Method Article

توليد وصيانة وتوصيف العضيات المعوية والقولونية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات

DOI:

10.3791/62721

⸱

July 9th, 2021

 ,  ,  , 
1Department of Regenerative Medicine and Cell Biology, Medical University of South Carolina

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، يتم وصف طرق مفصلة لتوليد والحفاظ على وتوصيف العضيات المعوية الدقيقة والقولونية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات. تم تصميم هذه الطرق لتحسين قابلية التكاثر وتوسيع قابلية التوسع وتقليل وقت العمل المطلوب لطلاء ومرور العضيات.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصف المواصفات الإقليمية المعوية عملية يتم من خلالها نقل التشكل والوظيفة الفريدة إلى مناطق محددة من الجهاز الهضمي النامي (GI). يتم تشغيل المواصفات الإقليمية في الأمعاء من خلال مسارات نمو متعددة ، بما في ذلك مسار البروتين المورفوجيني للعظام (BMP). بناء على المواصفات الإقليمية العادية ، تم تطوير طريقة لتوليد عضيات القولون البشري (HCOs) من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) ، والتي تشمل الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hES) والخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs). تحريض لمدة ثلاثة أيام لإشارات BMP يضع أنماط كافية لثقافات أنبوب الأمعاء الوسطى / الخلفية في بروتين خاص غني بالتسلسل الغني ب AT 2 (SATB2) - يعبر عن HCOs التي تحتوي على جميع أنواع الخلايا الظهارية الرئيسية الموجودة في القولون البشري بالإضافة إلى الخلايا الوسيطة النامية المشتركة. أدى إغفال BMP (أو إضافة مثبط BMP NOGGIN) خلال فترة الزخرفة الحرجة هذه إلى تكوين عضيات معوية بشرية (HIOs). تشبه HIOs و HCOs شكليا وجزيئيا الأمعاء الدقيقة والقولون النامية للإنسان ، على التوالي. على الرغم من فائدة HIOs و HCOs لدراسة نمو الأمعاء البشرية ، فإن إنشاء HIOs و HCOs يمثل تحديا. تقدم هذه الورقة طرقا لتوليد والحفاظ على وتوصيف HIOs و HCOs. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توفير الخطوات الحاسمة في البروتوكول وتوصيات استكشاف الأخطاء وإصلاحها.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

من الصعب دراسة نمو القولون البشري بسبب القيود المفروضة على استخدام أنسجة الجنين البشري. كانت النماذج الحيوانية لا تقدر بثمن واستخدمت تاريخيا للأساليب الجينية في الفئران لدراسة نمو الأمعاء. ومع ذلك ، فإن الاختلافات بين نمو الفأر والأمعاء البشرية تحد من قابلية تطبيق الفئران كنظام نموذجي. على سبيل المثال ، على الرغم من أن تكوين القبو في الأمعاء الدقيقة والقولون للفئران يحدث بعد الولادة ، إلا أن البشر يولدون بخبايا كاملةالتكوين 1. علاوة على ذلك ، تحتوي الأمعاء الدقيقة والقولون البشري على أنواع خلايا غير موجودة في الفئران ، بما في ذلك خلايا الغدد الصماء المعوية التي تعبر عن الموتيلين (MLN) في الأمعاءالدقيقة 2 وخلايا الكأس التي تعبر عن الميوسين 5B (MUC5B) في القولون3،4. لهذا السبب ، من المهم أن يكون لديك نظام زراعة خلايا يقوم بنمذجة الأحداث الجزيئية الديناميكية التي تحدد المراحل المبكرة من تطور القولون بدقة. لذلك ، فإن توجيه hPSCs لتوليد خلايا ذات خصائص القولون يوفر نموذجا قويا لدراسة تطور القولون البشري.

تم تطوير بروتوكولات لتسهيل التكوينالقابل للتكرار 5 والمتزامن والفعال للعضيات الشبيهةبالأمعاء 6 والعضويات الشبيهة بالقولون7 من hPSCs. تستخدم هذه البروتوكولات إجراء تمايز تدريجي يحاكي تطور الأمعاء والقولون الجنينية (الشكل 1). أولا ، يتم إنشاء الأديم الباطن النهائي من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات عن طريق العلاج باستخدام Activin A ، وهو محاكي عقدي. يؤدي تعرض الأديم الباطن النهائي لمستويات عالية من WNT وعامل نمو الخلايا الليفية (FGF) إلى التشكل في CDX2 + كرويات أنبوب المعى الأوسط / الخلفي. ثم يتم تضمين الأمعاء الوسطى / الأمعاء الكروية في المصفوفة خارج الخلية (ECM) ويتم تصميمها إما في HIOs أو HCOs من خلال معالجة عابرة لإشارات BMP. يؤدي تثبيط إشارات BMP باستخدام NOGGIN أو إضافة وسط النمو وحده إلى تكوين HIOs ، والتي تشبه الأمعاء الدقيقة القريبة من الإنسان.

من خلال تنشيط إشارات BMP باستخدام BMP2 ، يتم تصميم الأمعاء الوسطى / الخلفية في HCOs ، والتي تحتفظ بالزخرفة في الظهارة واللحمةالمتوسطة 7. تحتوي HCOs على خلايا كأس غنية بالقولون والتي تعبر عن MUC5B وهي مؤهلة لتوليد خلايا الغدد الصم المعوية الشبيهة بالأنسولين 5 (INSL5) الخاصة بالقولون. يعبر اللحمة المتوسطة المعزولة من HCOs عن الوسيط A13 (HOXA13) و HOXD13 ، والتي يتم التعبير عنها أيضا في اللحمة المتوسطة للقولون الأوليةالبشرية 8. من المهم أن تتذكر أن خطوة الزخرفة تحدث خلال الأيام 7-10 من بروتوكول التمايز. هذه الفترة التي تبلغ ثلاثة أيام كافية للحث على زخرفة القولون التي يتم الحفاظ عليها بعد الثقافة الممتدة في المختبر .

البروتوكولات الموضحة أدناه مخصصة للباحثين الذين هم على دراية بثقافة hPSC الخالية من المغذيات. بالنسبة للباحثين الذين ليسوا على دراية بهذا النوع من ثقافة hPSC ، يوصى بدورة تدريبية حول hPSCs مثل تلك التي تقدمها Stem Cells Technologies أو مرفق الخلايا الجذعية متعدد القدرات (PSCF) في مستشفى سينسيناتي للأطفال. تعد جودة hPSCs البادئة أمرا بالغ الأهمية ويمكن أن تؤثر على جميع خطوات المصب. سيبدأ البروتوكول التالي ب hPSCs التي نمت لمدة 4 أيام وجاهزة للانقسام.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. توليد العضيات المعوية والقولونية البشرية

  1. تحضير الألواح المطلية ب ECM
    1. أضف 50 مل من وسط DMEM البارد في أنبوب مخروطي سعة 50 مل.
    2. قم بإزالة كمية من 4x ECM المؤهل hESC (انظر جدول المواد) من الفريزر -80 درجة مئوية وقم بإذابة الثلج.
      ملاحظة: ارجع إلى شهادة تحليل المنتج لتحديد حجم ECM المؤهل ESC المطلوب لإعداد مخزون 4x.
    3. إذا لم يتم إذابة ECM المؤهل من hESC بالكامل ، فخذ 750 ميكرولتر من DMEM من الأنبوب المخروطي سعة 50 مل واخلطه مع ECM.
    4. انقل خليط ECM المؤهل من DMEM / hESC إلى الأنبوب المخروطي سعة 50 مل مع DMEM واخلطه جيدا. أضف 0.5 مل لكل بئر في كل من ألواح زراعة الخلايا المكونة من 4 × 24 بئر.
    5. رج الألواح لتوزيع ECM بالتساوي في جميع أنحاء البئر لضمان تغطية السطح بالكامل. باستخدام البارافيلم ، أغلق الألواح المطلية ب ECM واتركها في درجة حرارة الغرفة في خزانة السلامة الحيوية لمدة 1 ساعة على الأقل. قم بتخزين الأطباق المطلية ب ECM في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين أو حتى الحاجة.
  2. hPSCs طلاء أحادي الخلية
    1. ضع صفيحة 24 بئرا مطلية ب ECM داخل خزانة السلامة الحيوية لمدة 30 دقيقة للسماح لها بالوصول إلى درجة حرارة الغرفة.
    2. ضع mTeSR1 المتوسط الكامل ، ومحلول انفصال الخلايا ، و DMEM المتقدم داخل حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية واتركها تسخن لمدة 30 دقيقة.
    3. تحقق من أن hPSCs متقاء بنسبة 85٪ على الأقل مع الحد الأدنى من التمايز. قم بإزالة أي خلايا متمايزة إذا لزم الأمر.
    4. قم بإعداد وسط الطلاء في أنبوب مخروطي سعة 50 مل على النحو التالي: 13 مل من mTeSR1 و 13 ميكرولتر من مثبط بروتين كيناز Y-27632 المرتبط ب Rho (ROCK) 10 مليمتر.
      ملاحظة: Y-27632 يمنع anoikis ويزيد من بقاء الخلايا المفردة.
    5. لجمع الخلايا من صفيحة مكونة من 6 آبار ، قم بشفط الوسط من 3 إلى 4 آبار واغسلها مرة واحدة ب 2 مل من DMEM المتقدم لكل بئر.
    6. استنشق DMEM المتقدم وقم بتوزيع 1 مل من محلول تفكك الخلايا في كل بئر. احتضن اللوحة لمدة 5-7 دقائق داخل حاضنة 5٪ CO2 ، 37 درجة مئوية. تحقق تحت المجهر من أن الخلايا معلقة.
    7. افصل أي كتل متبقية من الخلايا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل 4-5 مرات باستخدام ماصة سعة 5 مل.
    8. أضف 2 مل من DMEM المتقدم في كل بئر، ثم قم برفع الماصة برفق لأعلى ولأسفل 4-5 مرات، ثم انقله إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. قم بتدوير الخلايا عند 300 × جم لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    9. استنشق الوسط من الأنبوب دون شفط حبيبات الخلية وأضف 6 مل من الوسط المحضر من mTeSR1 بالإضافة إلى مثبط الصخور. أعد تعليق الخلايا برفق عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل 3-4 مرات ثم انقل التعليق إلى باقي وسيط مثبط mTeSR1/ROCK داخل الأنبوب سعة 50 مل. قم بتعليق الخلايا بقوة 4-5 مرات وعد الخلايا باستخدام مقياس الدم.
    10. قم بشفط ECM من اللوحة المكونة من 24 بئرا قبل طلاء الخلايا مباشرة. أعد تعليق الخلايا مرة أخرى عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل 2-3 مرات وتوزيع 0.5 مل من تعليق الخلية في كل بئر.
      ملاحظة: يجب تحديد كثافة الطلاء المثلى من قبل المجري. هنا ، رقم الخلية الأمثل هو 80,000-200,000 خلية لكل بئر.
    11. قم بهز اللوحة برفق 3 مرات في اتجاه عقارب الساعة ، و 3 مرات عكس اتجاه عقارب الساعة ، و 3 مرات للأمام والخلف ، و 3 مرات جنبا إلى جنب لتفريق الخلايا بالتساوي.
    12. انقل اللوحة إلى حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 واحتضانها لمدة 24 ساعة.
      ملاحظة: لا تزعج اللوحة في الساعات القليلة الأولى لضمان التشتت المناسب للخلايا داخل الآبار.
    13. بعد 24 ساعة (الشكل 2 أ) ، استنشق الوسط المستهلك ، وأضف 0.5 مل لكل بئر من mTeSR1 ، واحتضن مرة أخرى عند 37 درجة مئوية ، و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 24 ساعة (الشكل 2 ب) ، ثم انتقل إلى الخطوة التالية.
  3. التمايز بين الأديم الباطن النهائي (DE) والخلايا الجذعية المزمنة
    1. في أنبوب مخروطي سعة 15 مل ، أضف 13 مل من وسط Activin Day 1 (انظر جدول المواد) ، و 13 ميكرولتر من 100 ميكروغرام / مل Activin A ، و 1.95 ميكرولتر من 100 ميكروغرام / مل BMP4. قم بتسخين الوسط في حمام مائي 37 درجة مئوية.
    2. استنشق وسط mTeSR1 من اللوحة المكونة من 24 بئرا وأضف 0.5 مل من وسط Activin Day 1 لكل بئر. ضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 واحتضانها لمدة 24 ساعة. افحص الخلايا بعد 24 ساعة.
      ملاحظة: يجب أن يكون موت الخلايا على نطاق واسع واضحا ، كما هو موضح في الشكل 2 ج. على الرغم من أن الطبقة الأحادية ستظهر متناثرة ، إلا أن مستعمرات الخلايا قد توسعت.
    3. قم بإعداد وسيط Activin Day 2 الكامل عن طريق إضافة 12.5 ميكرولتر من 100 ميكروغرام / مل Activin A إلى 12.5 مل من وسط Activin Day 2 في أنبوب مخروطي سعة 15 مل. ضع الأنبوب في حمام مائي 37 درجة مئوية.
    4. أخرج لوحة التمايز المكونة من 24 بئرا من حاضنة ثاني أكسيد الكربون2 وقم بإزالة الوسط المستهلك. قم بتوزيع 0.5 مل من وسط Activin Day 2 المسخن مسبقا لكل بئر وضع الطبق مرة أخرى داخل حاضنة ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 24 ساعة.
      ملاحظة: يجب توخي الحذر عند الاستغناء عن الوسيط. لا تقم بتوزيع الوسيط مباشرة في وسط البئر ، لأن هذا سيؤدي إلى فصل الخلايا في الطبقة الأحادية. قم بتوزيع الوسط بعناية أسفل جانب البئر. في اليوم التالي ، تتشكل طبقة أحادية من الخلايا مع موت الخلايا بشكل ضئيل. يجب أن تكون الخلايا الآن ~ 90 إلى 95٪ ملتقية (الشكل 2 د).
    5. قم بإعداد وسط Activin Day 3 الكامل عن طريق إضافة 12.5 ميكرولتر من 100 ميكروغرام / مل Activin A إلى 12.5 مل من وسط Activin Day 3 في أنبوب مخروطي سعة 15 مل. ضع الأنبوب في حمام مائي 37 درجة مئوية.
    6. قم بإزالة الوسط المستهلك وقم بتوزيع 0.5 مل من وسط Activin Day 3 لكل بئر.
      ملاحظة: يجب توخي الحذر عند الاستغناء عن الوسط. لا تقم بتوزيع الوسيط مباشرة في وسط البئر لأن هذا سيؤدي إلى فصل الخلايا في الطبقة الأحادية. قم بتوزيع الوسط بعناية أسفل جانب البئر. في اليوم التالي ، يجب أن تصل الطبقة الأحادية إلى التقاء كامل مع القليل من موت الخلايا أو معدوما في هذه المرحلة. لا تحاول توليد كرويات في منتصف المعى الخلفي إذا لم تكن الطبقة الأحادية متقاربة بعد 24 ساعة من إضافة وسط Activin Day 3. ارجع إلى الشكل 2E للحصول على التشكل المثالي للطبقة الأحادية DE قبل الشروع في توليد الأمعاء الكروية في منتصف الأمعاء الخلفية.
    7. قم بإجراء تلطيخ التألق المناعي (IF) للطبقة الأحادية للتعبير عن بروتين A2 صندوق الشوكة (FOXA2) ومنطقة تحديد الجنس Y (SRY) - عامل النسخ 17 (SOX17) عند تحسين تمايز DE.
  4. تمايز DE إلى كرويات منتصف الأمعاء الخلفية
    1. في أنبوب مخروطي سعة 50 مل ، أضف 25 مل من وسط الحث في منتصف الأمعاء الخلفية مع FGF4 (بدون CHIR99021) وضعه في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    2. لتحضير وسط الحث الكامل في منتصف المعاء الخلفي ، أضف 7.5 ميكرولتر من CHIR99021 بعد أن يصبح الوسط دافئا.
    3. قم بإزالة الوسط المستهلك ، وقم بتوزيع 0.5 مل من وسط الحث في منتصف الأمعاء الخلفية لكل بئر واحتضانه عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 24 ساعة.
    4. بعد حدوث تكثيف الخلايا داخل الطبقة الأحادية في اليوم التالي (الشكل 3 أ) ، استبدل الوسط المستهلك بوسط تحريض جديد في منتصف الأمعاء الخلفية وضع اللوحة مرة أخرى في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 24 ساعة.
      ملاحظة: ستكون الهياكل الأنبوبية ملحوظة بعد 48 ساعة من تحريض منتصف الأمعاء الخلفية ، كما هو موضح في الشكل 3 ب. ستبدأ الأمعاء الكروية في منتصف الأمعاء الخلفية في التبرعم من الطبقة الأحادية في اليوم 3 ، كما هو موضح في الشكل 3C.
    5. لتجنب التخلص من الكرويات العائمة أثناء تغيير الوسط ، انقل الوسط القديم إلى أنبوب سعة 15 مل وجهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 1 دقيقة. أعد تعليق الكرات في 12.5 مل من وسط الحث الطازج في منتصف الأمعاء الخلفية ، وأضف 0.5 مل لكل بئر في نفس اللوحة المكونة من 24 بئرا ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 24 ساعة.
    6. في اليوم 4 من تحريض الأمعاء الخلفية (الشكل 3 د) ، قم بحصاد الكرات الكروية العائمة من آبار الصفائح عن طريق جمع الوسط في أنبوب سعة 15 مل متبوعا بالطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 1 دقيقة. انتقل إلى الخطوة التالية لتضمين الأمعاء الكروية في منتصف الأمعاء الخلفية في ECM.
  5. طلاء ونقوش الأمعاء الكروية الوسطى / الخلفية في ECM
    1. قم بإذابة مصفوفة الغشاء القاعدي ECM عند 4 درجات مئوية طوال الليل قبل التضمين.
      ملاحظة: يختلف ECM هذا عن ECM المؤهل من hESC. يجب وضع ECM على الجليد ، ويمكن تقسيم الحجم المناسب من ECM إلى أنابيب طرد مركزي دقيق مبردة مسبقا سعة 1.5 مل على الجليد. يحتوي الجدول 1 على معلومات عن حجم ECM. تأكد من أن حجم ECM لا يقل عن 75٪ في القطرة التي سيتم تضمين الكرويات فيها.
    2. قم بتسخين طبق 24 بئرا في حاضنة 37 درجة مئوية.
    3. اجمع الكرات الكروية العائمة من جميع البئر ال 24 باستخدام ماصة سعة 1000 ميكرولتر وانقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. قم بتدوير الكرات عند 300 × جم لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. استنشق معظم الوسط ولكن اترك الحجم المطلوب للطلاء (الجدول 1).
    4. قم بإعداد 1000 ميكرولتر و200 ميكرولتر من أطراف الماصة عن طريق قص أطرافها. أخرج الطبق الدافئ مسبقا المكون من 24 بئرا.
    5. امزج الكرات العائمة ، وانقل الحجم المناسب إلى أنبوب ECM الموجود على الجليد ، ثم أعد تعليق الكرويات و ECM عن طريق سحب العينة لخلطها جيدا.
    6. خذ 65 ميكرولتر من خليط الكرويات و ECM مع أطراف الماصة المقطوعة 200 ميكرولتر وقم بتحميلها إلى وسط كل بئر في اللوحة المكونة من 24 بئرا. للتأكد من تكوين قطرة جيدة من ECM ، ارفع الماصة برفق وببطء أثناء توزيع الخليط.
      ملاحظة: لوحة 30-100 كروية لكل بئر.
    7. انقل اللوحة برفق إلى حاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 واحتضانها لمدة 5 دقائق.
    8. اقلب اللوحة رأسا على عقب واحتضنها لمدة 15-25 دقيقة ، مما سيساعد قطرات ECM على الحفاظ على هيكل يشبه القبة.
    9. أثناء الحضانة ، قم بإعداد الوسيط المطلوب وتسخينه. بمجرد ترسيخ ECM ، أضف 0.5 مل من وسط نمط HIO أو HCO في كل بئر واحتضانه عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2. انظر الشكل 3E للحصول على صورة للمركبات الكروية في ECM.
    10. استزراع الكرويات في وسط الزخرفة لمدة 3 أيام.
    11. بعد 3 أيام ، قم بتغيير وسط نمط HIO أو HCO إلى وسط النمو الطبيعي واحتضانه عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
      ملاحظة: العضيات في هذه المرحلة الزمنية (اليوم 10) هي عضيات في مرحلة مبكرة. بناء على هدف المشروع ، يمكن استخدام بعض العضيات في المراحل المبكرة لتحليل الزخرفة المبكر ، كما هو مفصل في القسم 2.
  6. نمو ومرور العضيات المعوية والقولونية البشرية
    1. بعد اليوم 10 ، قم بتغيير وسط النمو كل 3 أيام.
      ملاحظة: اعتمادا على كثافة الطلاء ونمو العضيات ، قد تكون هناك حاجة إلى تغييرات أكثر تكرارا في الوسائط. يجب إجراء تغييرات متوسطة قبل أن يصبح الفينول الأحمر (مؤشر الأس الهيدروجيني) في الوسط أصفر.
    2. احتضان العضيات حتى اليوم 21 (الشكل 3F).
      ملاحظة: سيؤدي علاج BMP2 إلى تقليل عدد العضيات (~ 3 أضعاف أقل من HIOs) التي تنمو من الكرويات. لذلك ، يجب طلاء عدد أكبر من المركبات لتوليد HCOs.
  7. انقسام العضيات في اليوم 21
    1. افحص العضيات.
      ملاحظة: يجب تقسيم العضيات في اليوم 21 حيث يكاد يكون ECM متدهورا بحلول اليوم 21 بسبب نمو العضوية وتوسعها.
    2. قم بإعداد أطراف الماصة سعة 1000 ميكرولتر و200 ميكرولتر عن طريق قص أطرافها.
    3. قم بتسخين طبق Nunc سعة 24 بئرا في حاضنة 37 درجة مئوية.
    4. اقتبس الحجم المناسب من ECM في أنابيب 1.5 مل المبردة مسبقا (الجدول 1).
    5. اكشط قطرة ECM برفق باستخدام العضيات بطرف ماصة 1000 ميكرولتر وقم بتحريك الخليط لأعلى ولأسفل عدة مرات لتفتيت وحدة التحكم في المؤسسة.
    6. انقل الخليط إلى طبق بتري 60 مم وتحقق من العضيات تحت المجهر. إذا لزم الأمر ، افصل العضيات عن بعضها البعض باستخدام ملقط معقم. تأكد من أن الفصل لا يضر بظهارة العضيات.
    7. انقل العضيات إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل وجهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 30 ثانية. استنشق المادة الطافية واترك ~ 1 مل من الوسط في الأنبوب.
      ملاحظة: يمكن تغيير حجم الوسيط بناء على الغرض من التجربة. إذا كانت هناك حاجة إلى المزيد من العضيات لكل قطرة ECM ، فيمكن تقليل الحجم المتوسط. ومع ذلك ، إذا كانت هناك حاجة إلى عدد أقل من العضيات ، فيمكن زيادة الحجم المتوسط.
    8. امزج العضيات جيدا ، وانقل الحجم المناسب إلى أنبوب ECM الموجود على الجليد ، ثم أعد تعليق العضيات و ECM عن طريق سحب العينات لخلطها جيدا.
    9. أضف 65 ميكرولتر من خليط الكرويات ووحدة التحكم في المحرك إلى وسط كل بئر من الصفيحة المكونة من 24 بئرا باستخدام أطراف الماصة المقطوعة سعة 200 ميكرولتر.
      ملاحظة: من الأهمية بمكان تناول العضيات أولا ثم ECM أثناء سحب العينات. وبالتالي ، أثناء توزيع الخليط ، تكون العضيات في الجزء العلوي من قطرة ECM.
    10. ضع الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 5 دقائق.
    11. اقلب اللوحة رأسا على عقب لمدة 15-25 دقيقة أخرى لمساعدة قطرات ECM في الحفاظ على هيكل يشبه القبة.
    12. أضف 0.5 مل من وسط نمو HIO / HCO في كل بئر واحتضانه عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
      ملاحظة: وسط النمو هو نفسه لكل من HIOs و HCOs بعد الزخرفة.
    13. قم بتغيير الوسيط كل 2-3 أيام حتى اليوم 35 (الشكل 3G).

2. التحقق من زخرفة العضيات عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي للنسخ العكسي (RT-qPCR)

  1. قبل جمع الحمض النووي الريبي ، قم بإعداد 1x مخزن مؤقت لتحلل الحمض النووي الريبي باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
  2. تخلص من الوسط المستهلك وأضف 350 ميكرولتر من محلول التحلل إلى كل بئر من اللوحة المكونة من 24 بئرا. قم بتحليل العضيات عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة سعة 1 مل. للحصول على تحلل أفضل ، قم بالدوامة لفترة وجيزة بأقصى سرعة لمدة 5 ثوان.
  3. احتفظ بجميع العينات عند -80 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة لاستخراج الحمض النووي الريبي. بمجرد أن تصبح جاهزا ، قم بإزالة عينات الحمض النووي الريبي من الفريزر -80 درجة مئوية وقم بإذابة الثلج على الجليد لمدة 10 دقائق. دوامة الأنابيب بقوة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10-15 دقيقة لضمان التحلل الكامل للعينات.
  4. ضع العينات على الجليد مرة أخرى وانتقل إلى استخراج الحمض النووي الريبي حسب تعليمات الشركة المصنعة. انقل عينات الحمض النووي الريبي إلى فريزر -80 درجة مئوية إذا لم تكن جاهزة للمتابعة إلى الخطوة التالية.
  5. إجراء استخراج الحمض النووي الريبي ومعالجة الحمض النووي وتخليق الحمض النووي (كدنا) وRT-qPCR باستخدام المنهجية القياسية. راجع الجدول 2 للحصول على قائمة بأسماء التمهيدي والتسلسلات.

3. التحقق من زخرفة العضيات عن طريق التألق المناعي

  1. جمع وتثبيت العضيات
    1. قم بشفط وسط HIO أو HCO من الآبار المناسبة وأضف 1 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات المثلج (PBS) إلى كل بئر. افصل العضيات عن وحدة التحكم في المحرك باستخدام طرف ماصة مقطوعة سعة 200 ميكرولتر. الماصة لأعلى ولأسفل لفصل أجزاء كبيرة من ECM عن العضيات.
    2. انقل العضيات إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل واملأ باقي الأنبوب ب PBS المثلج واخلطه برفق عن طريق قلب الأنبوب. اسمح للعضيات بالاستقرار عن طريق الجاذبية واستنشاق PBS.
      ملاحظة: إذا لم تستقر العضيات عن طريق الجاذبية ، فقم بجهاز الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 1 دقيقة.
    3. قم بشفط PBS وأضف 1 مل من محلول تحلل ECM المثلج. احتفظ بالأنبوب على الجليد لمدة 10-15 دقيقة على منصة دوارة مع اهتزاز لطيف.
      ملاحظة: قم بإمالة الأنبوب بزاوية 45 درجة للسماح بالخلط السليم للعضويات ومحلول استعادة الخلايا. بعد 10-15 دقيقة ، يجب أن تستقر العضيات في قاع الأنبوب ، مما يشير إلى الهضم الكامل ل ECM.
    4. أضف PBS باردا في الأنبوب حتى 15 مل ؛ تخلط جيدا عن طريق قلب الأنبوب عدة مرات. عندما تستقر العضيات في قاع الأنبوب ، قم بشفط PBS وأضف 1 مل من 4٪ بارافورمالدهيد المبرد مسبقا لإصلاح العضيات. احتضان العضيات مع 4٪ بارافورمالدهيد على الجليد لمدة 1 ساعة.
    5. املأ باقي الأنبوب بنظام PBS المثلج وضعه أفقيا على منصة هزازة عند 4 درجات مئوية طوال الليل. في اليوم التالي ، تخلص من بارافورمالدهايد / PBS في حاوية النفايات المحددة واغسلها مرة واحدة ب 15 مل من PBS المثلج ، كما هو موضح في الخطوة 3.1.2.
    6. استنشق PBS واملأ الأنبوب بنسبة 30٪ سكروز في PBS. ضع الأنبوب أفقيا على منصة هزازة عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
    7. في اليوم التالي ، قم بتضمين العضيات في نموذج أساسي 7 مم × 7 مم × 5 مم مع وسيط OCT وتجميد سريع باستخدام حمام ثلج جاف / إيثانول.
    8. جفف الكتل بمناديل مبللة للمعملية ، ولفها بمنشفة ورقية ، واحتفظ بها في فريزر -80 درجة مئوية طوال الليل. في اليوم التالي ، قم بقص أقسام 5 ميكرومتر على شرائح المجهر باستخدام ناظم التبريد. قم بتخزين الشرائح عند -80 درجة مئوية.
  2. تلطيخ التألق المناعي للعضيات
    1. قم بمعالجة الشرائح من الفريزر -80 درجة مئوية وقم بإجراء تلطيخ IF باستخدام البروتوكولات القياسية.
    2. ضع أغطية على الشرائح وجففها في درجة حرارة الغرفة ، محمية من الضوء لمدة ساعتين على الأقل أو طوال الليل قبل التصوير.
    3. قم بتصوير الشرائح باستخدام هدف 25x من المجهر متحد البؤر.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يدل التوليد الناجح للكبوتات الكروية خلال مرحلة تحريض الأمعاء الوسطى / الخلفية على الزخرفة الناجحة. قم بإجراء تلطيخ IF ل CDX2 على الكرات الكروية العائمة وعلى الطبقة الأحادية للتأكد من صحة الزخرفة. على الرغم من أن التلوين في مرحلة الأديم الباطن النهائي (DE) يمكن أن يشير إلى فعالية تحريض DE ، إلا أن توليد الكرة الكروية غير ممكن بدون تحريض DE الفعال. لاختبار كفاءة تحريض DE ، قم بإجراء تلطيخ IF و / أو RT-qPCR ل FOXA2 و SOX17.

بعد مرحلة الزخرفة ، يعد التعبير عن عوامل HOX أفضل مؤشر على الزخرفة الناجح...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد تمايز hPSCs إلى HIOs و HCOs عملية معقدة تتطلب ضوابط الجودة في كل خطوة. تحتاج hPSCs البادئة إلى الحد الأدنى من التمايز قبل بدء التمايز في DE. يعد تحسين كثافة hPSCs المطلية لتمايز DE أمرا بالغ الأهمية لنجاح البروتوكول. لضمان جودة تمايز DE ، قم بإجراء IF ل FOXA2 و SOX17 لتحديد كفاءة تمايز DE. يجب أن يؤدي تمايز DE إلى تلطيخ أكثر من 80٪ من الخلايا المعالجة بشكل إيجابي ل FOXA2 و SOX17. بمجرد إنشاء الكثافة المثلى ، يمكن استخدام هذه الكثافة نفسها لتجارب متعددة ذات نجاح مماثل. بعد تمايز DE ال...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تمويل مختبر Múnera من قبل NIH / NCI 5U54CA210962-02 مركز أبحاث التفاوتات في السرطان في ساوث كارولينا (SC CADRE) ، و NIH / NIGMS P20 GM130457-01A1 COBRE في أمراض الجهاز الهضمي والكبد ، و NIH / NIDDK 1P30 DK123704-01 MUSC مركز أبحاث أمراض الجهاز الهضمي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
محلول ألبومين مصل البقر 1٪ (BSA)غير متاحغير متاحغير متاح
أنبوب كورنينج 15 ملصقر21008-918غير متاح
30٪ سكروزغير متاحغير متاحصنع في PBS.
5٪ مصل حمير عاديمختبر جاكسون للأبحاث المناعية017-000-121غير متاح
أنبوب كورنينج 50 ملصقر21008-951غير متاح
أكوتيزثيرمو ساينتفيكA1110501حل انفصال الخلية; aliquot 5 مل من Accutase في أنابيب 10 مل يبلغ مجموعها 20 أنبوبا وتخزينها عند -20 درجة ؛ C لمدة تصل إلى 6 أشهر. ضع في 4 ° C طوال الليل قبل الاستخدام.
أكتيفين أأنظمة التوجيه الخلويجي إف إتش 6-100 × 10إعادة تشكيل المسحوق المجفف بالتجميد عند 100 µ ؛ جم / مل في PBS المعقم الذي يحتوي على 0.1٪ ألبومين مصل البقر (BSA). Aliquot 38 µ ؛ L من Activin A في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المبردة مسبقا وتخزينها عند -80 & درجة ؛ ج (تنتهي صلاحية الأنابيب بعد 12 شهرا من تاريخ الاستلام).
Activin Day 1 متوسط (RPMI 1640)كورنينجMT10041CVاستخدم الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA و Corning 11140050) وقم بتخزينها في درجة حرارة 4 درجة مئوية. عند تحضير Activin Day 1 وسط ، أضف 13 مل من اليوم الأساسي 1 متوسط ، 13 µ ؛ ل من أكتيفين أ (100 µ جم / مل) ، و 2 & ل من BMP4 (100 µ جم / مل). الوسط الأساسي مستقر لمدة تصل إلى 3 أسابيع ولكن يجب استخدامه مباشرة بعد إضافة عوامل النمو.
Activin Day 2 متوسط (RPMI 1640 ، 0.2٪ FBS vol / vol)هيكلونSH30070.03 طناستخدم الأحماض الأمينية غير الأساسية (Corning 11140050) وقم بتخزينه في درجة حرارة 4 درجة مئوية. متوسط اليوم الأساسي 2: 500 مل من RPMI 1640 ، و 500 مل من NEAA ، و 1 مل من مصل 0.2٪. عند تحضير Activin Day 2 متوسط ، أضف 12.5 مل من اليوم الأساسي 2 متوسط و 12.5 µ ؛ L من Activin A (100 µ جم / مل). الوسط الأساسي مستقر لمدة تصل إلى 3 أسابيع ولكن يجب استخدامه مباشرة بعد إضافة عوامل النمو.
Activin Day 3 متوسط (RPMI 1640 ، 2٪ FBS حجم / حجم)هيكلونSH30070.03 طناستخدم الأحماض الأمينية غير الأساسية (Corning 11140050) وقم بتخزينها في درجة حرارة 4 درجة مئوية. عند تحضير Activin Day 3 متوسط ، أضف 12.5 مل من اليوم الأساسي 3 و 12.5 µ ؛ L من Activin A (100 µ جم / مل). الوسط الأساسي مستقر لمدة تصل إلى 3 أسابيع ولكن يجب استخدامه مباشرة بعد إضافة عوامل النمو.
أليكسا فلور 488 حمار مضاد للماعزثيرمو ساينتفيكأ 11055تخفيف 1:500 (جسم مضاد ثانوي)
أليكسا فلور 488 حمار مضاد للأرنبثيرمو ساينتفيكطائفة A21206تخفيف 1:500 (جسم مضاد ثانوي)
أليكسا فلور 546 حمار مضاد للفأرثيرمو ساينتفيكأ 10036تخفيف 1:500 (جسم مضاد ثانوي)
Alexa Fluor 647 حمار مضاد للفأرثيرمو ساينتفيكأ 31571تخفيف 1:500 (جسم مضاد ثانوي)
قالب القاعدةصياد22-363-552غير متاح
وسط الأمعاء الأساسي (DMEM المتقدم)جيبكو12491015  عند تحضير وسط الأمعاء الأساسي ، أضف 500 مل من DMEM ، و 500 مل من N2 (Gibco 17-502-048) ، و 500 مل من B27 (Gibco) ، و 500 مل من L-Glutamine للحصول على 2 ملي L-Glutamine (Corning A2916801) ، و 5 مل من 100 وحدة / مل من البنسلين الستربتومايسين (Gibco 15-140-122) ، و 7.5 مل من   ؛ 1 مليون HEPES للحصول على 15 ملي HEPES. الوسط الأساسي مستقر لمدة تصل إلى 3 أسابيع ولكن يجب استخدامه مباشرة بعد إضافة عوامل النمو.
Biorad CFX96 نظام الكشف عن PCR في الوقت الحقيقي يعمل باللمسبيورادغير متاحيمكن استخدام أنظمة qRT-PCR الأخرى.
حل استعادة الخلاياكورنينج354253حل تحلل ECM
CHIR99021ريبروسيل4000410أعد التكوين بإضافة 2.15 مل من DMSO عند 10 ملليمتر. تحضير 50 & L aliquots وتخزينها في -20 درجة مئوية  تخزين البودرة في 4 ° ج ، محمي من الضوء.
CTRL HIO زخرفة وسيطغير متاحغير متاحمتوسط الأمعاء الأساسي و 100 نانوغرام / مل EGF.
دابيسيجما ألدريتشد9542تخفيف 1:100 (جسم مضاد ثانوي)
DE أحادي الطبقةغير متاحغير متاحتم إنشاء الطبقة الأحادية في الخطوات السابقة (القسم 4.4).
Dispaseجيبكو17105041أعد تعليق المسحوق المجفف بالتجميد في DMEM المتقدم (Gibco MT15090CV) إلى تركيز نهائي قدره 1 مجم / مل. قم بتصفية محلول التعقيم عن طريق التنظيف بالمكنسة الكهربائية باستخدام أنبوب تعقيم مرشح Millipore. اصنع 10 مل من الحصص (1 مجم / مل) وقم بتخزينه عند -20 درجة ؛ C لمدة تصل إلى 6 أشهر. ضع في 4 ° C طوال الليل قبل الاستخدام.
اي.ج.فثيرمو ساينتفيك236-EG-01 معند إعداد 100 نانوغرام / مل EGF إعادة تشكيل 500 µ جم / مل في PBS المعقمة. بعد ذلك أضف 2 مل من PBS المعقمة إلى 1 مجم EGF وجعل 500 µ جم / مل محلول EGF. Aliquot 100 µ ؛ لتر من EGF في 20 أنبوبا.
فيشربراند أطباق بتري 6 سم بغطاء شفافصيادFB0875713Aغير متاح
رافع خلية فيشربراندصياد08-100-240غير متاح
فيشربراند الفئة ب قوارير ملولبة زجاجية شفافة مع إغلاق مرفقصياد03-338 بغير متاح
Fisherbrand المتاح البورسليكات الزجاج باستور ماصةصياد13-678-2D0غير متاح
Fluoromount G تركيب الشريحة متوسطةVWR100241-874غير متاح
جيبكو المتقدمة DMEMجيبكو12-491-023غير متاح
الماعز المضادة ل E-Cadherinآر آند أنظمة Dأف648تخفيف 1:400 (جسم مضاد أولي)
الماعز المضاد ل SOX17آر آند أنظمة Dأف1924تخفيف 1:500 (الأجسام المضادة الأولية)
وسيط زخرفة HCOsغير متاحغير متاحوسط الأمعاء الأساسي ، 100 نانوغرام / مل EGF و 100 نانوغرام / مل BMP2. عند تحضير BMP2 ، أضف 1 مل من قوارير BMP2 المعقمة 4 ملي حمض الهيدروكلوريك 0.1٪ BSA إلى قوارير BMP2 (100 & micro; ز). Aliquot 25 & micro; L من محلول BMP4 في 4 أنابيب. الوسط الأساسي مستقر لمدة تصل إلى 3 أسابيع ولكن يجب استخدامه مباشرة بعد إضافة عوامل النمو.
مقياس الخوضسيجما ألدريتشZ359629غير متاح
الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSC)مرفق الخلايا الجذعية متعددة القدراتغير متاحالخلايا المزروعة في صفيحة 24 بئرا مطلية ب Matrigel (Thermo Scientific 73520-906).
محلول بارافورمالديهايد المثلج 4٪ (PFA)غير متاحغير متاحغير متاح
الفوسفات البارد المثلج المحلول الملحي (PBS)غير متاحغير متاحيجب أن يكون الرقم الهيدروجيني 7.4.
ImmEdge قلم حاجز مسعورمختبرات ناقلات101098-065غير متاح
الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs)مرفق الخلايا الجذعية متعددة القدرات (المركز الطبي لمستشفى سينسيناتي للأطفال)غير متاحيمكن استخدام خطوط hESC أو iPSC الأخرى ، ولكن يجب تحسين البروتوكول لكل خط خلية.
لايكا ميكروتومغير متاحغير متاحغير متاح
إل إس إم 880مجهر متحد البؤر
ماتريجيل الطابق السفلي غشاء مصفوفةكورنينج354234غير متاح
مصفوفة معتمدة من Matrigel hESCكورنينج354277قم بإعداد 4 × أقساط Matrigel التي تتوافق مع أحجام كافية لصنع ما يكفي من Matrigel المخفف لأطباق 4 × 6 آبار.
وسط الحث في منتصف المعى الخلفي (RPMI 1640)كورنينجMT10041CVالأحماض الأمينية غير الأساسية (كورنينج 11140050) ، 2٪ FBS vol / vol (Hyclone SH30070.03T) ، 3 µ ؛ M CHIR99021 و 500 نانوغرام / مل FGF4. الوسط الأساسي مستقر لمدة تصل إلى 3 أسابيع ولكن يجب استخدامه مباشرة بعد إضافة عوامل النمو.
كروية منتصف الأمعاء الخلفيةغير متاحغير متاحغير متاح
MilliporeSigma Steriflip وحدات تصفية فراغ معقمة يمكن التخلص منهاميليبورسيجماSCGP00525غير متاح
ماوس مضاد للCDX2بيوجينكسMU392-UCتخفيف 1:300 (الجسم المضاد الأساسي)
ماوس مضاد ل FOXA2أبنوفا / نوفوسH00003170-M011:500 تخفيف
mTeSR1 وسط نمو كاملتقنيات الخلايا الجذعية85870أضف 100 مل من مكمل mTeSR (85870) إلى وسيط mTeSR 400 مل (85870) وقم بتحويله إلى أنابيب سعة 50 مل مع تجنب التلوث. يخزن في 4 ° ج حتى الاستخدام.
حل Murray's Clear (المعروف أيضا باسم BABB)مورايغير متاح1: 2 بنزوات البنزيل وكحول البنزيل.
NOG HIO نمط الزخرفةغير متاحغير متاحمتوسط الأمعاء الأساسي ، 100 نانوغرام / مل EGF و 100 نانوغرام / مل NOGGIN (الاستغناء عن 25 µ ؛ ز من NOGGIN في 250 µ ؛ ل PBS معقمة مع 0.1٪ BSA).
NucleoSpin RNAتاكارا740955.25يمكن استخدام مجموعات عزل الحمض النووي الريبي الأخرى.
طبق زراعة الأنسجة السطحية دلتا Nunclon 24-wells (Nunc)ثيرمو ساينتفيك73521-004غير متاح
طبق زراعة الأنسجة السطحية دلتا Nunclon 24 بئرا مطلية ب Matrigelثيرمو ساينتفيك73521-004غير متاح
طبق زراعة الأنسجة السطحية دلتا Nunclon 6-آبار (Nunc)ثيرمو ساينتفيك73520-906غير متاح
طبق زراعة الأنسجة السطحية دلتا Nunclon 6 آبار مغلفة ب   ؛ ماتريجيل.ثيرمو ساينتفيك73520-906غير متاح
وسيط النمو ل HIOs و CTRL HIOs و HCOsغير متاحغير متاحوسط الأمعاء الأساسي و 100 نانوغرام / مل EGF (التركيز النهائي)
محلول ملحي عازلة من الفوسفات، 0.5٪ تريتون X (PBS-T)غير متاحغير متاحغير متاح
الاشعالشركة تقنيات الحمض النووي المتكاملة (IDT)غير متاحيتم سرد البادئات في الجدول 2 على البروتوكول.
أرنب مضاد CDX2علامة الخليةEPR22764Yتخفيف 1:100 (الجسم المضاد الأولي)
أرنب مضاد ل SATB2علامة الخليةEP281تخفيف 1:100 (الجسم المضاد الأولي)
بروتين BMP-4 البشري المؤتلفآر آند أنظمة D314-BP-010إعادة تشكيل المسحوق المجفف بالتجميد عند 100 µ ؛ جم / مل في 4 ملي حمض الهيدروكلوريك المعقم الذي يحتوي على 0.1٪ ألبومين مصل البقر (BSA). أضف محلول حمض الهيدروكلوريك 4.17 مل إلى 45.83 مل من الماء الجزيئي بإجمالي 50 مل من 1 M HCl. ثم أضف 200 µ ؛ لتر من 1 م حمض الهيدروكلوريك إلى 49.8 مل من الماء الجزيئي بإجمالي 50 مل من 4 ملي حمض الهيدروكلوريك. بعد ذلك ، أضف 0.05 جم BSA إلى 50 مل من 4 ملي حمض الهيدروكلوريك والفلتر لجعله معقما. Aliquot معقم 4 ملي حمض الهيدروكلوريك 0.1٪ BSA إلى 33 أنبوب طرد مركزي دقيق إجمالي وتخزينه عند -20 درجة مئوية. أضف 100 & ل من معقمة 4 ملي حمض الهيدروكلوريك 0.1٪ BSA إلى قوارير BMP4 (10 µ ز) لصنع محلول BMP4 عند 100 & micro ؛ ز / مل.
بروتين FGF-4 البشري المؤتلفآر آند أنظمة D235-F4-01مإعادة التشكيل في 100 µ جم / مل في PBS المعقم الذي يحتوي على 0.1٪ ألبومين مصل البقر. أضف 0.05 جم من BSA في 50 مل من PBS لعمل 0.1٪ BSA. مرشح 0.22 µ M BSA لتعقيم BSA. Aliquot 10 مل من 0.1٪ BSA في 5 أنابيب. أضف 1 مجم FGF-4 في 10 مل من 0.1٪ BSA. Aliquot 250 µ ؛ L في 40 أنبوب طرد مركزي دقيق مبرد مسبقا وتخزينه عند -80 درجة مئوية.
مثبط الصخور Y-27632توكريس1254التركيز النهائي هو 10 ملي مولار (10 مليمول / لتر). أعد التعليق في DMSO عند 10 مللي موتر وقم بتعقيم. أضف 3 مل من PBS المعقمة إلى كل قارورة. عليقوت 100 &ميكرو; L من مثبط ROCK في 30 أنبوبا وتخزينه عند -20 درجة مئوية.
طقم تركيب SuperScript VILO (كدنا)ثيرمو ساينتفيك11-754-250غير متاح
شرائح مجهر SuperFrost Plus
كومبد أنسجة تيك O.C.TVWR25608-930غير متاح

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Montgomery, R. K., Mulberg, A. E., Grand, R. J. Development of the human gastrointestinal tract: twenty years of progress. Gastroenterology. 116 (3), 702-731 (1999).
  2. Beumer, J., et al. High-resolution mRNA and secretome atlas of human enteroendocrine cells. Cell. 181 (6), 1291-1306 (2020).
  3. van Klinken, B. J., et al. MUC5B is the prominent mucin in human gallbladder and is also expressed in a subset of colonic goblet cells. American Journal of Physiology. 274 (5), Pt 1 871-878 (1998).
  4. Escande, F., Porchet, N., Aubert, J. P., Buisine, M. P. The mouse Muc5b mucin gene: cDNA and genomic structures, chromosomal localization and expression. Biochemical Journal. 363, Pt 3 589-598 (2002).
  5. Lau, S. T., et al. Activation of hedgehog signaling promotes development of mouse and human enteric neural crest cells, based on single-cell transcriptome analyses. Gastroenterology. 157 (6), 1556-1571 (2019).
  6. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
  7. Munera, J. O., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells into colonic organoids via transient activation of BMP signaling. Cell Stem Cell. 21 (1), 51-64 (2017).
  8. Higuchi, Y., et al. Gastrointestinal fibroblasts have specialized, diverse transcriptional phenotypes: a comprehensive gene expression analysis of human fibroblasts. PLoS One. 10 (6), 0129241(2015).
  9. Yahagi, N., et al. Position-specific expression of Hox genes along the gastrointestinal tract. Congenital Anomalies. 44 (1), 18-26 (2004).
  10. Sarvestani, S. K., et al. Induced organoids derived from patients with ulcerative colitis recapitulate colitic reactivity. Nature Communications. 12 (1), 262(2021).
  11. Holloway, E. M., et al. Differentiation of human intestinal organoids with endogenous vascular endothelial cells. Developmental Cell. 54 (4), 516-528 (2020).
  12. Britanova, O., et al. Satb2 is a postmitotic determinant for upper-layer neuron specification in the neocortex. Neuron. 57 (3), 378-392 (2008).
  13. Jaitner, C., et al. Satb2 determines miRNA expression and long-term memory in the adult central nervous system. Elife. 5, 17361(2016).
  14. Teo, A. K., et al. Activin and BMP4 synergistically promote formation of definitive endoderm in human embryonic stem cells. Stem Cells. 30 (4), 631-642 (2012).
  15. Fordham, R. P., et al. Transplantation of expanded fetal intestinal progenitors contributes to colon regeneration after injury. Cell Stem Cell. 13 (6), 734-744 (2013).
  16. Tamminen, K., et al. Intestinal commitment and maturation of human pluripotent stem cells is independent of exogenous FGF4 and R-spondin1. PloS One. 10 (7), 0134551(2015).
  17. Crespo, M., et al. Colonic organoids derived from human induced pluripotent stem cells for modeling colorectal cancer and drug testing. Nature Medicine. 23 (7), 878-884 (2017).
  18. Lees, E. A., et al. Using human induced pluripotent stem cell-derived intestinal organoids to study and modify epithelial cell protection against Salmonella and other pathogens. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59478(2019).
  19. Workman, M. J., et al. Engineered human pluripotent-stem-cell-derived intestinal tissues with a functional enteric nervous system. Nature Medicine. 23 (1), 49-59 (2017).
  20. Jung, K. B., et al. Interleukin-2 induces the in vitro maturation of human pluripotent stem cell-derived intestinal organoids. Nature Communications. 9 (1), 3039(2018).
  21. Woo, D. H., et al. Enhancing a Wnt-telomere feedback loop restores intestinal stem cell function in a human organotypic model of dyskeratosis congenita. Cell Stem Cell. 19 (3), 397-405 (2016).
  22. Sommer, C. A., et al. Modeling APC mutagenesis and familial adenomatous polyposis using human iPS cells. PLoS One. 13 (7), 0200657(2018).
  23. McCauley, H. A., et al. Enteroendocrine cells couple nutrient sensing to nutrient absorption by regulating ion transport. Nature Communications. 11 (1), 4791(2020).
  24. Zhang, X., et al. A comprehensive structure-function study of neurogenin3 disease-causing alleles during human pancreas and intestinal organoid development. Developmental Cell. 50 (3), 367-380 (2019).
  25. Kumar, N., et al. The lineage-specific transcription factor CDX2 navigates dynamic chromatin to control distinct stages of intestine development. Development. 146 (5), (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Pluripotent Stem CellsIntestinal OrganoidsColonic OrganoidsHuman Intestinal OrganoidsHuman Colonic OrganoidsBMP SignalingRegional SpecificationSATB2 ExpressionEpithelial Cell TypesMesenchymal Cells

Related Articles