تحليل ^{الكم 31}P NMR من التينين والعفص

وقد استشهد هذا الإجراء، الذي نشر مؤخرا في بروتوكولات الطبيعة¹ أكثر من 3000 مرة في الأدب الأرشيفي وأصبح قياس روتيني لتوصيف اللجنين والتانين لأنه يوفر معلومات هيكلية أساسية وسريعة وقابلة للاستنساخ.

اللجنين والعفص
عندما قدم الكيمياء الخضراء من قبل بول T. أناستاس وجون C. فيرنر^2,3, غيرت جذريا المفهوم العام للكيمياء. وعلى وجه الخصوص، تبرز أهمية استخدام المواد المستدامة بدلا من المواد الخام الأحفورية، مثل النفط والفحم، كنقطة انطلاق كجانب حاسم^2و3. من بين أنواع مختلفة من الكتلة الحيوية، اللجنين هو البوليمر الحيوي العطرية الأكثر وفرة ويمكن أن ينظر إليها على أنها مصدر محتمل للسلع الصناعية والمنتجات ذات القيمة المضافة العالية⁴.

اللجنين هو ثاني أكثر الأخشاب وفرة (مع السليلوز يجري أولا والهيميسليلوز الثالث). يختلف محتواه في النباتات حسب نوع النبات: على سبيل المثال الأخشاب الصلبة التي تتميز بكمية أقل من اللجنين مقارنة بالأخشاب اللينة (20٪ ± 4٪ مقابل 28٪ ± 4٪). بالإضافة إلى ذلك ، فإن توزيع اللجنين داخل الأنسجة النباتية ليس متجانسا: يمكن العثور على محتوى اللجنين الأعلى في جدار الخلية^5،6. اللجنين مادة متعددة الفينوليات تم الحصول عليها صناعيا كمنتج ثانوي لصناعة الورق / السليلوز⁷. يتم استرداده من عملية لب الخشب ، حيث تتم معالجة رقائق الخشب في المقام الأول في وجود OH^- و / أو OH^- + HS^- ظروف أيون لفصل السليلوز عن الهيميسيلولوز واللجنين (عمليات الصودا و / أو كرافت)^8،9.

أولى محاولات دراسة اللجنين قام بها بايين وشولتز على التوالي في 1838 و1865¹⁰. في عام 1977 ، أدلر لخص كل ما هو متاح من المعرفة ذات الصلة في ذلك الوقت^11. ومن المسلم به حاليا أن اللبنات الأساسية لللجنين هي ثلاث وحدات الفينيل بروبانويد: ف-كوماريل، كونيفيريل، والكحول سينابيل. هذه مونومرات، وذلك بفضل عملية البلمرة الراديكالية الحرة، تؤدي إلى فهيدروكسيفينيل، غواياسيل، والسنابيل الوحدات التي تشكل في نهاية المطاف على نطاق واسع اللجنين (الشكل 1)¹². عدم وجود هيكل أولي في lignins يعني صعوبة متأصلة في توصيفها الهيكلي. وبناء على ذلك، كان تقييم توزيع الوزن الجزيئي دائما مثيرا للجدل إلى حد ما. اللجنين الخشب المطحون، اللجنين معزولة في ظل ظروف معتدلة أن معظمها تقريبا protolignin^10،ويتكون من oligomers¹³ التي تتفاعل بشكل كبير عن طريق عمليات التجميع فوق^{الجزيئية 14،15}.

الشكل 1:نموذج تمثيلي لللجنين الخشب اللين الذي يتم تسليط الضوء على أنواع مختلفة من السندات.

تصنف الليجينات عادة اعتمادا على: (أ) نوع الخشب الذي تستمد منه (مثل الخشب الصلب والخشب اللين)، (ب) العملية المستخدمة لعزله. أنواع اللجنين الصناعية الأكثر أهمية هي كرافت، ليغنوسلفونات، والأرغانوسلف.

