يوضح هذا البروتوكول طريقة جديدة لتطبيق العلاجات الجينية على مجموعات فرعية من الخلايا في الفئران حديثي الولادة في سن ما بعد الولادة من 5 إلى 10 أيام عن طريق حقن معدل كيميائي وراثي تقدمي في القشرة الحركية الجسدية و Cre recombinase قابل للنقل إلى الوراء في الحبل الشوكي العنقي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
استهداف القناة القشرية الشوكية في الفئران الوليدية باستخدام ناقل فيروسي مزدوج باستخدام جراحة الدماغ والعمود الفقري المشتركة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تعد معالجة العقبات التي تقيد البحث على الفئران حديثي الولادة بنجاح أمرا مهما لدراسة الاختلافات في النتائج التي تظهر في إصابات الحبل الشوكي للأطفال (SCIs) مقارنة باصابات النخاع الشوكي للبالغين. بالإضافة إلى ذلك ، قد يكون إدخال العلاجات بشكل موثوق في الخلايا المستهدفة للجهاز العصبي المركزي (CNS) أمرا صعبا ، ويمكن أن تؤدي عدم الدقة إلى الإضرار بفعالية الدراسة أو العلاج. يجمع هذا البروتوكول بين تقنية النواقل الفيروسية وتقنية جراحية جديدة لإدخال العلاجات الجينية بدقة في الفئران الوليدية في يوم ما بعد الولادة 5. هنا ، يتم إدخال فيروس مصمم للنقل الرجعي (retroAAV2) من Cre في النهايات المحورية للخلايا العصبية القشرية الشوكية في الحبل الشوكي ، حيث يتم نقله لاحقا إلى أجسام الخلايا. ثم يتم حقن مستقبل مصمم ذو اتجاه مقلوب مزدوج (DIO) يتم تنشيطه حصريا بواسطة فيروس (أدوية) مصمم (DREADD) في القشرة الحركية الجسدية للدماغ. تعزز تقنية العدوى المزدوجة هذه التعبير عن DREADDs فقط في الخلايا العصبية القشرية الشوكية المصابة (CST). وبالتالي ، فإن الحقن المشترك المتزامن للقشرة الحركية الجسدية ومحطات CST العنقية هو طريقة صالحة لدراسة التعديل الكيميائي الجيني للتعافي بعد نماذج اصابات النخاع الشوكي العنقي في الفئران الوليدية.
المقدمة
في حين أن اصابات النخاع الشوكي نادرة الحدوث نسبيا بين الأطفال ، إلا أنها مؤلمة بشكل خاص وتسبب إعاقة دائمة تتطلب بصيرة لوجستية هائلة. علاوة على ذلك ، يتم تصنيف نسبة أعلى من اصابات النخاع الشوكي للأطفال على أنها عنق الرحم وكاملة مقارنة بالسكان البالغين 1,2. السمة المميزة لأنواع الثدييات هي أن حديثي الولادة يتعافون بشكل ملحوظ من اصابات النخاع الشوكي بشكل أفضل من البالغين ، وهذا يوفر فرصة لتقييم آليات القيادة للتعافي في السكان الأصغر سنا3،4،5. على الرغم من ذلك ، هناك عدد أقل من الدراسات متعددة الوسائط التي تتناول أبحاث ال....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على جميع الإجراءات الجراحية ورعاية الحيوانات التالية من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان بجامعة تمبل. البروتوكول الموصوف هو جراحة البقاء على قيد الحياة ، وتم قتل الحيوانات في النهاية عن طريق الحقن داخل الصفاق من 100 ملغم / كغم من بنتوباربيتال الصوديوم عند الانتهاء من نقاطها الزمنية.
1. التحضير قبل الجراحة
- تحضير ما لا يقل عن إبرتين زجاجيتين مسحوبتين للحقن الفيروسي باستخدام ماصات شعرية زجاجية 3.5 nL ؛ إبرة واحدة ل DREADD وإبرة واحدة ل rCre. كإجراء احترازي ، قم بإعداد 4-5 إبر في حالة كسرها أثناء الجراحة.
- باستخدام مقص مجهري ، قطع 1-2 مم من الزجاج الزائد من الإبرة.
- لكل إبرة ، ضعها عند 30 درجة ، استخدم ما....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يجب أن يؤدي الحقن والنقل الناجح للناقل الفيروسي إلى نقل الخلايا العصبية أحادية الجانب في الحبل الشوكي والقشرة الحركية. يوضح الشكل 4 وضع العلامات على الخلايا العصبية من الطبقة V CST في القشرة الحركية لقسم إكليلي في الدماغ يعبر عن حقن Cre-dependentent-DREADDs-mCherry بالاشتراك مع حقن العمود الفقري المقابل ل rCre. كانت المقاطع ملطخة بالأجسام المضادة dsRed.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يعد التعديل الجيني المستحث لنشاط الدماغ باستخدام المعدلات الكيميائية الوراثية القابلة للحقن أداة قوية في دراسة الآليات المختلفة التي تكمن وراء التعافي من اصابات النخاع الشوكي. تزداد دقة استهداف المستقبلات المقترنة بالبروتين G (DREADDs) عند النظر في أن تتبع التألق يتحقق من الدقة التشريحية في علم الأنسجة. تناقش هذه الورقة طريقة موثوقة لاستكشاف ما إذا كان تثبيط أو تحفيز مسارات عصبية مختارة (إما باستخدام DREADDS المثيرة أو المثبطة) يؤدي إلى تعزيز تجديد المحور العصبي أو إنبات34,35
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
تم تمويل هذا العمل من خلال منحة زمالة من مستشفيات شرينرز للأطفال SHC-84706.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| # 11 شفرات مشرط | Roboz | RS-9801-11 | للاستخدام مع المشرط. |
| # 10 شفرات مشرط | Roboz | RS-9801-10 | للاستخدام مع المشرط. |
| 1 مل محاقن | بيكتون وديكنسون وشركاه | 309659 | للتخدير حقن SC وبلعة السوائل |
| 4.0 خياطة حريرية | Ethicon | 771-683G | لإغلاق الجلد |
| 4.0 خياطة Chromic | Catgut DemeTECH | NN374-16 | لإعادة ربط العضلات أثناء الإغلاق. |
| 48000 Micropipette Beveler | World Precision Instruments | 32416 | تستخدم لشطبة أطراف الأنابيب الزجاجية الشعرية المسحوبة لتشكيل إبر زجاجية وظيفية. |
| 5٪ محلول اليود | منتجات بوردو LP | L01020-08 | للاستخدام في تعقيم موقع الجراحة. |
| 70٪ إيثانول | N / A | N / A | لتعقيم الإبر الزجاجية المعدة حديثا ، النماذج الحيوانية أثناء التحضير الجراحي |
| الكيتامين (Ketaset) | Zoetis | 240048 | لإبقاء في مستوى الوعي الصحيح أثناء الجراحة. |
| معقم حبة | CellPoint | 5-1450 | لتعقيم الأدوات الجراحية بالحرارة. |
| ميزان رقمي | Okaus | REV.005 | لوزن أثناء التحضير الجراحي. |
| إبرة مرنة | أدوات الدقة العالمية | MF34G-5 | لتنظيف الإبر الزجاجية وتحميل الزيت الأحمر في الإبر الزجاجية. |
| أنابيب الشعرية الزجاجية | أدوات الدقة العالمية | 4878 | للإبر الزجاجية المسحوبة - يجب أن تكون مصممة لحاقن النانولتر. |
| Hemostats | Roboz | RS-7231 | للاستخدام العام في الجراحة. |
| ملقط منحني متوسط النقطة | Roboz | RS-5136 | للاستخدام العام في الجراحة. |
| معالج دقيق بمقياس ورنية | Kanetec | N / A | للاستهداف الدقيق أثناء الجراحة. |
| مقص دقيق | Roboz | RS-5621 | لقطع الهمسات الزجاجية من الأنابيب الشعرية الزجاجية المسحوبة حديثا. |
| المختبر القياسي أداة التجسيم | Stoelting | 51600 | لتثبيت حامل التاكسي التجسيمي لحديثي الولادة في مكانه |
| معيار المختبر مع الماوس والفأر محول حديثي الولادة | 51615 | لتثبيت جمجمة حديثي الولادة أثناء جراحة الجمجمة وحقن العمود الفقري مجهر | |
| بمقياس الضوء والورنية Ocular | Leitz Wetzlar | N / A | يستخدم لتصور وقياس شطف الأنابيب الزجاجية المسحوبة في إبر زجاجية وظيفية. |
| تحكم مضخة الحقن | الدقيقة العالمية للأدوات | الدقيقة 62403 | للتحكم في معدل الحقن. |
| Nanoliter 2000 حاقن رأس المضخة | العالمية للأدوات الدقيقة | 500150 | لتحميل وحقن الفيروس بطريقة خاضعة للرقابة. |
| مجتذب إبرة | Narishige | PC-100 | لتسخين وتفكيك الأنابيب الشعرية الزجاجية لتشكيل إبر زجاجية. |
| pAAV-CMV-scCre | Wu lab | Cre البلازميد | |
| pAAV-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry (البلازميد # 44361) | بريان روث مختبر من خلال Addgene | DREADD البلازميد | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | للمساعدة في تحميل الفيروس في الحاقن النانوي. |
| إبر PrecisionGlide (25 جم × 5/8) | 305122 Becton و Dickinson and Company | للاستخدام مع المحاقن سعة 1 مل و 10 مل للسماح بحقن النموذج الحيواني. | |
| ملقط أسنان الفئران | Roboz | RS-5152 | لإمساك العمليات الشائكة. |
| زيت أحمر | N / A | N / A | لتوفير واجهة لتصور الفيروس الذي يدخل الأنسجة أثناء الحقن. |
| مباعدات | Roboz | RS-6510 | لفتح الجرح الجراحي. |
| Rongeurs | Roboz | RS-8300 | لإزالة العضلات من العمود الفقري أثناء الجراحة. |
| مقبض شفرة مشرط | Roboz | RS-9843 | لتقطيع الجلد المفتوح ووسادة الدهون لنموذج أثناء الجراحة. |
| مقص | Roboz | RS-5980 | للاستخدام العام في الجراحة. |
| ملقط إزالة الدبابيس | كينت Scientific | INS750347 | لإزالة الدبابيس ، يجب تطبيقها بشكل غير صحيح. |
| قماش معقم | Phenix Research Products | BP-989 | لتوفير سطح معقم للعملية. |
| أدوات تطبيق معقمة من القطن | Puritan | 806-WC | لامتصاص الدم في الجرح الجراحي مع الحفاظ على العقم. |
| شاش معقم | Covidien | 2146 | لتنظيف المنطقة الجراحية والأدوات الجراحية مع الحفاظ على العقم. |
| Sterile Saline | Baxter Healthcare | Corporation 281324 | للاستخدام في تنقية الدم واستبدال السوائل بعد الجراحة. |
| قفازات جراحية | N / A | N / A | للاستخدام من قبل الجراح للحفاظ على المجال المعقم أثناء الجراحة. |
| وسادة التسخين الجراحية | N / A | N / A | للحفاظ على درجة حرارة جسم النموذج الحيواني أثناء الجراحة. |
| المجهر الجراحي | N / A | N / A | لتحسين الرؤية للجرح الجراحي. |
| دباسة جراحية | كينت INS750546 العلمية | لتطبيق الدبابيس. | |
| وسادة تسخين الحمل الحراري للمياه | شركة باكستر للرعاية الصحية | L1K018 | للاستخدام في منطقة التعافي بعد العملية للحفاظ على درجة حرارة جسم الفاقد للوعي. |
| خطافات مرجحة | N / A | N / A | لفتح الجرح الجراحي. |
| ضمادة سائلة | NewSkin | 985838 | للتطبيق على طول الغرز بعد الجراحة وتشجيع التئام الجروح |
| مصباح قفص سلكي | ZooMed | LF10EC | لمساعدة على التعافي من التخدير والاحتفاظ بدرجة حرارة الجسم الدافئة بشكل طبيعي |
المراجع
- Parent, S., Mac-Thiong, J., Roy-Beaudry, M., Sosa, J. F., Labelle, H. Spinal cord injury in the pediatric population: A systematic review of the literature. Journal of Neurotrauma. 28 (8), 1515-1524 (2011).
- Vitale, M. G., Goss, J. M., Matsumoto, H., Roye, D. P.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
