجموعة O2k-Assembly ، واثنين من OroboPOS (مستشعرات الأكسجين الاستبياني) ومجموعة خدمة OroboPOS ، وبرنامج DatLab ، ونظام الشفط المتكامل ISS ، ومجموعة O2k-المعايرة بالتحليل الحجمي.
علامة دائمةيفضل
أطباق90 × 15 مم ؛ يشيع استخدامها للثقافة البكتريولوجية
PLA 3D الطباعة خيوطالطباعة Quantum3Dhttp://quantum3dprinting.com/خيوط حمض البوليلاتيك عالية الجودة (PLA) ، موصى به بشدة ، (1.0 كجم لفة) ، أي علامة تجارية
ProlineSigma-AldrichP0380L-Proline (رقم CAS 147-85-3) ؛ ذرور; 99%; الوزن الجزيئي = 115.13 جم / مول
بروبيل غالاتسيجما-ألدريتشP3130بروبيل غالات (رقم CAS 121-79-9) ؛ مسحوق ؛ & ge ؛ 98%; الوزن الجزيئي = 212.2 0 جم / مول ؛ الذوبان في الإيثانول عند 50 مجم / مل
بيروفاتسيجما ألدريتشP2256بيروفات الصوديوم (رقم سجل المستخلصات الكيميائية 113-24-6) ، & ge ؛ 99%; الوزن الجزيئي = 110.04 جم / مول ؛ الذوبان في الماء عند 100 مجم / مل
مهاوي8 × 300 مم ، أي علامة تجارية
RotenoneSigma-AldrichR8875Rotetone (رقم CAS 83-79-4) ؛ & ge ؛ 95٪ ، الوزن الجزيئي 394.42 جم / مول
الأربطة المطاطيةيمكن استبدالها بقطع من مفك
البراغيلتجميع بعض الأجهزة المطبوعة ثلاثية الأبعاد
ScreewsM3 × 8 مم
بطاقةبحجم 32 ميجا بايت على الأقل ؛ عادة ما يتم توفيرها مع طابعات ثلاثية الأبعاد
Software Repetier HostHot-World GmbH & Co. KGhttps://www.repetier.com/برنامج تقطيع ممتاز ، متاح مجانا
برنامج TinkercadAutodeskhttps://www.tinkercad.comبرنامج تصميم نموذج ثلاثي الأبعاد ، متاح مجانا
مجهر مجسمLeicaM-80مجهر مجسم ، تكبير 7.5-60X + Leica cls 150 مصدر ضوء LED
SucroseMerck107،651،000سكروز لاستخدام علم الأحياء الدقيقة (رقم CAS 57-50-1) ؛
تريسأميرشام للعلومالبيولوجية 17-1321-01تريس (هيدروكسي ميثيل) -أمينوميثان (رقم CAS 77-86-1) ؛ 99,8-100.1٪ ؛ الوزن الجزيئي 121.14 جم / مول
ملاقط / ملقطستاركST08710ملقط نسجي ، مستقيم ، طرف دائري ، 12 سم ، الفولاذ المقاوم للصدأ AISI-410
w1118 fly line < / em >Howy Jacobs & acute ؛ مختبر ، جامعة< م > ذبابة الفاكهة يستخدم كعنصر تحكم في الخلفية الجينية ل 3XtubAOX < / em >
لوحة240 × 60 × 20 مم
جوارب2 × 210 مم ، أي علامة تجارية
أكريليك الماء أسيتات الإيثيلين والفينيل الرسم البياني أنابيب بتري سوداء مصححة SD تامبير خشبية مضغوطة

المراجع

  1. nobelprize.org. , Available from: http://www.nobelprize.org/prizes/medicine/ (2021).
  2. Drosophila Model Filter. , Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/?term=%22drosophilia+model%22&filter=datesearch.y_5 (2021).
  3. A Look at Trends in NIHS Model Organism Research Support. , Available from: https://nexus.od.nih.gov/all/2016/07/14/a-look-at-trends-in-nihs-model-organism-research-support/ (2021).
  4. Drosophila. , Available from: https://bv.fapesp.br/pt/metapesquisa/?q=drosophila (2021).
  5. Metapesquisa. , Available from: https://bv.fapesp.br/pt/metapesquisa/ (2021).
  6. Jennings, B. H. Drosophila-a versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14 (5), 190-195 (2011).
  7. Brandt, A., Vilcinskas, A. The Fruit Fly Drosophila melanogaster as a Model for Aging Research. Yellow Biotechnology I. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 135, 63-77 (2013).
  8. Yang, D. Simple homemade tools to handle fruit flies-drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (149), e59613(2019).
  9. Cheluvappa, R., Scowen, P., Eri, R. Ethics of animal research in human disease remediation, its institutional teaching; and alternatives to animal experimentation. Pharmacology Research and Perspectives. 5 (4), (2017).