يعتمد هيكل اللجنين بشكل كبير على أصله وكيمياء المعالجة. وبشكل أكثر تحديدا، عندما يتفاقم الهيكل المعقد وغير المنتظم لللجنين مع تنوعه الطبيعي وكيمياء المعالجة المعقدة، تظهر مادة ذات تباين شديد وتنوع وتغايرية، مما يحد من استخدامه للتطبيقات منخفضة القيمة^16. في حين أن الليجنينز الخشب اللين تحتوي أساسا وحدات غواياسيل (G) مع كميات لا تذكر من مجموعات p-hydroxyphenyl (G lignin)، تتكون الليجنينز الخشب الصلب من قبل الوحدات الفرعية غواياسيل وسيرينجيل (GS lignin) بنسب متفاوتة ويتم تشكيل lignins العشب من قبل guaiacyl، سيرينجيل، وp-هيدروكسيفينيل(GSH lignin) الوحدات الفرعية. النهج الاستخراجي المستخدم للعزلة يؤثر بشكل كبير على هيكل اللجنين الناشئ¹⁷. يصور الشكل 2 ثلاثة هياكل للجنين، تختلف باختلاف نهج العزل المستخدم. ويمكن إبراز بعض الاعتبارات المتعلقة بتأثير طريقة الاستخراج. أولا، كرافت ليجنين هو اللجنين غير متلاءم، مجزأة للغاية، ومكثفة، في حين أن أورجانوسلف ليجنين لديه بنية مماثلة لللجنين الخشب المطحون (معزولة باستخدام نهج بيوركمان)^18،19،20. وأخيرا، تتميز lignosulfonates بدرجة عالية من السلفونات، اعتمادا على كثافة وظروف عملية السلفونات الاستخراجية.

الشكل 2:الهياكل التمثيلية للسينيينات التقنية. في هذا الرقم، يمكن رؤية الاختلافات بين أنواع مختلفة من اللجنين. (أ)الخشب اللين كرافت اللجنين مكثف للغاية،(ب)وتتميز lignosulfonates من قبل مجموعات كبرتونيك على الكربونات المشبعة، و (C) اللجنين organosolv لديه بنية مماثلة لتلك التي من الخشب المطحون اللجنين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

على غرار الليغنينز ، العفص هي مركبات متعددة الفينولي التي توجد في النباتات. مؤخرا وتحديث استعراض على التانين 'النهج الاستخراجية والتطبيقات صدر مؤخرا من قبل داس وآخرون²¹. ويمكن تسليط الضوء على أهمية العفص في الحياة اليومية النظر في مثالين: أنها تضفي الطعم واللون على النبيذ²²; وعلاوة على ذلك هيكلها متعدد الفينولية يقدم خصائص مضادة للأكسدة ويجعلها مثالية للتطبيق في صناعة الدباغة²³. وتنقسم العفص إلى فئتين: قابلة للتحلل المائي وغير قابلة للتحلل المائي. يمكن اعتبار العفص القابل للتحلل بوليمر من استرات حمض الغالي ، دي غاليك ، و ellagic(الشكل 3). هذه استرات نتيجة استرداد الأحماض الفينولية مع جزيئات السكر (على سبيل المثال، الجلوكوز، الرهامنوس، وأرابينوز).

الشكل 3: العفص القابلة للتحلل المائي النموذجي: حمض التانيك ، vescalgin. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

العفص غير القابلة للتحلل المائي ، والمعروف أيضا باسم العفص المكثف ، هي البوليمرات وأوليجومرات مشتقة من فلافان -3-ols. بين فلافان-3-ols، catechins وجالوكاشين هي الأكثر شيوعا. فهي مركبات بلورية عديمة اللون(الشكل 4). البلمرة يخلق البوليمر تتميز هيكل helicoidal. يتم توجيه مجموعات الهيدروكسي العطرية على السطح الخارجي للحلزون ، في حين أن الأكسجين البيران في الداخل.

الشكل 4: هياكل بروانتوسيانيدين: R = H، OH، OCH₃. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

توصيف الليجينات والعفص باستخدام NMR
وهناك نوعان من المعلومات حاسمان في توصيف اللجنين أو التانين: (أ) التركيب الكيميائي (مثل محتوى مجموعة الهيدروكسي، والطبيعة، وتواتر الروابط بين الوحدات) و (ب) الوزن الجزيئي والتعددية. منذ الدراسات المبكرة على اللجنين، تم استخدام تقنيات مختلفة لتحقيق هذه الأهداف، وظهرت فئتين من الأساليب: الأساليب الكيميائية والفيزيائية.

في كيمياء اللجنين ، تم استخدام الطرق الكيميائية ، مثل أكسدة النيتروبينزين القلوية ، اشتقاق تليها شق اختزالي ، أكسدة البيرمانجانات ، وثيواسيدليسيس ، تاريخيا على نطاق واسع^{24،25،26،27،28،29}. ومع ذلك ، حتى لو تم تنفيذ البروتوكولات التحليلية وتحسينها ، فهي تتطلب وقتا طويلا وشاقة وتتطلب مهارات تجريبية واسعة^{النطاق 30.} بدلا من ذلك ، من بداية التحليل الآلي ، تم استخدام أساليب مادية لأداء توصيفات اللجنين والتانين³¹. هذه التقنيات تسمح للتغلب على مشاكل الأساليب الكلاسيكية مما يجعل من السهل توصيف هيكل اللجنين.

الرنين المغناطيسي النووي (NMR) يسمح بالحصول على معلومات حول بنية اللجنين والتركيب الكيميائي بين التقنيات الآلية. على وجه الخصوص، يمكن للبيانات من ^{الأطياف الكمية}أحادية الأبعاد 1 H NMR والكمية ¹³C NMR الأطياف توفير معلومات حول أنواع مختلفة من الترابطات بين الوحدات اللجنين^{32،33،34،35}. وللأسف، تعاني الأطياف أحادية الأبعاد من تداخل الإشارات، الذي يمكن أن يقوض بشكل خطير جهود تكامل الإشارات. وقد استخدمت الإصدارات الكمية من HSQC (التماسك الكمومي واحد Heteronuclear) ، Q -HSQC (الكمية -- Heteronuclear واحد التماسك الكم) ، لفهم هيكل اللجنين بشكل أفضل ، وتوفير معلومات مفيدة حول الروابط الداخلية. ومع ذلك، فإنها لا يمكن أن تستخدم بالكامل لتحديد مختلف المباني وحدات^13،36،37 كميا.

للتغلب على القضايا المرتبطة NMR أحادية و ثنائية الأبعاد، تم النظر في اشتقاق الركيزة. ومن مزايا هذا النهج أنه يمكن إدخال تسميات محددة داخل الجزيئات الكبيرة المعقدة ولا ينتج أي تداخل طيفي عن المذيب الذي يتم فيه إذابة الركائز المسماة¹. وكان فيركاد الرائد في هذا المجال، حيث أجرى ³¹تحليلا ل NMR للمشتقات الفوسفورية ومشتقات الفحم والمركبات ذات الصلة^38. وفي منشورها، تم إجراء فحص لواشف مختلفة تحتوي على الفوسفور (فوسفولان)، وسجل التحول الكيميائي للمركبات الأخرى المسماة. قدم فريق Argyropoulos لأول مرة اشتقاق للتحليل الكمي والنوعي لمجموعات الهيدروكسي في اللجنين في عام 1991. بعد دراسة اشتقاق مركبات نموذج اللجنين باستخدام الكواشف المحتوية على الفوسفور ، مهدت مجموعته الطريق لواحدة من أكثر التقنيات استخداما يوميا في كيمياء اللجنين ، ³¹تحليل P NMR^{39،40،41،42،43}. من بين الفوسفولات المختلفة التي تم فحصها ، وصل أرجيروبولوس إلى استخدام 2-chloro-4،4،5،5-tetramethyl-1،3-2-dioxaphospholane (TMDP) باعتباره الأنسب لإجراء تحليل اللجنين⁴⁴. يتفاعل TMDP بشكل انتقائي مع مجموعات الهيدروكسي مما يسبب التكوين الكمي للمشتقات المحتوية على الفوسفور التي تتميز بتحولات كيميائية محددة ³¹P NMR (الشكل 5).

الشكل 5: اللجنين والتانين الكيمياء الفوسفيتيلية. يتم وضع العلامات على مجموعات اللجنين والتانين labile H من خلال رد الفعل في الموقع. وتتميز البوليفينول المسمى من قبل ^{محددة 31}P NMR العصابات المقابلة لنوع مختلف من المجموعات الهيدروكسي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

يتم تنفيذ اشتقاق العينة في خليط البيريدين / الكلوروفورم (1.6:1) ؛ ينتج هذا الاختيار عن تقييم دقيق. البيريدين له ميزتين. أولا، اختيار المذيبات التي تتميز معلمة هيلدبراند من حوالي 22.1 MPa^1/2 يبسط ويضخم اللجنين solubilization⁴⁵. وبالتالي، فإن إضافة البيريدين كمذيب، الذي تساوي معلمة هيلدبراند 21.7، هو الأمثل. ثانيا، يصاحب تفاعل TMDP مع مجموعات الهيدروكسي تشكيل حمض الهيدروكلوريك (HCl) كمنتج ثانوي مع ما يصاحب ذلك من آثار سلبية تجاه التكوين السهل لمشتقات اللجنين فوسفولان. لهذا السبب، HCl الناتجة يحتاج إلى تحييد. عندما تكون موجودة في فائض كبير، والأساسية من البيريدين، بالنسبة لMDP، يسمح لتحييد HCl (عن طريق تشكيل هيدروكلوريد البيريدين).

ويستند استخدام النظام الموصى به البيريدين / الكلوروفورم المذيبات الثنائية deuterated على ثلاثة أسباب. أولا، يفضل حل العينة. ثانيا، بما أن هيدروكلوريد البيريدين قابل للذوبان في الكلوروفورم، فإنه يمكن أن يمنع هطول الأمطار وتدهور الطيف النهائي. ثالثا، يتم اختيار الكلوروفورم المشوه للإشارة المفردة الفريدة، مما يسمح بتأمين مطياف NMR أثناء عملية الاستحواذ. يتم تنفيذ اشتقاق العينة في وجود معيار داخلي. وبهذه الطريقة، عندما يتم اشتقاق العينة والمعيار، فإن مقارنة تكاملات قمم العينة والمعيار تسمح بتقدير كمي للكمية لكل نوع من مجموعات الهيدروكسي الموجودة. وقد اعتبرت مركبات مختلفة كمقاييس داخلية. وتتميز هذه المركبات من قبل مجموعة هيدروكسي واحد لكل جزيء، وتقدم إشارة حادة واحدة في الطيف ³¹P NMR بعد الاشتقاق. يجب أن يتم اختيار المعيار بعناية. وينبغي ألا تتداخل إشاراته مع إشارات العينة المشتقة. كان الكوليسترول يستخدم على نطاق واسع خلال الأيام الأولى. ومع ذلك، فإن التداخل الجزئي مع الإشارات الناشئة عن مجموعة الهيدروكسي اليفالي يحد من استخدامه. للتحليل الروتيني، يفضل الحلول القياسية الداخلية ل N-هيدروكسي-5-نوربورن-2,3-ديكاربوكسيميد (NHND). ومع ذلك، بسبب عدم الاستقرار NHND، يمكن تخزين حلولها القياسية فقط لبضعة أيام⁴⁶.

مخطط التدفق التالي (الشكل 6) يحدد البروتوكول التجريبي بأكمله لإجراء تحليل ³¹P NMR للجنيه والعفص.

الشكل 6: إجراء تحليل ³¹P NMR من lignins والعفص. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

1. عينة المعالجة المسبقة

1. الجافة على aliquot (حوالي 100 ملغ) من التحليل (عينة اللجنين أو التانين) بين عشية وضحاها في فرن فراغ تعيين في 40 درجة مئوية.
   ملاحظة: هناك حاجة إلى اهتمام خاص على اختيار درجة الحرارة لأن درجات الحرارة أعلى من 40 درجة مئوية قد تغير كيميائيا بنية حساسة من البوليفينول فحصها.
2. بعد التجفيف، نقل العينة بسرعة إلى مزيل كبريتات الكالسيوم اللامائية حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة. هذه الخطوة إلزامية لتجنب العينة امتصاص الرطوبة من البيئة.

2. إعداد محلول المذيبات

1. إعداد خليط مذيبات الكلوروفورم البيريدين/deuterated في قارورة عينة 20 مل عن طريق خلط البيريدين اللامائية والكلوروفورم deuterated في 1.6/1 (v/v) نسبة.
   تنبيه: انتبه أثناء التلاعب بالبيريدين والكلوروفورم المشوه. هذه المركبات قابلة للاشتعال، ضارة، وسامة. إعداد واستخدام الحل في غطاء الدخان جيد التهوية باستخدام قفازات مناسبة.
2. إضافة 5-8 غرام من المنخلات الجزيئية 5A المنشط جيدا والمجففة في الكريات 3.2 ملم لإزالة آثار المياه. بالإضافة إلى ذلك ، يوصى باستخدام غطاء الحاجز لمنع ملامسة الهواء وتلوث الرطوبة في نظام المذيبات. تخزين الحل المعد في الظلام.

3. إعداد الحل المعياري الداخلي (IS)

1. في قارورة Erlenmeyer 2 مل، قم بإعداد محلول 0.1 M من الكروم (III) أسيتيليستونات (حوالي 10 ملغ) ومعيار داخلي (حوالي 35.8 ملغ من NHND أو 77.3 ملغ من الكوليسترول) في محلول المذيبات الذي تم إعداده مسبقا.
   تنبيه: الكروم (III) أسيتيليستونات ضار; أثناء التلاعب به ، وارتداء قفازات مناسبة.
2. سجل الوزن الدقيق ل IS المضافة في حل IS.
3. نقل حل IS في قارورة مجهزة بغطاء مختوم يحتوي على منخل الجزيئية المنشطة (انظر النقطة 2.2) وتخزينها في الظلام في 40 درجة مئوية.

4. NMR إعداد حل عينة

1. تزن بدقة ~ 30 ملغ من عينة في قارورة 2 مل مجهزة شريط اثارة. ختم القارورة مع غطاء الحاجز.
2. إضافة 0.5 مل من محلول نظام المذيبات إلى قارورة العينة.
3. نقل 100 ميكرولتر من حل IS في قارورة العينة عبر micropipette. تحريك مغناطيسيا التشتت الناتج (500 دورة في الدقيقة) حتى يذوب كل اللجنين أو التانين، مما يؤدي إلى حل واضح.
   ملاحظة: نظرا لأن اكتمال عملية التشحيم للعينة أمر حتمي، فقد تستغرق هذه الخطوة ما يصل إلى 12 ساعة.
4. نقل 0.1 مل من TMDP إلى الحل عينة. ضع العينة تحت التحريك المغناطيسي القوي. إبقاء الحل عينة مختومة. استخدام TMDP في غطاء الدخان جيدة التهوية في حين يرتدي قفازات مناسبة.
   تنبيه: TMDP وأبخرتها هي تآكل، ضارة، وتتفاعل بسرعة مع الماء.
   ملاحظة: يرجع تكوين الترسب الأصفر إلى آثار المياه في العينة أو محلول البيريدين /الكلوروفورم. في مثل هذه الحالة، يجب تكرار الإجراء عن طريق ضمان تجنب جميع التلوث المحتمل للرطوبة.
5. نقل الحل عينة في أنبوب NMR باستخدام ماصة باستور.

5. تحليل NMR

1. تحميل الأنبوب في أداة NMR. ويحتاج المطياف المستخدم لإجراء هذا التحليل إلى مسبار عريض النطاق.
2. إصلاح المعلمات التجريبية وفقا للإعداد الموضح في الجدول 1¹.

الجدول 1: بارامترات تجريبية لتسجيل ^{31 أطياف}P NMR من الليجنيات المشتقة أو العفص.

3. تعيين تردد مطياف باستخدام تردد الرنين من الكلوروفورم deuterated، شيم العينة وضبط مطياف. ثم ابدأ عملية الاستحواذ.

6. معالجة الطيف وتحليله

1. معالجة ³¹P NMR البيانات الخام من قبل برنامج قياسي مناسب وفقا للخطوات التالية.
   1. تنفيذ تحويل فورييه.
   2. ضبط المرحلة حسب تصحيح المرحلة اليدوية (معالجة | | تصحيح المرحلة تصحيح يدوي).
   3. تصحيح الأساس يدويا، بعناية وضع نقطة الصفر (معالجة | | الأساس تصحيح خط الأساس متعدد النقاط).
2. معايرة الإشارة.
   1. تعيين إشارة للمياه phosphitylated في قيمة التحول الكيميائي من 132.2 جزء في المليون (تحليل | | المرجعية المرجع).
      ملاحظة: وجود ^{إشارة 31}P حادة في 175 جزء في المليون بسبب الزائدة TMDP. ويضمن وجودها اشتقاق العينة بالكامل. إذا كانت هذه الذروة غائبة، يحتاج المرء إلى إعادة النظر في الإجراء بأكمله من خلال توفير عينة شاملة وتجفيف المذيبات وإضافة المزيد من TMDP. وبمجرد ضمان ذلك، يتم تكبير الطيف في النطاق الطيفي 132 إلى حوالي 150 دورة في الدقيقة(الشكل 7).

الشكل 7: تحقق من وجود فائض من TMDP: إذا كان يمكن رؤيته، اشتقاق العينة كاملة. ويمكن بعد ذلك تحليل الأطياف. للقيام بذلك التكبير في النطاق الطيفي بين 155 و 132 في الدقيقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

3. تكامل
   1. تطبيع التكامل عن طريق وضع المعيار الداخلي إلى 1.0 (انقر على الذروة | تحرير | المتكاملة تطبيع: 1.00). إجراء تكامل الطيف وفقا للتحولات الكيميائية المبلغ عنها في الجداول التالية. استخدم الجدول 2 للجنيهات والجدول 3 للتانين.

الجدول 2: ³¹P NMR التحولات الكيميائية لمجموعات اللجنين phosphitylated OH.

الجدول 3: ³¹P NMR التحول الكيميائي لمجموعات التانين phosphitylated OH.

ملاحظة: باستخدام برمجيات المعالجة الطيفية القياسية، يمكن تحديد مناطق محددة مسبقا للتحول الكيميائي لكي يتم دمجها. هذه الفرصة مفيدة عندما يكون هناك العديد من الأطياف التي يتعين معالجتها.

7. التحديد الكمي للمجموعة الوظيفية

1. حساب تركيز حل IS.
   
2. حساب المبلغ المكافئ للإشارة المحددة:
   
   

ويمكن تطبيق البروتوكول الموصوف على حد سواء لتحليل lignins والعفص. في كيمياء اللجنين ، هذه الطريقة أساسية لأنها تسمح باكتشاف وتحديد كمية الأنواع المختلفة من مجموعات الهيدروكسي. ويبين الشكل 8A-D أمثلة على 31أطياف P NMR من الليغنيتين والعفص المكتسبة باستخدام مطيافات تعمل بترددات مختلفة. وسجل الطيف المبين في الشكل 8 ألف باستخدام مطياف NMR MHz 300، بينما سجل الشكل 8D باستخدام جهاز NMR 700 ميغاهرتز.

الشكل 8:الطيف الكمي 31P NMR من (A) الخشب اللين كرافت ليجنين (الطيف المسجل مع مطياف MHz 300 على 30.8 ملغ من اللجنين)، (B) حمض الليجنوسلفونيك الخشب اللين (الطيف المسجل مع مطياف 300 ميغاهرتز على 30.1 ملغ من اللجنين بعد الحفاظ على lignosulfonate لحمض الليغنوسلفونيك)، (C) أكاسيا تانين (الطيف المسجل مع مطياف 300 ميغاهرتز على عينة 30.3 ملغ) و (D) الخشب اللين كرافت ليجنين (الطيف المسجل مع مطياف 700 ميغاهرتز على 7.2 ملغ من اللجنين). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

وقد سجلت هذه الأطياف بعناية وعالجت يدويا. الإشارات النموذجية لaliphatic (150-145 صفحة في الدقيقة) ، العطرية (145-137 صفحة في الدقيقة) ، و carboxylic (136-134 صفحة في الدقيقة) مجموعات هيدروكسي يتم حلها بشكل جيد للغاية وعلى هذا النحو متكاملة بسهولة. إذا تم فتح النافذة الطيفية (من 95 إلى 190 ppm، الشكل 8)،تظهر ثلاث قمم حادة وقوية (175 و144 و132 ppm). ويرجع ذلك إلى فائض TMDP ، المعيار الداخلي (الكوليسترول أو NHND) ، وHedorxylated - TMDP (الناجمة عن آثار المياه) ، على التوالي.

وعلى النقيض من الكرافت واللجنين الأورغنوسوم، فإن الليغنوسلفونات غير قابلة للذوبان في خليط البيريدين/الكلوروفورم. للحصول على 31P NMR الطيف موثوق بها، الذوبان إلزامي. للتغلب على هذه المشكلة، يمكن تحويل الليغنوسلفونات إلى الأحماض lignosulfonic المقابلة قبل الاشتقاق. علاج حلول lignosulfonate مع الأحماض القوية (أي حمض الكبريتيك)، أو حمض تبادل الراتنجات (على سبيل المثال، Dowex 1H، مبادل حمض cation قوية) يدفع تحويل جميع مجموعات السلفونات في أشكالها الحمضية. يمكن إزالة المنتجات الناتجة من المحلول الحمضي باستخدام راتنجات امتزازية انتقائية (XAD-7 ، وهو مادة ماصة قطبية تستخدم لعزل المركبات التي تتميز بالأوزان الجزيئية تصل إلى 60،000 u.m.a) التي تم تحليلها باستخدام هذا البروتوكول. ويبين الشكل 8B الطيف الكمي 31P NMR من حمض الليغنوسلفونيك المشتق من TMDP. حتى في هذه الحالة ، فإن الإشارات المختلفة لمجموعات الهيدروكسي واضحة. ويبين الشكل 8C طيفا كميا نموذجيا قدره 31P NMR لعينة تانين مشتقة باستخدام TMDP. إشارة مميزة من مختلف ALIPHATIC OH (الحلقة C)، بيروغالول، ووحدات كاتيكول في الحلقة B ووحدات في حلقة A مرئية بشكل جيد.

كلوديا Crestini وديميتريس S Argyropoulos ضمان أن جميع المؤلفين (C.C., N.P., وD.S.A.) ليس لديهم تضارب في المصالح.