يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

نمو وتنقية وتكرير فيروس الهربس البسيط Oncolytic

7.2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/62677

⸱

مايو 13, 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Immunotherapeutics and Biotechnology, Jerry H. Hodge School of Pharmacy, Texas Tech University Health Sciences Center, 2Molecular Neurosurgery Laboratory and the Brain Tumor Research Center, Department of Neurosurgery, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

في هذه المخطوطة، نقوم بوصف طريقة بسيطة للنمو والتنقية والتكرير لفيروس الهربس البسيط oncolytic للاستخدام قبل السريري.

الملخص

الفيروسات الأورام (OVs)، مثل فيروس الهربس البسيط oncolytic (oHSV)، هي استراتيجية علاج سريعة النمو في مجال العلاج المناعي للسرطان. OVs، بما في ذلك oHSV، تكرار انتقائي في وقتل الخلايا السرطانية (تجنيب الخلايا السليمة / الطبيعية) في حين حفز المناعة المضادة للورم. وبسبب هذه الخصائص الفريدة، يتم استخدام استراتيجيات العلاج القائمة على oHSV بشكل متزايد لعلاج السرطان، قبل السريرية وسريريا، بما في ذلك talimogene laherparevec المعتمدة من إدارة الأغذية والعقاقير (T-Vec). النمو والتنقية والتكرير هي ثلاث تقنيات مختبرية أساسية لأي OVs ، بما في ذلك oHSVs ، قبل أن يمكن استخدامها للدراسات التجريبية. تصف هذه الورقة طريقة بسيطة خطوة بخطوة لتضخيم oHSV في خلايا Vero. كما oHSVs تتكاثر، فإنها تنتج تأثير cytopathic (CPE) في خلايا Vero. مرة واحدة 90-100٪ من الخلايا المصابة تظهر CPE، يتم حصادها بلطف، تعامل مع البنزوناز وكلوريد المغنيسيوم (MgCl2)،وتصفيتها، وتعرض للتنقية باستخدام طريقة السكروز التدرج. بعد تنقية، يتم تحديد عدد oHSV المعدية (المعينة كوحدات تشكيل البلاك أو PFUs) من خلال "فحص البلاك" في خلايا Vero. يمكن استخدام البروتوكول الموصوف هنا لإعداد مخزون oHSV عالي التأر للدراسات المختبرية في زراعة الخلايا وفي التجارب الحيوانية الحية.

المقدمة

الفيروسات الأورام (OVs) هي شكل ناشئ وفريد من أشكال العلاج المناعي للسرطان. OVs تكرار انتقائي في وlyse الخلايا السرطانية (تجنيب الخلايا الطبيعية / السليمة)1 في حين حفز مناعة مضادة للورم2. فيروس الهربس البسيط Oncolytic (oHSV) هو واحد من الفيروسات الأكثر دراسة على نطاق واسع بين جميع OVs. هو أبعد على طول في العيادة, مع Talimogene laherparepvec (T-VEC) كونها OV الأولى والوحيدة التي تتلقى موافقة ادارة الاغذية والعقاقير في الولايات المتحدة لعلاج سرطان الجلد المتقدمة3. بالإضافة إلى T-VEC، يتم اختبار العديد من oHSVs الأخرى المعدلة وراثيا قبل السريرية وسريريا في أنواع السرطان المختلفة3،4،5،6،7،8. وقد زادت التكنولوجيا الحيوية المتقدمة الحالية الحمض النووي المؤتلف من جدوى هندسة جديدة oHSVs الترميز لtransgene العلاجية (ق)3،5. يعد وجود نظام فعال لنشر oHSV وتنقية وتأليف التيتر أمرا بالغ الأهمية قبل أن يتم اختبار أي oHSV (تم تطويره حديثا) في المختبر وفي الدراسات الحية. تصف هذه الورقة طريقة بسيطة خطوة بخطوة لنمو oHSV (في خلايا Vero) ، والتنقية (عن طريق طريقة تدرج السكروز) ، والتكييف (بواسطة فحص لوحة oHSV في خلايا Vero) (الشكل 1). ويمكن اعتماده بسهولة في أي إعداد مختبري من المستوى 2 للسلامة البيولوجية (BSL2) لتحقيق مخزون فيروسي عالي الجودة للدراسات ما قبل السريرية.

Vero، وهو خط خلايا الكلى القرد الأخضر الأفريقي، هو خط الخلية الأكثر استخداما لنشر oHSV9،10،11،12،13 كما خلايا فيرو لديها معيبة المضادة للفيروسات الانترفيرون إشارة المسار14. خطوط الخلايا الأخرى مع محفز معطل من جينات الإنترفيرون (STING) الإشارات يمكن أيضا أن تستخدم لنمو oHSV12,13. يستخدم هذا البروتوكول خلايا Vero لنمو oHSV و المقايسة البلاك. بعد الانتشار، يتم حصاد الخلايا المصابة ب oHSV، والتحلل، وتعرض للتنقية، حيث يتم التعامل مع الخلايا المتحللة أولا بنوكلياز البنزونازي لإضعاف الحمض النووي للخلية المضيفة، ومنع تراكم البروتين الحمضي النووي، والحد من لزوجة ليسات الخلية. كما التنشيط السليم للبنزوناز غالبا ما يتطلب ملغ2 +, 1-2 M MgCl2 يستخدم في هذا البروتوكول15. يتم التخلص من حطام الخلية المضيفة من ليسات الخلية المعالجة بالبنزوناز عن طريق الترشيح التسلسلي قبل الطرد المركزي عالي السرعة من السكروز المتدرجة. يساعد وسادة محلول السكروز اللزجة بنسبة 25٪ على ضمان معدل أبطأ لهجرة الفيروس من خلال طبقة السكروز ، تاركا المكونات المرتبطة بالخلية المضيفة في الفائقة ، وبالتالي تحسين تنقية والحد من فقدان الفيروس في بيليه16. ثم يتم titrated oHSV المنقى على خلايا Vero ، ويتم تصور لويحات الفيروسية من قبل Giemsaتلطيخ 17 أو X-gal تلطيخ (لترميز LacZ oHSVs)18.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1) oHSV النمو

ملاحظة: ضمان موافقة لجنة السلامة البيولوجية المؤسسية قبل العمل مع oHSV. أجريت هذه الدراسة بموجب البروتوكول المعتمد رقم 18007 للجنة. الحفاظ على احتياطات BSL2: تبييض جميع الأنابيب والنصائح والأنابيب وغيرها من المواد التي تتلامس مع الفيروس. رش قفازات مع الكحول isopropyl 70٪ قبل اليدين ترك غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية BSL2. دائما غسل اليدين تماما بالماء الصابون بعد العمل مع فيروس.

  1. في اليوم -1، البذور منخفضة مرور خلايا Vero في 20 T-150 سم2 قوارير في كثافة 7-8 × 106 خلايا / قارورة في المتوسط الخلية فيرو العادية.
    ملاحظة: يتم إعداد Vero Medium عن طريق استكمال متوسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) بمصل عجل الجنين المعطل حراريا بنسبة 10٪ (IFCS).
  2. في اليوم 0 (الخلايا هي التقاء 80-90٪)، إضافة oHSV inoculum على خلايا Vero.
    1. إعداد فيروس inoculum
      1. استخدام تعدد الإصابات (MOI) من 0.01 (يمكن أن تختلف وزارة الداخلية من 0.01 إلى 0.1 اعتمادا على قدرة النسخ المتماثل للفيروس) لتضخيم الفيروس. استخدام الصيغة (1) لحساب كمية الفيروس (مل) ل20 قوارير.
        كمية الفيروس (مل) ل20 قوارير = كمية الفيروس اللازمة (pfu) / titer من مخزون الفيروس (pfu / مل) (1)
      2. استخدام المالحة عالية الجلوكوز Dulbecco الفوسفات العازلة (DPBS) تكملها مع 1٪ IFCS لإعداد inoculum الفيروس (7 مل لكل T-150 سمقارورة 2، أي، ~ 140 مل لمدة 20 قارورة). إضافة الكمية المطلوبة من oHSV إلى 140 مل من محلول DPBS/1٪ IFCS عالي الجلوكوز، دوامة لمدة دقيقة واحدة، والحفاظ على الخليط جاهزا للإضافة إلى خلايا Vero.
    2. غسل T-150 سم2 قوارير 2x مع DPBS عالية الجلوكوز تكملها مع 1٪ IFCS (10 مل / غسل). أسبير DPBS/1٪ IFCS وإضافة 7 مل من الفيروس inoculum/T-150 سمقارورة 2.
    3. صخرة بلطف قوارير لمدة 5 دقائق باستخدام الروك قارورة للتوزيع السليم لل inoculum على طبقة أحادية فيرو، ومن ثم احتضان قوارير في 37 درجة مئوية لمدة 1.5-2 ساعة. تأكد من أن رف الحاضنة هو المستوى.
    4. إزالة inoculum وإضافة DMEM تستكمل مع 1٪ IFCS (25 مل / قارورة). احتضان قوارير لمدة 2-4 أيام.
  3. تحقق من القوارير يوميا للحصول على CPE 90-100٪ (انظر الشكل 2).
  4. حصاد خلايا فيرو المصابة oHSV.
    1. جمع الثقافة supernatant (~ 20 مل) من كل قارورة (ترك ~ 5 مل في كل قارورة) في 50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية أو حاوية وسائل الإعلام.
    2. استخدام مكشطة الخلية لكشط الخلايا من الجزء السفلي من القوارير بلطف.
      ملاحظة: يجب أن تأتي الخلايا بسرعة قبالة قوارير.
    3. إضافة ~ 15 مل من الثقافة supernatant (التي تم جمعها في الخطوة 1.4.1) إلى كل قارورة (الذي يجلب حجم ~ 20 مل في كل قارورة، أي 400 مل لمدة 20 قارورة) وغسل بلطف الجزء السفلي من قوارير عدة مرات باستخدام أنبوب المصلية العقيمة 10 مل.
      ملاحظة: لا الأنابيب بقوة. تهدف إلى الحفاظ على جميع الخلايا سليمة.
    4. جمع الخلايا (+ متوسطة) في 50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية على الجليد (استخدام 8 أنابيب لعقد 400 مل من الخلايا المحصودة من 20 قوارير).
    5. تدور الخلايا في 300 غرام لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية و يستنشق supernatant.
    6. أضف 1.25 مل (50٪) من الفيروسات العازلة (VB) و 1.25 مل (50٪) من الثقافة supernatant (التي تم جمعها في الخطوة 1.4.1) إلى كل أنبوب الطرد المركزي وإعادة تعليق كل بيليه تماما. نقل الخلايا المعلقة من ثمانية أنابيب الطرد المركزي 50 مل إلى أنبوب واحد 50 مل الطرد المركزي المخروطي.
      ملاحظة: الرجوع إلى إعداد حل VB في الجدول 1. تصفية تعقيم الحل VB باستخدام عامل تصفية تعقيم الوسائط. استخدام 0.5 مل من VB + 0.5 مل من supernatant لكل T-150 سم2 قارورة لإعادة تعليق، أي، ل20 قارورة (20 مل)، واستخدام 10 مل من VB و 10 مل من الثقافة supernatant.
    7. المفاجئة تجميد الخلايا إعادة تعليق باستخدام الثلج الجاف / 100 ٪ الايثانول وتخزينها في -80 درجة مئوية.

2) oHSV تنقية

  1. المفاجئة تجميد (في الثلج الجاف والإيثانول 100٪) / ذوبان (في حمام الماء الدافئ 37 درجة مئوية) الخلايا تليها المياه حمام سونيكيشن لمدة 1 دقيقة لما مجموعه 3 دورات لضمان تحلل السليم للخلايا لإطلاق الفيروس في supernatant.
    ملاحظة: تنفيذ سونيكيشن لمدة 1 دقيقة باستخدام 40 كيلوهرتز، 120 V السلطة. إذا لم يكن sonicator غير قادر على ذلك، استخدم sonicator حمام الماء بالموجات فوق الصوتية. خذ 50 ميكرولتر من الكوت للتحمير في القسم 3، مما سيساعد على تحديد أي من الخطوات التالية مسؤولة عن فقدان الفيروس المحتمل أثناء إجراء التطهير.
  2. علاج lysate الخلية مع نواة البنزوناسي (175 وحدة / مل) + 2 م MgCl2 (1 M المخزون = 2 ميكرولتر / مل)، دوامة، واحتضان لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية. ضع الأنبوب على الجليد واؤدي الخطوات التالية عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  3. بيليه حطام الخلية عن طريق الطرد المركزي منخفض السرعة.
    1. تدور الخلية lysate في 300 غرام لمدة 10 دقيقة.
    2. جمع supernatant في أنبوب طرد مركزي مخروطي 50 مل جديدة (إعادة تعليق بيليه الخلية في 0.5 مل من VB, تعيينها على أنها بيليه-1, وتخزينها في 4 درجة مئوية للاستخدام في الخطوة 2.3.5; انظر الشكل 1).
    3. تدور supernatant (التي تم الحصول عليها في الخطوة 2.3.2) مرة أخرى في 500 غرام لمدة 10 دقيقة.
    4. جمع supernatant في أنبوب طرد مركزي مخروطي 50 مل جديدة (إعادة تعليق بيليه الخلية في 0.5 مل من VB, تعيينها على أنها بيليه-2, وتخزينها في 4 درجة مئوية للاستخدام في الخطوة 2.3.5; انظر الشكل 1).
    5. الجمع بين بيليه-1 إعادة تعليق (من 2.3.2) والكريه-2 (من 2.3.4) في أنبوب الطرد المركزي 1.7 مل جديدة, دوامة / سونيكاتي (حمام مائي) 2x, وتدور في 400 غرام لمدة 10 دقيقة. جمع supernatant والجمع بين ذلك مع supernatant التي تم الحصول عليها في الخطوة 2.3.4؛ انظر الشكل 1).
      ملاحظة: إجراء سونيكيشن لمدة دقيقة واحدة باستخدام 40 كيلوهرتز، 120 فولت السلطة لمنع تجميع الفيروسية قبل إجراء الترشيح في الخطوة 2.4. خذ 50 ميكرولتر aliquot من العملاق مجتمعة ل titration في القسم 3.
  4. تصفية supernatant مجتمعة (~ 21 مل، أي 20 مل من 1.4.6، 0.5 مل من 2.3.2، و 0.5 مل من 2.3.4) باستخدام طريقة الترشيح التالية من 3 خطوات.
    1. رسم 21 مل من supernatant باستخدام حقنة 10 مل (5-7 مل في كل مرة لسهولة المرور من خلال مرشح) وتمريره من خلال عقيمة 5 ميكرومتر بولي فينيلدين difluoride (PVDF) مرشح غشاء وضعت على أنبوب جديد 50 مل الطرد المركزي المخروطي (المسمى أنبوب 1).
      1. أضف 1 مل من VB إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 50 مل تم إفراغه في 2.4.1 (لجمع الكمية النزرة المتبقية من الفيروس الفائق) ، دوامة ، وتمر عبر نفس فلتر PVDF 5 ميكرومتر الموضوع على TUBE 1 (ليصل المجموع إلى 22 مل من الفيلترات). انتقل إلى الخطوة 2.4.2.
    2. رسم 22 مل من filtrate من TUBE 1 (كما هو الحال في 2.4.1) وتمريره من خلال معقمة 0.8 ميكرومتر مختلطة السليلوز استر (MCE) مرشح غشاء وضعت على أنبوب طرد مركزي مخروطي 50 مل جديدة (المسمى أنبوب 2).
      1. إضافة 1 مل من VB إلى TUBE 1 أفرغت في الخطوة 2.4.2، دوامة، وتمريره من خلال نفس 0.8 ميكرومتر MCE مرشح وضعت على TUBE 2 (ليصل المجموع إلى 23 مل من الخيوط). انتقل إلى الخطوة 2.4.3.
    3. رسم 23 مل من filtrate من TUBE 2 (كما هو الحال في 2.4.1) وتمريره من خلال معقمة 0.45 ميكرومتر PVDF مرشح وضعت على أنبوب طرد مركزي مخروطي 50 مل جديدة (المسمى أنبوب 3).
      1. إضافة 1 مل من VB إلى TUBE 2 أفرغت في الخطوة 2.4.3، دوامة، وتمريره من خلال نفس 0.45 ميكرومتر PVDF مرشح وضعت على TUBE 3 (ليصل المجموع إلى 24 مل من الخيوط).
        ملاحظة: خذ a 50 ميكرولتر aliquot من filtrate للتمليك في القسم 3.
  5. طرد مركزي عالي السرعة باستخدام طريقة تدرج السكروز
    ملاحظة: تم استخدام دوار F13-14x50cy ذو زاوية ثابتة في هذا البروتوكول. يجب أن يكون كل من الدوار والطرد المركزي عند درجة حرارة 4 درجات مئوية قبل الشروع في الخطوات التالية.
    1. أضف 10 مل من محلول السكروز البارد والمعقم المصفى بنسبة 25٪ (تم إعداده عن طريق إذابة 25 جراما من مسحوق السكروز في 100 مل من محلول الملح المتوازن من Hank) في أنبوب طرد مركزي مخروطي جديد سعة 50 مل.
    2. ببطء (3 مل / دقيقة) إضافة 24 مل من الفيروس filtrate (التي تم الحصول عليها من الخطوة 2.4.3.1) على رأس طبقة السكروز. الحرص على الحفاظ على طبقات منفصلة من الفيروس filtrate والحل السكروز.
      ملاحظة: يمكن إضافة ما يصل إلى 30 مل من طبقة الفيروسات أكثر من 10 مل من محلول السكروز.
    3. الطرد المركزي أنبوب لمدة 90 دقيقة في 22620 غرام في 4 درجة مئوية.
    4. إزالة supernatant وطبقة السكروز من أنبوب الطرد المركزي مخروطي 50 مل.
      ملاحظة: يجب أن يكون بيليه الفيروس أبيض. خذ 50 ميكرولتر aliquot من supernatant و aliquot 50 ميكرولتر من طبقة السكروز للتمليك في القسم 3.
  6. إعادة تعليق بيليه في 10٪ الجلسرين / PBS الحل.
    1. إضافة 1 مل من الجلسرين العقيم 10٪ (مخفف في برنامج تلفزيوني) إلى أنبوب الطرد المركزي المخروطي 50 مل لتغطية بيليه.
      ملاحظة: يمكن أن تختلف كمية الخليط الذي أعيد تعليقه (مثل 0.8-1.2 مل) اعتمادا على حجم الكريات. ومن شأن حجم أصغر إعطاء تركيز أعلى من الفيروس.
    2. ضع أنبوب الطرد المركزي المخروطي سعة 50 مل على الجليد لمدة 2-4 ساعة. خلال هذه الفترة، سونيكاتي / دوامة بيليه كل 15 دقيقة لمدة 30 ثانية للمساعدة في طرد / إعادة تعليق بيليه.
    3. جمع بيليه إعادة تعليق (1 مل من 10٪ الجلسرين / برنامج تلفزيوني + حجم بيليه سوف تجلب الحجم الإجمالي إلى ~ 1.3 مل) في أنبوب ميكروسينتريف 2 مل. [اختياري: إضافة آخر 0.3 مل من 10٪ الجلسرين / برنامج تلفزيوني إلى نفس أنبوب الطرد المركزي المخروطي 50 مل لجمع المبلغ المتبقي من بيليه, pipet صعودا وهبوطا, والجمع مع بيليه إعادة تعليق في الخطوة 2.6.3 ليصل إجمالي حجم إلى ~ 1.6 مل.]
      1. إذا كان التعليق في الخطوة 2.6.3 عكر أو غائم (بسبب حطام الخلية)، قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 500 غرام لمدة 10 دقائق، ونقل الناطور إلى أنبوب طرد مركزي صغير جديد سعة 2 مل، ثم انتقل إلى الخطوة 2.6.4.
    4. خذ 50 ميكرولتر aliquot لoHSV المعايرة في القسم 3. Aliquot بقية الحل (250 ميكرولتر / aliquot) في أنابيب الطرد الدقيق العقيمة مع قبعات المسمار (مختومة جيدا للتخزين على المدى الطويل)، المفاجئة تجميد، وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام (جاهزة للدراسات التجريبية بمجرد تحديد titer oHSV).
      ملاحظة: يجب تبييض جميع المواد التي تتلامس مع الفيروس أو معالجتها بالأشعة فوق البنفسجية قبل إزالتها من غطاء محرك السيارة أو التخلص منها.

3. المعايرة oHSV و المقايسة البلاك

  1. البذور 1.7-1.8 × 105 خلايا Vero / جيدا في لوحة ثقافة الخلايا 6-جيدا في المتوسط الخلية فيرو (DMEM مع 10٪ IFCS؛ انظر الخطوة 1.1).
    ملاحظة: تأكد من توزيع الخلايا بشكل متجانس في جميع أنحاء البئر; لا تدور لوحة، والتي يمكن أن تسبب تراكم الخلايا في منتصف الآبار. لمنع الدوامة، هز ببطء لوحة باليد عموديا، ثم أفقيا، ومن ثم وضع بلطف لوحة في الحاضنة.
  2. في اليوم التالي (عندما تصل الخلايا إلى 70-80٪ التقاء)، يستنشق المتوسطة الثقافة، وإضافة 1 مل / بئر من برنامج تلفزيوني عالي الجلوكوز تكملها مع 1٪ IFCS. اترك اللوحة في غطاء محرك السيارة الموروث الخلوي حتى تكتمل الخطوة 3.3.
  3. تخفيف الفيروس في أنابيب البولي بروبلين 5 مل باستخدام PBS/1٪ IFCS (الشكل 3).
    ملاحظة: استخدم aliquot 50 ميكرولتر التي تم جمعها في الخطوة 2.6.4 لتخفيف المسلسل. في أنبوب 1st (10-3 التخفيف)، إضافة 2 ميكرولتر من الفيروس في عام 1998 ميكرولتر من PBS/1٪IFCS، دوامة. في الأنبوبالثاني (10-5 تخفيف)، خذ 10 ميكرولتر من أنبوب 1st في 990 ميكرولتر من PBS/1٪ IFCS، الدوامة. في أنبوب3 rd (10-6 التخفيف)، واتخاذ 100 ميكرولتر من أنبوب 2 في 900 ميكرولتر من PBS/1٪ IFCS، دوامة. مواصلة هذا التخفيف التسلسلي 10 أضعاف حتى10-9 التخفيف. انظر التفاصيل في الشكل 3.
  4. أسبيرات PBS/1٪ IFCS, وإضافة 0.7 مل/ بئر من الفيروس المخفف تسلسليا (بدءا من10-5 إلى 10-9) إلى خلايا Vero.
    ملاحظة: لا تدع الخلايا تجف.
  5. صخرة بلطف لوحة على الروك لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (لضمان توزيع متجانسة من inoculum الفيروس).
  6. احتضان لوحة لمدة 1.5 ساعة في 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: خلال فترة الحضانة هذه، قم بإعداد 1:1000 تخفيف الغلوبولين المناعي البشري G (IgG) في DMEM المكمل بنسبة 1٪ من IFCS. للحصول على طبق من 6 آبار، قم بإعداد 12.5 مل بحيث يمكن استخدام 2 مل/بئر في الخطوة 3.7. ضبط التخفيف لحساب الاختلافات الكثير في IgG الإنسان.
  7. إزالة الفيروس inoculum من الآبار، وإضافة 2 مل / بئر من 0.1٪ IgG الإنسان (لتحييد oHSV في وسط الثقافة ومنع تشكيل لويحات الثانوية) في DMEM تكملها مع 1٪ IFCS. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 3-4 أيام.
    ملاحظة: تتشكل اللويحات الواضحة عادة في غضون 3 أيام.
  8. إصلاح وتلطيخ لوحات
    1. إزالة supernatant، وإصلاح الخلايا في الميثانول النقي (1 مل / جيدا) لمدة 5 دقائق. إزالة الميثانول، والسماح للوحات لتجف الهواء.
    2. تمييع Giemsa وصمة عار (1:5) مع الماء deionized، وإضافة 1 مل من وصمة عار Giemsa المخفف لكل بئر. احتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10-15 دقيقة.
    3. إزالة وصمة عار، وشطف مع ماء الصنبور، والسماح للوحات للهواء الجاف.
    4. عد لويحات باستخدام المجهر تشريح.
    5. اختياري ل oHSVs مع تعبير lacZ:
      1. إزالة supernatant، وإصلاح الخلايا مع البرد 0.2٪ غلوتارالدهيد/2٪ بارافورمالديهايد لمدة 5-10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      2. إزالة الحل المثبت، وغسل الخلايا 3x مع برنامج تلفزيوني.
      3. إضافة محلول X-gal إلى الخلايا (1 مل/جيدا)، واحتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
        ملاحظة: يجب إعداد وصمة X-gal طازجة في يوم التلطيخ. التخزين على المدى الطويل قد يؤدي إلى تلاشي اللون. انظر إعداد حل X-gal في الجدول 1.
      4. إزالة وصمة عار X-غال، وغسل لوحة مع ماء الصنبور لمدة 1 دقيقة.
      5. مضاد للبقع مع محلول أحمر محايد (1 مل/جيدا) لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة.
        ملاحظة: انظر إعداد الحل الأحمر المحايد في الجدول 1.
      6. غسل لوحة مع ماء الصنبور لمدة 1 دقيقة. السماح للوحات للهواء الجاف.
      7. عد لويحات زرقاء باستخدام المجهر تشريح (الشكل 4).
  9. حساب titer باستخدام الصيغة (2)
    Titer في pfu/mL (وحدات تشكيل البلاك) = عدد لويحات /0.7 مل × عامل تخفيف (2)
    ملاحظة: على سبيل المثال، إذا تم العثور على 25 لويحات في10-9 تمييع جيدا، تيتر هو 25/0.7 × 109 = 35.7 × 109 = 3.57 × 1010 pfu/mL. هذا هو titer oHSV النهائي من aliquots أعدت في الخطوة 2.6.4.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

ويرد عرض موجز للبروتوكول بأكمله في الشكل 1، والذي يمثل الخطوات الحاسمة التي ينطوي عليها نمو وتنقية و titration من oHSV. CPE في خلايا Vero يمكن الكشف عنها في وقت مبكر من 4 ح بعد الإصابة HSV19. يوضح الشكل 2 CPE في خلايا Vero في ثلاث نقاط زمنية مختلفة بعد عدوى oHSV. يتم زيادة مستوى CPE مع مرور الوقت. في هذا البروتوكول، عادة ما يلاحظ 90-100٪ CPE في غضون 48 ساعة من تلقيح oHSV منخفضة MOI (وهو أفضل وقت لحصاد الخلايا للتنقية). ومع ذلك، يمكن أن يس...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يبدأ البروتوكول بنمو oHSV في خلايا Vero منخفضة المرور. يجب أن يكون التقاء أحادي الطبقة الخلية Vero ~ 80٪ في وقت تلقيح الفيروسات كما يمكن للخلايا المتضخمة تطوير هياكل ليفية ضيقة يمكن أن تقلل من دخول oHSV إلى خلايا Vero20. مرة واحدة لوحظ 90-100٪ CPE، تتم إزالة الطبيعة الثقافية، يتم حصاد الخلايا، وإعادة الإنفاق في VB/supernatant (انظر الخطوة 1.4.6)، المفاجئة المجمدة، وتخزينها في -80 درجة مئوية لتنقية في وقت لاحق. استخدم بلاهو وزملاؤه طريقة مختلفة قليلا لحصاد وتخزين خلايا فيرو المصابة. على سبيل المثال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

حقوق السحب الخاصة هو المخترع المشارك على براءات الاختراع المتعلقة بفيروسات الهربس البسيط oncolytic، التي تملكها وتديرها جامعة جورجتاون ومستشفى ماساتشوستس العام، والتي تلقت إتاوات من شركة أمجين وActiVec وهو في المجلس الاستشاري العلمي لEG 427. وليس لدى المؤلفين الآخرين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم دعم الأبحاث في مختبر ساها جزئيا بأموال من إدارة المكافحة (W81XWH-20-1-0702) ومؤسسة دودج جونز-أبيلين. صموئيل د. رابكين وميليسا ر.M همفري كانا مدعومين جزئيا من قبل المعاهد القومية للصحة (R01 CA160762).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أنابيب الطرد المركزي سعة 1.7 مل أنابيب الطرد المركزيSigmaCLS3620
15 مل أنابيب الطرد المركزي من مادة البولي بروبلينFalcon352097
5 مل أنابيب البولي بروبلينFalcon352063
50 مل أنابيب الطرد المركزي من مادة البولي بروبيلينFalcon352098
آبار لوحات زراعةFalcon353046
Benzonase NucleaseSigmaE8263-25KU
مكشطة خليةفيشر Scientific179693
ثنائي ميثيل سلفوكسيدSigmaD2650-100ML
Dulbecco ' s النسر المعدل متوسطكورنينجMT-10-013-CV
Dulbecco ' s فوسفات مخزن محلول ملحيCorningMT-21-031-CV
مصل الأبقار الجنينيHycloneSH3007003
Giemsa StainSigmaG3032
GlutaraldehydeFisher Scientific50-262-23
GlycerolSigmaG5516
محلول الملح المتوازن هانك (HBSS)CorningMT-21-021-CV
Dulbecco عالي الجلوكوز s محلول ملحي مخزن بالفوسفاتSigmaD4031
الجلوبيولين المناعي البشريGamastanNDC 13533-335-12
كلوريد المغنيسيومفيشر كيميكالM33-500
مرشح تعقيم الوسائط ، 250 ملNalgene ، Fisher Scientific09-740-25E
مرشح تعقيم الوسائط ، 500 ملNalgene ، فيشر Scientific09-740-25C
الحل الأحمر المحايدSigmaN4638
ParaformaldehydeFisher العلمي  15710S
لوحة الروكفيشر88861043
البوتاسيوم فيريسيانيدسيجماP8131
البوتاسيوم فيروسيانيدسيجماP9387
كلوريد الصوديومفيشر الكيميائيةS271-3
سورفال ST 16R أجهزة الطرد المركزيThermoFisher Scientific75004381
Sorvall ST 21R أجهزة الطرد المركزيThermoFisher Scientific75002446
أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المعقمة مع أغطية لولبيةفيشر Scientific02-681-371
السكروزفيشر ScientificBP220-1
، 0.45 PVDFMilliporeSigmaSLHV033RS
مرشح حقنة ، 0.8 MCEMilliporeSigmaSLAA033SS
فلتر الحقنة ، 5 & ميكرو ؛ م PVDFMilliporeقارورة ثقافةT150 SLSV025LS
T150Falcon355001
Tris-HClMP Biomedicals LLC816116
حمام مائي بالموجات فوق الصوتيةبرانسونCPX-952-116R
X-galCorning46-101-RF
6 الخلايا مرشح حقنة

المراجع

  1. Harrington, K., Freeman, D. J., Kelly, B., Harper, J., Soria, J. -C. Optimizing oncolytic virotherapy in cancer treatment. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (9), 689-706 (2019).
  2. Zhang, S., Rabkin, S. D. The discovery and development of oncolytic viruses: are they the future of cancer immunotherapy. Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (4), 391-410 (2021).
  3. Bommareddy, P. K., Peters, C., Saha, D., Rabkin, S. D., Kaufman, H. L. Oncolytic herpes simplex viruses as a paradigm for the treatment of cancer. Annual Review of Cancer Biology. 2 (1), 155-173 (2018).
  4. Peters, C., Rabkin, S. D. Designing herpes viruses as oncolytics. Molecular Therapy-Oncolytics. 2, 15010(2015).
  5. Nguyen, H. -M., Saha, D. The current state of oncolytic herpes simplex virus for glioblastoma treatment. Oncolytic Virotherapy. 10, 1-27 (2021).
  6. Koch, M. S., Lawler, S. E., Chiocca, E. A. HSV-1 oncolytic viruses from bench to bedside: an overview of current clinical trials. Cancers. 12 (12), 3514(2020).
  7. Menotti, L., Avitabile, E. Herpes simplex virus oncolytic immunovirotherapy: the blossoming branch of multimodal therapy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 8310(2020).
  8. Nguyen, H. M., Guz-Montgomery, K., Saha, D. Oncolytic virus encoding a master pro-inflammatory cytokine interleukin 12 in cancer immunotherapy. Cells. 9 (2), 400(2020).
  9. Agarwalla, P. K., Aghi, M. K. Oncolytic herpes simplex virus engineering and preparation. Methods in Molecular Biology. 797, 1-19 (2012).
  10. Grosche, L., et al. Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves. Bio-protocol. 9 (23), 3441(2019).
  11. Sutter, S. O., Marconi, P., Meier, A. F. Herpes simplex virus growth, preparation, and assay. Methods in Molecular Biology. 2060, 57-72 (2020).
  12. Froechlich, G., et al. Integrity of the antiviral STING-mediated DNA sensing in tumor cells is required to sustain the immunotherapeutic efficacy of herpes simplex oncolytic virus. Cancers. 12 (11), 3407(2020).
  13. Froechlich, G., et al. Generation of a novel mesothelin-targeted oncolytic herpes virus and implemented strategies for manufacturing. International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 477(2021).
  14. Mosca, J. D., Pitha, P. M. Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis. Molecular and Cellular Biology. 6 (6), 2279-2283 (1986).
  15. Gousseinoz, E., Kools, W., Pattnaik, P. Nucleic acid impurity reduction in viral vaccine manufacturing. BioProcess International. 12 (2), 59-68 (2014).
  16. Herpes simplex virus: methods and protocols. Methods in Molecular Biology. Diefenbach, R. J., Fraefel, C. , Humana Press. New York, USA. (2014).
  17. Hadi, A. M., et al. An experimental trial to prepared γ1 34.5 herpes simplex virus 1 immunogene by cloning technique. Systematic Review Pharmacy. 11 (5), 140-149 (2020).
  18. Kuroda, T., Martuza, R. L., Todo, T., Rabkin, S. D. Flip-Flop HSV-BAC: bacterial artificial chromosome based system for rapid generation of recombinant herpes simplex virus vectors using two independent site-specific recombinases. BMC Biotechnology. 6, 40(2006).
  19. Motamedifar, M., Noorafshan, A. Cytopathic effect of the herpes simplex virus type 1 appears stereologically as early as 4 h after infection of Vero cells. Micron. 39 (8), 1331-1334 (2008).
  20. Blaho, J. A., Morton, E. R., Yedowitz, J. C. Herpes simplex virus: propagation, quantification, and storage. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 14, Unit 14E 1(2005).
  21. Malenovska, H. The influence of stabilizers and rates of freezing on preserving of structurally different animal viruses during lyophilization and subsequent storage. Journal of Applied Microbiology. 117 (6), 1810-1819 (2014).
  22. Vahlne, A. G., Blomberg, J. Purification of herpes simplex virus. Journal of General Virology. 22 (2), 297-302 (1974).
  23. Sathananthan, B., Rodahl, E., Flatmark, T., Langeland, N., Haarr, L. Purification of herpes simplex virus type 1 by density gradient centrifugation and estimation of the sedimentation coefficient of the virion. APMIS: Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 105 (3), 238-246 (1997).
  24. Mundle, S. T., et al. High-purity preparation of HSV-2 vaccine candidate ACAM529 is immunogenic and efficacious in vivo. PLoS One. 8 (2), 57224(2013).
  25. Jiang, C., et al. Immobilized cobalt affinity chromatography provides a novel, efficient method for herpes simplex virus type 1 gene vector purification. Journal of Virology. 78 (17), 8994-9006 (2004).
  26. Grosche, L., et al. Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves. Bio-protocol. 9 (23), 3441(2019).
  27. Svennerholm, B., et al. Separation of herpes simplex virus virions and nucleocapsids on Percoll gradients. Journal of Virological Methods. 1 (6), 303-309 (1980).
  28. Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (93), e52065(2014).
  29. Miyatake, S., Iyer, A., Martuza, R. L., Rabkin, S. D. Transcriptional targeting of herpes simplex virus for cell-specific replication. Journal of Virology. 71 (7), 5124-5132 (1997).
  30. Fabiani, M., Limongi, D., Palamara, A. T., De Chiara, G., Marcocci, M. E. A novel method to titrate herpes simplex virus-1 (HSV-1) using laser-based scanning of near-infrared fluorophores conjugated antibodies. Frontiers in Microbiology. 8, 1085(2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

فيروس الهربس الحالة للأورامتنقية الفيروسمقايسة اللويحاتالتأثير الممرض للخلاياخلايا Veroتدرج السكروزالعلاج المناعي للسرطانمعايرة الفيروسالمعالجة بإنزيم Benzonaseتحضير المخزون الفيروسي
نمو وتنقية وتكرير فيروس الهربس البسيط Oncolytic
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.