  10. Plan Alto.gov. , Available from: http://www.planalto.gov.br/ccivil_03/_ato2007-2010/2008/lei/|11794.htm (2021).
  11. Plan Alto.gov. , Available from: https://www.planalto.gov.br/ccivil_03/_ato2004-2006/2005/decreto/d5591.htm (2021).
  12. Revistapesquisa.fapesp.br. , Available from: https://revistapesquisa.fapesp.br/en/supply-side-research-constraints/ (2021).
  13. ABC.org.br. , Available from: http://www.abc.org.br/2014/05/08/em-depoimento-a-cell-dario-zamboni-fala-dos-desafios-de-produzir-boa-ciencia-no-brasil/ (2021).
  14. Nascimento, S., Pólvora, A. Maker Cultures and the Prospects for Technological Action. Science and Engineering Ethics. 24 (3), 927-946 (2018).
  15. Maia Chagas, A., Prieto-Godino, L. L., Arrenberg, A. B., Baden, T. The €100 lab: A 3D-printable open-source platform for fluorescence microscopy, optogenetics, and accurate temperature control during behaviour of zebrafish, Drosophila, and Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 15 (7), (2017).
  16. Baden, T., Chagas, A. M., Gage, G., Marzullo, T., Prieto-Godino, L. L., Euler, T. Open Labware: 3-D Printing Your Own Lab Equipment. PLOS Biology. 13 (3), 1002086(2015).
  17. Zhou, B., Tian, R. Mitochondrial dysfunction in pathophysiology of heart failure. Journal of Clinical Investigation. 128 (9), 3716-3726 (2018).
  18. Hock, D. H., Robinson, D. R. L., Stroud, D. A. Blackout in the powerhouse: Clinical phenotypes associated with defects in the assembly of OXPHOS complexes and the mitoribosome. Biochemical Journal. 477 (21), 4085-4132 (2020).
  19. Juszczuk, I. M., Rychter, A. M. Alternative oxidase in higher plants. Acta Biochimica Polonica. 50 (4), 1257-1271 (2003).
  20. McDonald, A. E. Alternative oxidase: An inter-kingdom perspective on the function and regulation of this broadly distributed "cyanide-resistant" terminal oxidase. Functional Plant Biology. 35 (7), 535-552 (2008).
  21. McDonald, A. E., Vanlerberghe, G. C., Staples, J. F. Alternative oxidase in animals: Unique characteristics and taxonomic distribution. Journal of Experimental Biology. 212, 2627-2634 (2009).
  22. McDonald, A., Vanlerberghe, G. Branched Mitochondrial Electron Transport in the Animalia: Presence of Alternative Oxidase in Several Animal Phyla. IUBMB Life (International Union of Biochemistry and Molecular Biology: Life. 56 (6), 333-341 (2004).
  23. McDonald, A. E., Costa, J. H., Nobre, T., De Melo, D. F., Arnholdt-Schmitt, B. Evolution of AOX genes across kingdoms and the challenge of classification. Alternative Respiratory Pathways in Higher Plants. , 267-272 (2015).
  24. Fernandez-Ayala, D. J. M., et al. Expression of the Ciona intestinalis Alternative Oxidase (AOX) in Drosophila Complements Defects in Mitochondrial Oxidative Phosphorylation. Cell Metabolism. 9 (5), 449-460 (2009).
  25. Kemppainen, K. K., et al. Expression of alternative oxidase in Drosophila ameliorates diverse phenotypes due to cytochrome oxidase deficiency. Human Molecular Genetics. 23 (8), 2078-2093 (2014).
  26. Andjeiković, A., Kemppainen, K. K., Jacobs, H. T. Ligand-bound geneswitch causes developmental aberrations in drosophila that are alleviated by the alternative oxidase. G3: Genes, Genomes, Genetics. 6 (9), 2839-2846 (2016).
  27. Hakkaart, G. A. J., Dassa, E. P. E. P., Jacobs, H. T., Rustin, P. Allotopic expression of a mitochondrial alternative oxidase confers cyanide resistance to human cell respiration. EMBO Reports. 7 (3), 341-345 (2006).
  28. Dassa, E. P., et al. Expression of the alternative oxidase complements cytochrome c oxidase deficiency in human cells. EMBO Molecular Medicine. 1 (1), 30-36 (2009).
  29. Szibor, M., et al. Broad AOX expression in a genetically tractable mouse model does not disturb normal physiology. DMM Disease Models and Mechanisms. 10 (2), 163-171 (2017).
  30. El-Khoury, R., Kaulio, E., Lassila, K. A., Crowther, D. C., Jacobs, H. T., Rustin, P. Expression of the alternative oxidase mitigates beta-amyloid production and toxicity in model systems. Free Radical Biology and Medicine. 96, 57-66 (2016).
  31. Mills, E. L., et al. Succinate Dehydrogenase Supports Metabolic Repurposing of Mitochondria to Drive Inflammatory Macrophages. Cell. 167 (2), 457-470 (2016).
