يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تحديد سمية الأشعة فوق البنفسجية والمواد الكيميائية على الخلايا الظهارية القرنية البشرية الأولية والخالدة

2.3K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/62675

⸱

يوليو 22, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Ocular Research & Education (CORE), School of Optometry & Vision Science, University of Waterloo, 2Centre for Eye and Vision Research (CEVR)

في هذه المقالة

ملخص

توضح هذه المقالة الإجراءات المستخدمة لتقييم سمية الأشعة فوق البنفسجية والسموم الكيميائية على خط الخلية الأولية والخالدة.

الملخص

توضح هذه المقالة طرق قياس سمية الأشعة فوق البنفسجية (UV) والسموم العينية على مزارع الخلايا الظهارية القرنية البشرية الأولية (pHCEC) والخالدة (iHCEC). تعرضت الخلايا للأشعة فوق البنفسجية والجرعات السامة من كلوريد البنزالكونيوم (BAK) وبيروكسيد الهيدروجين (H 2O2) وكبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS). تم قياس النشاط الأيضي باستخدام مقايسة التمثيل الغذائي. تم قياس إطلاق السيتوكينات الالتهابية باستخدام إنترلوكين متعدد الإرسال (IL) -1β و IL-6 و IL-8 ومقايسة عامل نخر الورم ألفا (TNF-α) ، وتم تقييم الخلايا للتأكد من صلاحيتها باستخدام الأصباغ الفلورية.

حدثت الآثار الضارة للأشعة فوق البنفسجية على النشاط الأيضي للخلايا وإطلاق السيتوكين في 5 دقائق من التعرض للأشعة فوق البنفسجية ل iHCEC و 20 دقيقة ل pHCEC. حدثت انخفاضات مماثلة في النسبة المئوية في النشاط الأيضي ل iHCEC و pHCEC بعد التعرض ل BAK أو H2O2 أو SDS ، وحدثت أهم التغييرات في إطلاق السيتوكين ل IL-6 و IL-8. أظهر الفحص المجهري للخلايا المعرضة ل iHCEC و pHCEC BAK الملطخة بالفلورسنت موت الخلايا عند التعرض بنسبة 0.005٪ ل BAK ، على الرغم من أن درجة تلطيخ الإيثيديوم كانت أكبر في iHCECs من pHCECs. باستخدام طرق متعددة لتقييم التأثيرات السامة باستخدام الفحص المجهري ، وتقييم النشاط الأيضي ، وإنتاج السيتوكين ، يمكن تحديد سمية الأشعة فوق البنفسجية والسموم الكيميائية لكل من خطوط الخلايا الأولية والخالدة.

المقدمة

يتم إجراء دراسات علم السموم في المختبر للتنبؤ بالآثار السامة للمواد الكيميائية والعوامل الأخرى التي يمكن أن تسبب تلفا للخلايا. في تقييم السمية للقرنية ، تم استخدام الخلايا الظهارية القرنية البشرية (HCECs) في نماذج لتقييم هذه التأثيرات1،2،3،4. تقوم هذه النماذج عادة بتقييم التأثيرات الفسيولوجية مثل التغيرات في النشاط الأيضي للخلية ، وتكاثر الخلايا ، ووظائف الخلية الأخرى مثل إنتاج وإطلاق السيتوكينات الالتهابية. بالنسبة لدراسات السموم هذه ، تم اختيار خلايا من مصادر مختلفة لتقييم الآثار الضارة للمواد الكيميائية والأشعة فوق البنفسجية على HCECs 2,3. تتوفر خطوط pHCEC من الشركات التي توفر هذه الخلايا من الأنسجة المانحة للبالغين. يمكن علاج الخلايا الأولية ب dispase وكشط القرنية بلطف للثقافة5. ثم يتم اختبار الخلايا بحثا عن الفيروسات والتلوث ثم يتم شحنها بالتبريد في 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد.

ميزة خطوط الخلايا الأولية هي أن الخلايا متطابقة وراثيا مع خلايا المتبرع. هذا مثالي ، حيث يجب أن يحاكي النموذج في المختبر الأنسجة في الجسم الحي قدر الإمكان. عيب خطوط الخلايا الأولية هو أن لديها عددا محدودا من انقسامات الخلايا أو الممرات6. يحد العدد المحدود من الخلايا المتاحة من عدد التجارب التي يمكن إجراؤها باستخدام ثقافة أولية واحدة ، مما يزيد من تكلفة التجارب.

كما تم استخدام خطوط الخلايا الخالدة في نماذج سمية زراعة الخلايا. ومع ذلك ، على عكس خط الخلية الأساسي الذي تم الحصول عليه من الأنسجة الحية ، فقد تم تغيير خط الخلية الخالد وراثيا. يتم إنشاء الخلايا الخالدة عن طريق دمج جينات الفيروس في الحمض النووي للخلايا الأولية6،7،8. يتم اختيار الخلايا ذات الدمج الجيني الفيروسي الناجح لخط الخلية الخالد. ميزة الخلود هي أنه يسمح بالانتشار السريع إلى أجل غير مسمى ، مما يوفر عددا غير محدود من الخلايا لإجراء تجارب متعددة باستخدام نفس خط الخلية. هذا يسمح بالاتساق بين التجارب ويقلل التكلفة.

بالإضافة إلى التغيرات في الجينات التي تحد من تكاثر الخلايا ، يمكن أن تحدث أيضا تغييرات في التعبير عن الجينات ذات الوظائف الحرجة9. لذلك ، فإن عيب استخدام الخلايا الخالدة هو أنها قد لا تمثل الخلايا الأصلية في الجسم الحي من حيث استجابتها للمحفزات الخارجية المختلفة10. تضمنت المقارنات مراقبة الآثار السامة للمواد الكيميائية على الخلايا القرنية البشرية الأولية والخالدة11 ، وكذلك HCECs الخالدة والخلايا الأولية الظهارية لقرنيةالأرانب 12. أظهرت المقارنة بين تأثيرات السموم على خلايا القرنية البشرية الأولية والخلايا القرنية الخالدة عدم وجود فروق ذات دلالة إحصائية11. باستخدام الطرق المفصلة في هذه المقالة ، سيتم تحديد فعالية هذه المقايسات لتقييم سمية الأشعة فوق البنفسجية والسموم العينية على pHCECs و iHCECs.

تم اختيار ثلاثة سموم عينية شائعة الاستخدام في المقايسات المختبرية: BAK و H2O2 و SDS. BAK هو مادة حافظة كاتيونية شائعة الاستخدام في محاليل العيون 13،14 ، H 2 O2يستخدم عادة لتطهير العدسات اللاصقة 15 ، و SDS هو خافض للتوتر السطحي أنيوني موجود في المنظفات والشامبو 14. على غرار السموم العينية ، يمكن أن تسبب الأشعة فوق البنفسجية أيضا أضرارا كبيرة ل HCECs3. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يسبب التعرض المفرط للأشعة فوق البنفسجية حالة عينية تعرف باسم التهاب القرنية الضوئي تتميز بأعراض التمزق والحساسية للضوء والشعور بالحصى16.

هناك عدد غير محدود من مزارع الخلايا الأولية التي يمكن استخدامها والعديد من خطوط الخلايا الخالدة التي تم تطويرها. لذلك ، تم إجراء تحقيق لمقارنة HCECs الأولية بخط HCEC الخالد لتحديد أوجه التشابه والاختلاف بين النماذج التي تتضمن هذه الأنواع من الخلايا.

استخدم هذا التحقيق الفحص المجهري لتقييم الاختلافات المحتملة بين pHCECs و iHCECs على الاستجابة الفسيولوجية للخلايا للأشعة فوق البنفسجية والسموم. كما تم تقييم آثار الأشعة فوق البنفسجية والمواد الكيميائية على النشاط الأيضي للخلايا وإطلاق السيتوكين الالتهابي لخطي الخلية. تكمن أهمية تحديد الاختلافات بين خطي الخلية في فهم الاستخدام الأمثل لخطوط الخلايا هذه لتقييم: 1) تأثير الأشعة فوق البنفسجية على الخلايا ، 2) آثار السموم على الخلايا ، و 3) التغييرات الناتجة في التمثيل الغذائي ، وصلاحية الخلية ، وإطلاق السيتوكين الخلوي للدراسات المستقبلية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. ثقافة pHCECs و iHCECs

  1. قم بتنمية pHCECs و iHCECs في الوسط الظهاري العيني البشري (HOEM) مع المكملات التالية: 6 mM L-glutamine ، 0.002٪ مكمل وسائط الخلية O (جدول المواد) ، 1.0 ميكرومتر ادرينالين ، 0.4٪ مكمل وسائط الخلية P (جدول المواد) ، 5 ميكروغرام / مل من الأنسولين rh ، 5 ميكروغرام / مل apo-transferrin ، و 100 نانوغرام / مل هيدروكورتيزون هيميسوكسينات في قوارير الثقافة المغلفة بالكولاجين -1 (18 مل في دورق ثقافة 75 سم2).
  2. قم بتغيير الوسط في القوارير كل 2-3 أيام عن طريق إزالة الوسط بعد نمو الخلايا إلى ~ 80٪ التقاء. أضف محلول التفكك بدون الفينول الأحمر واحتضن القارورة عند 37 درجة مئوية حتى تنفصل الخلايا تماما. تحييد محلول التفكك باستخدام DMEM / F12 مع المصل ثم طرد الخلايا عند 500 × جم. قم بإزالة الوسط الطافي وأعد تعليق الخلايا في وسط HOEM.

2. تحديد حجم الخلية باستخدام المجهر متحد البؤر

  1. قم بزرع كل من pHCECs و iHCECs على أطباق بتري المغلفة بالكولاجين مع أغطية زجاجية القاع بتركيز 1 × 105 مع 1 مل من HOEM. قم بزراعة pHCECs و iHCECs ، مجموعة واحدة من الثقافات لمدة 24 ساعة ومجموعة أخرى من الثقافات لمدة 48 ساعة ، في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
  2. بعد فترة الحضانة ، قم بتلطيخ الخلايا ب 500 ميكرولتر من محلول عازل تلطيخ الملحق يحتوي على الكالسيين (4 ميكرومتر) ، إيثيديوم هوموديمر-1 (8 ميكرومتر) ، والملحق الخامس (5 ميكرولتر في 500 ميكرولتر عازلة - أليكسا فلور 647 مترافق) لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد تلطيخ الخلايا ، اضبط المجهر لالتقاط الأطوال الموجية للإثارة / الانبعاث البالغة 488/515 نانومتر للكالسيين-AM ، و 543/600 نانومتر للإيثيديوم هوموديمر-1 ، و 633/665 نانومتر للملحق الخامس باستخدام مجهر المسح بالليزر متحد البؤر.
  3. احصل على الصور والتقط مكدسات Z لتقييم حجم الخلية في ثلاثة أبعاد.
    1. للحصول على الصور ثنائية الأبعاد (2D) وثلاثية الأبعاد (3D) ، ابحث عن المنطقة المراد تصويرها باستخدام هدف مائي apochromat 40x / 1.2. باستخدام ليزر Argon (488) (المسح الأول) و HeNe1 (543) (المسح الثاني و HeNe2 (633) (المسح الثالث) ، قم بالمسح في ثلاث قنوات منفصلة باستخدام مقسمات الحزمة ، HFT 488/543/633 ، NFT 635 Vis ، و NFT 545 LP560 ، LP505.
    2. استخدم المسح المتسلسل متعدد المسارات لتقليل الحديث المتبادل.
      ملاحظة: يستخدم LP505 للقناة 2 مع ليزر 488 لالتقاط انبعاث صبغة الكالسيين. يستخدم LP560 في القناة 3 مع ليزر 543 لالتقاط انبعاث إيثيديوم هوموديمر 1. يستخدم NFT 635 مع ليزر 633 لالتقاط انبعاث الملحق V. الغرض من HFT هو فصل ضوء الإثارة والانبعاث. يقسم NFT الضوء عن طريق عكس الضوء < الطول الموجي المحدد إلى قناة منفصلة مع السماح للضوء > طول موجي محدد بالمرور إلى قناة ثانية. تمنع مرشحات LP الأطوال الموجية الأقصر من الطول الموجي المحدد وتسمح للأطوال الموجية الأطول بالمرور.
    3. للتصوير في 3D ، اضبط البؤر على Z-stack وامسح 20 إطارا على الأقل.

3. تعرض الخلايا للأشعة فوق البنفسجية

  1. قم بزرع الخلايا عند 5 × 104 / مل من HOEM في كل بئر من صفيحة استزراع مغلفة بالكولاجين -1 مكونة من 24 بئرا واحتضانها عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 3 ساعات. بعد فترة الحضانة ، قلل حجم الوسط في الآبار إلى 300 ميكرولتر. بعد ذلك ، قم بتعريض الخلايا للأشعة فوق البنفسجية (كل من UVA عند 6.48 W / m 2 و UVB عند 1.82 W / m2 حيث يتم تشغيل كل من أنابيب UVA و UVB في الحاضنة في نفس الوقت) في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 5 و 20 دقيقة في تجارب منفصلة.
  2. بعد الأشعة فوق البنفسجية ، أضف 200 ميكرولتر من HOEM الطازج إلى كل بئر واحتضانها لمدة 20 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
  3. بعد الحضانة ، اجمع طاف الخلية في كل بئر وانقله إلى أنابيب معقمة من مادة البولي بروبيلين سعة 2 مل. تجمد عند -80 درجة مئوية. لتحديد مستويات السيتوكين الصادرة عن pHCECs و iHCECs بعد التعرض للأشعة فوق البنفسجية ، استخدم مقايسة السيتوكين المتعدد واتبع تعليمات المجموعة لتحديد كمية السيتوكينات الأربعة التالية: IL-6 و IL-8 و IL-1β و TNF-α.
  4. أضف كاشف الفحص الأيضي إلى الخلايا الموجودة في الآبار.
  5. تحضير كاشف فحص التمثيل الغذائي بنسبة 10٪ في DMEM / F12. استبدل وسط الاستزراع في كل بئر ب 1 مل من محلول الفحص الأيضي بنسبة 10٪ واحتضانه عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 4 ساعات.
  6. قم بقياس مضان كل محلول باستخدام قارئ لوحة الفلورسنت عند أطوال موجية للإثارة / الانبعاث 530/590 نانومتر.

4. تعرض الخلايا للسموم الكيميائية

  1. خلايا البذور عند 5 × 104 / مل من HOEM في كل بئر من صفيحة استزراع مغلفة بالكولاجين -1 24 بئرا وحضنها عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 3 ساعات. بعد فترة الحضانة ، قم بإزالة الوسط وتعريض الخلايا ل 1 مل من السموم الكيميائية (BAK 0.001٪ ، H 2 O20.01٪ ، و SDS 0.0025٪ في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)) لمدة 5 و 15 دقيقة.
  2. بعد التعرض للسموم الكيميائية ، قم بإزالة السموم من الآبار ، واشطفها ب 1 مل من PBS ، وأضف 1 مل من HOEM إلى كل بئر. بعد 20 ساعة من الحضانة ، قم بإجراء مقايسة التمثيل الغذائي عن طريق استبدال الوسط ب 1 مل من محلول مقايسة التمثيل الغذائي بنسبة 10٪ والحضانة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 4 ساعات. قم بقياس التألق باستخدام قارئ لوحة مضان متعدد الآبار عند أطوال موجية للإثارة / الانبعاث 530/590 نانومتر.
  3. نقل طافات الخلايا من الآبار بعد حضانة 20 ساعة إلى أنابيب بولي بروبيلين معقمة منفصلة سعة 2 مل وتجميدها عند -80 درجة مئوية. تحديد كمية السيتوكينات المنبعثة من pHCECs و iHCECs بعد التعرض للمواد الكيميائية. استخدم نفس منصة تعدد الإرسال المستخدمة لتقييم السيتوكينات من الخلايا المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية. استخدم مقايسة السيتوكين المتعدد باتباع تعليمات المجموعة لتحديد كمية السيتوكينات الأربعة التالية: IL-6 و IL-8 و IL-1β و TNF-α.

5. فحص الخلايا المعرضة لتركيزات مختلفة من BAK

  1. خلايا البذور عند 1 × 10 5 / مل من HOEM في كل بئر من صفيحة استزراع مغلفة بالكولاجين -1 مكونة من 24 بئرا وتحتضن عند 37 درجة مئوية مع5٪ CO2 لمدة 24 ساعة. بعد فترة الحضانة ، قم بإزالة الوسط وتعريض الخلايا ل 1 مل من السموم الكيميائية (BAK 0.001٪ ، BAK 0.005٪ ، و BAK 0.01٪ في PBS) لمدة 5 دقائق.
  2. بعد التعرض ، قم بإزالة السموم الكيميائية ، وشطف الآبار ب 1 مل من PBS ، وإضافة 1 مل من HOEM إلى كل بئر. بعد 20 ساعة من الحضانة ، قم بتلطيخ الخلايا ب 500 ميكرولتر من محلول عازل تلطيخ الملحق يحتوي على الكالسيين (4 ميكرومتر) ، إيثيديوم هوموديمر-1 (8 ميكرومتر) ، والملحق الخامس (5 ميكرولتر في 500 ميكرولتر عازلة - أليكسا فلور 647 مترافق) لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية. اضبط المجهر لقياس شدة تلطيخ الملحق V والكالسيين AM والإيثيديوم -1 عند الأطوال الموجية للإثارة / الانبعاث 630/675 نانومتر و 495/515 نانومتر و 528/617 نانومتر على التوالي. صورة الخلايا باستخدام المجهر الفلوري

6. تحليل البيانات

  1. قم بإجراء اختبار الحالة الطبيعية واختبار الفروق المتساوية قبل إجراء تحليل التباين (ANOVA) أو اختبار Welch ANOVA أو Kruskal-Wallis. استخدم الاختبار اللاحق المناسب لمقارنة كل مجموعة تم اختبارها. اضبط p < 0.05.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

حجم الخلية
تم تصور HCECs الأولية والخالدة بثلاثة أصباغ فلورية ، والتي تعكس ثلاث مراحل مختلفة من صلاحية الخلية. الخلايا الحية خضراء (calcein-AM) ، والخلايا الميتة حمراء (ethidium homodimer-1) ، والخلايا المبرمج صفراء (لون ملحق V- مضبوط بالكمبيوتر لتصور أفضل للإشارة الفلورية). تحتوي الخلايا الحية على استرات في سيتوبلازم الخلية وتحول الكالسين-AM إلى الكالسيين. تحتوي الخلايا الميتة على أغشية خلوية منفذة للإيثيديوم هوموديمر-1. الخلايا المبرمج لها تلطيخ في غشاء الخلية حيث يتم نقل فوسفاتيديل سيرين إلى الغشاء...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تم تقييم الاختلافات المحتملة في استخدام نوعين من HCECs. تم وضع الخلايا في نفس الوسط (HOEM) بتركيزات متطابقة من الخلايا ثم تعرضت لفترات قصيرة وطويلة من الأشعة فوق البنفسجية وثلاثة سموم عينية. تم اختيار جرعات من الأشعة فوق البنفسجية والمواد الكيميائية بناء على آثارها الفسيولوجية ، والتي كانت ضارة بما يكفي للخلايا لإنتاج استجابات وسيطة يمكن مقارنتها. كانت أوقات التعرض من 5 و 20 دقيقة للأشعة فوق البنفسجية و 5 و 15 دقيقة للجرعات المختارة من BAK (0.001٪) و SDS (0.0025٪) و H 2 O2(0.01٪) أوقات تعرض وتركيزات مثالية أظه...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

تلقى المؤلف ، ليندون دبليو جونز ، على مدى السنوات ال 3 الماضية ، من خلال CORE ، دعما بحثيا أو محاضرا فخريا من الشركات التالية: Alcon و Allergan و Allied Innovations و Aurinia Pharma و BHVI و CooperVision و GL Chemtec و i-Med Pharma و J &J Vision و Lubris و Menicon و Nature's Way و Novartis و Ophtecs و Ote Pharma و PS Therapy و Santen و Shire و SightGlass SightSage و Visioneering. ليندون جونز هو أيضا مستشار و / أو يعمل في مجلس استشاري لشركة Alcon و CooperVision و J&J Vision و Novartis و Ophtecs. المؤلفون الآخرون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

لم يتلق المؤلفون أي تمويل لهذا العمل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
75 سم < سوب > 2 < / سوب> قارورة تنفيسكورنينج354485هذه هي العلامة التجارية BioCoat ، 96 لوحة بئر مطلية بالكولاجين
كوستار 3370
ألاماربلوفيشر العلميدال 1025
ملحق محلول عازلة تلطيخInvitrogen ، برلنغتون ، أونتاريو ، كندا
Annexin VInvitrogen ، برلنغتون ، أونتاريو ، مجهر كندا
أكسيفرت 100 مع مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر Zeiss 510 نظامCarl Zeiss Inc. ، ألمانيا
Corning 48 Well PlatesCorning354505هذه هي العلامة التجارية BioCoat ، المغلفة بالكولاجين
Cytation 5BioTekCYT5MPVيمكن قراءة التألق من 280 إلى 700 نانومتر (للفحص 540/590)
مصل الأبقار الجنينيHyconeSH30396.03
غطاء سفلي زجاجيشركة MatTek Corporation ، آشلاند ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية
الخلايا الظهارية القرنية البشريةجامعة أوتاواN / ASV40 الخلايا الظهارية للقرنية البشرية من الدكتور إم جريفيث (معهد أوتاوا لأبحاث العيون ، أوتاوا ، كندا) وقد تم تمييزها Griffith M و Osborne R و Munger R و Xiong X و Doillon CJ و Laycock NL و Hakim M و Song Y و Watsky MA. معادلات القرنية البشرية الوظيفية المبنية من خطوط الخلايا. علم. 1999 ؛ 286: 2169-72.
ظهارة العين البشرية (HOEM) مع المكملات التالية:Millipore ، Billerica ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكيةSCMC001وسائط قاعدة Epigro مكملة ب 6 ملي مولار L-Glutamine ، 0.002٪ EpiFactor O (مكمل وسائط الخلية O في المقالة) ، 1.0 & mu ؛ م أدرينالين ، 0.4٪ EpiFactor P (ملحق وسائط الخلية P في المقالة) ، 5 & مو ؛ جم / مل أنسولين rh ، 5 مو ؛ جم / مل Apo- Transferrin ، و 100 نانوغرام / مل هيدروكورتيزون هيميسوكسينات في قوارير الاستزراع المطلية بالكولاجين -1 (BioCoat ، Corning ، Tewksbury ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية).
الكالسيان الحي الميت والإيثيديوم متجانسInvitrogen ، برلنغتون ، أونتاريو ، كندا
MesoScale Discovery (MSD) أداة QuickPlex SQ 120Rockville ، MD ، الولايات المتحدة الأمريكية
MSD لوحة الالتهابات البشرية II (4-Plex) اختبار V-Plexروكفيل ، دكتوراه في الطب ، الولايات المتحدة الأمريكية
البنسلين ستربتومايسينجيبكو15140-122تركيز 100x ، لذا أضف 1 مل لكل 99 مل من الوسائط
الخلايا الظهارية القرنية الأوليةMillipore ، Billerica ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكيةSCCE016
SpectraMax قارئ الألواح الفلورية متعدد الآبارالأجهزة الجزيئية ، Sunnyvale ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية
TrypLE Express (حل فصل الخلايا)12605036فيشر العلمي
وسائط

المراجع

  1. McCanna, D. J., Harrington, K. L., Driot, J. Y., Ward, K. W., Tchao, R. Use of a human corneal epithelial cell line for screening the safety of contact lens care solutions in vitro. Eye & Contact Lens. 34 (1), 6-12 (2008).
  2. Xu, M., Sivak, J. G., McCanna, D. J. Comparison of the effects of ophthalmic solutions on human corneal epithelial cells using fluorescent dyes. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 29 (9), 794-802 (2013).
  3. Youn, H. Y., McCanna, D. J., Sivak, J. G., Jones, L. W. In vitro ultraviolet-induced damage in human corneal, lens, and retinal pigment epithelial cells. Molecular Vision. 17, 237-246 (2011).
  4. Hakkarainen, J. J., et al. Acute cytotoxic effects of marketed ophthalmic formulations on human corneal epithelial cells. International Journal of Pharmaceutics. 511 (1), 73-78 (2016).
  5. Spurr, S. J., Gipson, I. K. Isolation of corneal epithelium with Dispase II or EDTA. Effects on the basement membrane zone. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 26 (6), 818-827 (1985).
  6. Kahn, C. R., Young, E., Lee, I. H., Rhim, J. S. Human corneal epithelial primary cultures and cell lines with extended life span: in vitro model for ocular studies. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 34 (12), 3429-3441 (1993).
  7. Araki-Sasaki, K., et al. An SV40-immortalized human corneal epithelial cell line and its characterization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (3), 614-621 (1995).
  8. Griffith, M., et al. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 286 (5447), 2169-2172 (1999).
  9. Toouli, C. D., et al. Comparison of human mammary epithelial cells immortalized by simian virus 40 T-Antigen or by the telomerase catalytic subunit. Oncogene. 21 (1), 128-139 (2002).
  10. Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
  11. Zorn-Kruppa, M., Tykhonova, S., Belge, G., Diehl, H. A., Engelke, M. Comparison of human corneal cell cultures in cytotoxicity testing. Altex. 21 (3), 129-134 (2004).
  12. Huhtala, A., et al. Comparison of an immortalized human corneal epithelial cell line and rabbit corneal epithelial cell culture in cytotoxicity testing. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 18 (2), 163-175 (2002).
  13. Pisella, P. J., Fillacier, K., Elena, P. P., Debbasch, C., Baudouin, C. Comparison of the effects of preserved and unpreserved formulations of timolol on the ocular surface of albino rabbits. Ophthalmic Research. 32 (1), 3-8 (2000).
  14. Youn, H. Y., Moran, K. L., Oriowo, O. M., Bols, N. C., Sivak, J. G. Surfactant and UV-B-induced damage of the cultured bovine lens. Toxicology in vitro. 18 (6), 841-852 (2004).
  15. Hughes, R., Kilvington, S. Comparison of hydrogen peroxide contact lens disinfection systems and solutions against Acanthamoeba polyphaga. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (7), 2038-2043 (2001).
  16. Delic, N. C., Lyons, J. G., Di Girolamo, N., Halliday, G. M. Damaging effects of ultraviolet radiation on the cornea. Photochemistry and Photobiology. 93 (4), 920-929 (2017).
  17. Ahuja, D., Saenz-Robles, M. T., Pipas, J. M. SV40 large T antigen targets multiple cellular pathways to elicit cellular transformation. Oncogene. 24 (52), 7729-7745 (2005).
  18. Tong, Y., et al. Pin1 inhibits PP2A-mediated Rb dephosphorylation in regulation of cell cycle and S-phase DNA damage. Cell Death & Disease. 6, 1640(2015).
  19. Muller, P. A., Vousden, K. H. p53 mutations in cancer. Nature Cell Biology. 15 (1), 2-8 (2013).
  20. Seshacharyulu, P., Pandey, P., Datta, K., Batra, S. K. Phosphatase: PP2A structural importance, regulation and its aberrant expression in cancer. Cancer Letters. 335 (1), 9-18 (2013).
  21. Yang, D., Okamura, H., Morimoto, H., Teramachi, J., Haneji, T. Protein phosphatase 2A Calpha regulates proliferation, migration, and metastasis of osteosarcoma cells. Laboratory nvestigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 96 (10), 1050-1062 (2016).
  22. Xie, F., et al. Disruption and inactivation of the PP2A complex promotes the proliferation and angiogenesis of hemangioma endothelial cells through activating AKT and ERK. Oncotarget. 6 (28), 25660-25676 (2015).
  23. Mallet, J. D., Rochette, P. J. Wavelength-dependent ultraviolet induction of cyclobutane pyrimidine dimers in the human cornea. Photochemical & Photobiological Sciences. 12 (8), 1310-1318 (2013).
  24. Cejkova, J., Cejka, C. The role of oxidative stress in corneal diseases and injuries. Histology and Histopathology. 30 (8), 893-900 (2015).
  25. Wang, S. Q., Balagula, Y., Osterwalder, U. Photoprotection: a review of the current and future technologies. Dermatologic Therapy. 23 (1), 31-47 (2010).
  26. Svobodova, A. R., et al. DNA damage after acute exposure of mice skin to physiological doses of UVB and UVA light. Archives of Dermatological Research. 304 (5), 407-412 (2012).
  27. Kennedy, M., et al. Ultraviolet irradiation induces the production of multiple cytokines by human corneal cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 38 (12), 2483-2491 (1997).
  28. Kode, A., Yang, S. R., Rahman, I. Differential effects of cigarette smoke on oxidative stress and proinflammatory cytokine release in primary human airway epithelial cells and in a variety of transformed alveolar epithelial cells. Respiratory Research. 7, 132(2006).
  29. Epstein, S. P., Chen, D., Asbell, P. A. Evaluation of biomarkers of inflammation in response to benzalkonium chloride on corneal and conjunctival epithelial cells. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 25 (5), 415-424 (2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تحديد سمية الأشعة فوق البنفسجية والمواد الكيميائية على الخلايا الظهارية القرنية البشرية الأولية والخالدة
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.