  32. Giordano, L., et al. Alternative Oxidase Attenuates Cigarette Smoke-induced Lung Dysfunction and Tissue Damage. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 60 (5), 515-522 (2019).
  33. Camargo, A. F., et al. Xenotopic expression of alternative electron transport enzymes in animal mitochondria and their impact in health and disease. Cell biology International. 42 (6), 664-669 (2018).
  34. Saari, S., et al. Alternative respiratory chain enzymes: Therapeutic potential and possible pitfalls. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1865 (4), 854-866 (2019).
  35. Instructables.com. , Available from: https://www.instructables.com/Building-a-Prusa-I3-3D-Printer-Revisted/ (2021).
  36. Tindercad.com. , Available from: https://www.tinkercad.com/ (2021).
  37. Repetier.com. , Available from: https://www.repetier.com/ (2021).
  38. Tinkercad.com. , Available from: https://www.tinkercad.com/login (2021).
  39. Knowledge.autodesk.com. , Available from: https://knowledge.autodesk.com/support/revit-products/learn_explore/caas/CloudHelp/cloudhelp/2016/ENU/Revit-Model/files/GUID-B89AD692-C705-458F-A638-EE7DD83D694C-htm.html (2021).
  40. Koemans, T. S., et al. Drosophila courtship conditioning as a measure of learning and memory. Journal of Visualized Experiments. (124), e55808(2017).
  41. Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).
  42. Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of visualized experiments JoVE. (61), e3795(2012).
  43. Oroboros. , Available from: https://www.oroboros.at/">"https://www.oroboros.at/">https://www.oroboros.at/ (2021).
  44. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  45. Tinkercad. , Available from: https://tinkercad.zendesk.com/hc/en-us/categories/200357447-FAQ">"https://tinkercad.zendesk.com/hc/en-us/categories/200357447-FAQ">https://tinkercad.zendesk.com/hc/en-us/categories/200357447-FAQ (2021).
  46. Morton, J. D., Barnes, M. F., Zyskowski, R. F. Respiratory control ratio: A computer simulation of oxidative phosphorylation. Biochemical Education. 24 (2), 110-111 (1996).
  47. Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. I. Kinetics of oxygen utilization. The Journal of Biological Chemistry. 217 (1), 383-393 (1955).
  48. Geissmann, Q., Garcia Rodriguez, L., Beckwith, E. J., French, A. S., Jamasb, A. R., Gilestro, G. F. Ethoscopes: An open platform for high-throughput ethomics. PLOS Biology. 15 (10), 2003026(2017).
  49. Github.com. , Available from: https://github.com/amchagas/Flypi">"https://github.com/amchagas/Flypi">https://github.com/amchagas/Flypi (2021).
  50. Gilestrolab.github.io. , Available from: https://gilestrolab.github.io/ethoscope/">"https://gilestrolab.github.io/ethoscope/">https://gilestrolab.github.io/ethoscope/ (2021).
  51. Imagej.nih.gov. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/">"https://imagej.nih.gov/ij/">https://imagej.nih.gov/ij/ (2021).
  52. Open-Neuroscience.com. , Available from: https://open-neuroscience.com/">"https://open-neuroscience.com/">https://open-neuroscience.com/ (2021).
  53. Appropedia.org. , Available from: https://www.appropedia.org/3D_printable_science_equipment">"https://www.appropedia.org/3D_printable_science_equipment">https://www.appropedia.org/3D_printable_science_equipment (2021).
  54. McParland, A. L., Follansbee, T. L., Ganter, G. K. Measurement of larval activity in the Drosophila activity monitor. Journal of Visualized Experiments. , (2015).
  55. Schou, M. F., Kristensen, T. N., Pedersen, A., Karlsson, B., Loeschcke, V., Malmendal, A. Metabolic and functional characterization of effects of developmental temperature in Drosophila melanogaster. American Journal of Physiology - Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 312 (2), 211-222 (2017).
  56. Meeuse, B. J. D. Thermogenic Respiration in Aroids. Annual Review of Plant Physiology. , (1975).
  57. Watling, J. R., Robinson, S. A., Seymour, R. S. Contribution of the alternative pathway to respiration during thermogenesis in flowers of the sacred lotus. Plant Physiology. , (2006).
  58. Inaba, Y. I., et al. Alternative oxidase capacity of mitochondria in microsporophylls may function in cycad thermogenesis. Plant Physiology. 180 (2), 743-756 (2019).
  59. Sanz, A., Stefanatos, R., McIlroy, G. Production of reactive oxygen species by the mitochondrial electron transport chain in Drosophila melanogaster. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 42 (2), 135-142 (2010).
  60. Miwa, S., St-Pierre, J., Partridge, L., Brand, M. D. Superoxide and hydrogen peroxide production by Drosophila mitochondria. Free Radical Biology and Medicine. 35 (8), 938-948 (2003).
  61. Gnaiger, E. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control An Introduction to OXPHOS Analysis. Bioenergetics Communications. 2, Bionergetics Communications. Innsbruck, Austria. (2020).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة