Method Article

عزل نشط Caenorhabditis elegans استخراج النووية وإعادة تشكيل للنسخ في المختبر

DOI:

10.3791/62723

⸱

August 11th, 2021

 , 
1Department of Translational Medicine and Physiology, Elson S. Floyd College of Medicine, Washington State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، نقوم بوصف بروتوكول مفصل لعزل المستخلص النووي النشط من المرحلة الرابعة من اليرقات وتصور نشاط النسخ في نظام المختبر .

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كان Caenorhabditis elegans نظاما نموذجيا مهما للأبحاث البيولوجية منذ عرضه في عام 1963. ومع ذلك، لم يتم استخدام C. elegans بشكل كامل في الدراسة الكيميائية الحيوية للتفاعلات البيولوجية باستخدام مستخلصاتها النووية مثل النسخ المختبري وتكرار الحمض النووي. هناك عقبة كبيرة أمام استخدام سي إليغانس في الدراسات الكيميائية الحيوية هي تعطيل الجلد الخارجي السميك للنيماتودا دون التضحية بنشاط المستخلص النووي. في حين يتم استخدام العديد من الطرق لكسر كتيكل، مثل تجانس دونس أو سونيكيشن، فإنها غالبا ما تؤدي إلى عدم استقرار البروتين. لا توجد بروتوكولات راسخة لعزل البروتينات النووية النشطة عن اليرقات أو البالغين C. elegans لتفاعلات المختبر. هنا ، يصف البروتوكول بالتفصيل تجانس المرحلة 4 C. elegans اليرقات باستخدام متجانس بالش. يستخدم المتجانس بالش الضغط لإجبار الحيوانات ببطء من خلال فجوة ضيقة تكسر السفاح في هذه العملية. يسمح التصميم الموحد والآلات الدقيقة للمتجانس بالش بطحن الحيوانات بشكل متسق بين التجارب. تجزئة المتجانسة التي تم الحصول عليها من المتجانس بالش تسفر عن استخراج النووية النشطة وظيفيا التي يمكن استخدامها في طريقة في المختبر لاقتناص نشاط النسخ من elegans C.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الصغيرة، والعيش الحر النيماتودا Caenorhabditis elegans هو كائن نموذجي بسيط ولكن قوية لمعالجة مجموعة واسعة من الأسئلة البيولوجية. منذ إدخالها في عام 1963 ، كانت الديدان الخيطية لا تقدر بثمن للإجابة على الأسئلة في علم الأعصاب والتمثيل الغذائي والشيخوخة والتنمية والمناعة وعلم الوراثة1. بعض من العديد من الخصائص الحيوانية التي تجعل من كائن نموذجي مثالي تشمل وقت الجيل القصير، وفعالية تدخل الحمض النووي الريبي، والجسم الشفاف، والخرائط المكتملة لكل من النسب الخلوي والجهاز العصبي.

في حين أن مساهمات النيماتودا في العلوم واسعة ، إلا أنها لم تستخدم بشكل كاف لتوضيح نظام النسخ النواخي ، مع معظم فهمنا حول هذه الآليات القادم....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. الاستعدادات الإعلامية

  1. إعداد مرق الليوجيني العقيم (LB) لوحات أجار والوسائط السائلة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  2. سلالة Streak Escherichia coli (الإشريكية القولونية) OP50 على طبق أجار LB. احتضان سلسلة البكتيريا في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  3. تخزين لوحة E. coli OP50 المتتالية عند درجة حرارة 4 درجات مئوية بعد الحضانة. يمكن تخزين لوحة E. coli OP50 بأمان عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة أسبوعين إذا كانت ملفوفة في البارافيلم لمنع فقدان الرطوبة.
  4. إعداد 2 L من وسائل الإعلام نمو النيماتودا (NGM) باستخدام وصفة في الجدول 1.
    ملاحظة: نيستاتين اختياري. النيستاتين يساعد على منع العفن....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وينبغي أن يؤدي اتباع الخطوات المحددة إلى استخراج نووي وظيفي (الشكل 1)، ويمكن أن يؤدي الانحراف في خطوات الطحن أو الغسل إلى ضعف النشاط أو انخفاض الغلة. إذا تم الحصول على استخراج C . elegans النووية وظيفية ، فإنه سيتم نسخ المنطقة المصب من المروج CMV على قالب الحمض النووي عند إضافتها إلى المقايسة في المختبر وصفها سابقا. يمكن تنقية نسخة الحمض النووي الريبي الناتجة من البروتينات النووية وقالب الحمض النووي باستخدام الطرق التقليدية. وبدون الحمض الن.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C. elegans هو كائن حي نموذج جذاب لدراسة نظام النسخ eukaryotic بسبب صيانته منخفضة التكلفة وسهولة التلاعب الجيني. هنا يتم وصف بروتوكول لعزل ثابت لاستخراج النووية النشطة وظيفيا من L4 C. elegans . على الرغم من أن هذا البروتوكول ركز على تصور نشاط النسخ ، يمكن قياس CDNA المنتجة بعد النسخ باستخدام RT-qPCR للحصول على قياس أكثر دقة لنشاط النسخ8. هذه الطريقة لعزل البروتينات النووية من C. elegans يمكن أن تساعد في توسيع دراسة آلات النسخ eukaryotic. وبما أن سي إليغانس ليست ث.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ولا توجد مصالح متنافسة بين أصحاب البلاغ للكشف عنها.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم دعم هذا العمل بمنحة من المعهد الوطني للصحة (R35GM124678 إلى J. S.).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
< > المواد الاستهلاكية والكواشف < / قوي>
0.2 مل 8 شرائط وأنابيب أغطية الشريط المسطحة, واضحجينيسي علمي  24-706
0.2 مل أنابيب PCR الفرديةGenesee Scientific  24-153G
1.7 مل أنابيب دقيقة معقمةGenesee Scientific24-282S
100٪ الإيثانول الجزيئيالمطلق فيشر العلمية& nbsp ؛ BP2818
100٪ إيثانول ، KoptecDecon Labs  ؛ V1001
10 مل ماصة مصليةVWR الدولية  89130-898
ألواح بتري 150 مم TritechResearch  T3325
15 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطيةGenesee Scientific  28-103
20 مل محاقن بلاستيكيةفيشر ساينتفيك14955460
2 مل محاقن Norm-JectHenke-Sass Wolf GmbH4020
500 مل كوب فلتر فراغ 0.22 & مايكرو ؛ م PES ، Stericup Millipore Express PlusMillipore SigmaSCGPU10RE
50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطيةThermoFisher Scientific339652
50 مل ماصة مصليةVWR الدولية& nbsp ؛ 89130-902
5 مل ماصة مصليةVWR الدولية  89130-896
أجار, معيارVWR International  C7432
AgaroseDenville Scientific  CA3510-6
علامة مقاومة للكحولVWR International  52877-310
باكتو ببتونVWR الدولية  90000-264<
em>Caenorhabditis elegansCGCN2
ثنائي كلوريد الكالسيومMillipore Sigma  C4901
الكوليسترولMillipore Sigma  C8667
التحكم في بادئات استنساخ معبد الحمض النووي ، إلى الأمام 5 '- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3 '
التحكم في بادئات استنساخ معبد الحمض النووي ، إلى الأمام 5 '- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3 '
المياه
DithiothreitolInvitrogen  ؛ 15508-013
صبغة هلام الحمض النووي ، SYBR آمنةInvitrogen  ؛ S33102
مزيج سلم الحمض النووي ، O ' حاكم الجيناتفيشر العلمي  ؛ SM1173
تحميل الحمض النووي ، 6x TriTrackFisher Scientific  ؛ FERR1161
DNase, Baseline-ZEROLucigen  DB0715K
الثلج
الجاف < م > الإشريكية القولونية < / م > سلالة OP50CGCOP50
حمض الخليك الجليديفيشر العلمي  ؛ A38
الجلسرينميليبور سيجما  G6279
مستخلص هيلا النووي في نظام النسخ في المختبر ، HeLaScribePromega& nbsp ؛ E3110
محلول هيبس ، 1 م جيبكوميليبور سيجما15630080
حمض الهيدروكلوريك 37٪ميليبور سيجما  ؛ P0662
مبيض هيبوكلوريتكلوركس
LB مرقMillipore سيجما  ؛ L3022
ثنائي كلوريد المغنيسيومMillipore Sigma  M8266
كبريتات المغنيسيومMillipore Sigma  أطباق M7506
متوسطة الوزنفيشر العلمية  02-202-101
شرائح مجهر ، فيستا فيجن VWRالدولية16004-368
مياه الصف الجزيئي ، مختبراتHypure Hyclone  ؛ SH30538
NystatinMillipore Sigma  نظام N1638
PCR ، FailSafe مع بريمكس ALucigen  ؛ FS99100
كلوريد البوتاسيومMillipore Sigma  P39111
فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدةMillipore Sigma  P3786
فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدةMillipore Sigma  P0662
مثبط البروتياز ، وقفة كوكتيل للاستخدام الفردي 100xThermoFisher Scientific78430
مجموعة فحص البروتين ، QubitThermoFisher Scientific& nbsp ؛ طقم النسخ العكسي Q33211
طقم استخراج الحمض النووي الريبي
N8080119
كلوريد الصوديومVWR International  BDH9286-12 كجم
هيدروكسيد الصوديومMillipore Sigma  1-09137
فلتر حقنة معقمة مع 0.2 & micro ؛ م غشاء بولي إيثر سلفونVWR الدولي28145-501
السكروزVWR الدولي  ؛ 200-334-9
بادئات النسخ ، إلى الأمام 5 '- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3 '
بادئات النسخ ، عكس 5 '- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3 '
تريس بيسفيشر العلمية  BP152
Tween20Millipore Sigma  P2287
<قوي>المعدات
-20 & درجة; حاضنة CThermoFisher Scientific
20 درجة ؛ حاضنة CThermoFisher Scientific
37 درجة ؛ حاضنة CForma Scientific
4 ° ثلاجة CThermoFisher Scientific-80
° الفريزر CEppendorf
AutoclaveSanyo
Balch الخالط ، الخالط الخلية isobiotecIsobiotec
Benchtop Vortexerفيشر2215365
المركزي ، Eppendorf 5418 REppendorf5401000013
الطرد المركزي ، VWR Clinical 50VWR International82013-800
مجهر تشريح ، Leica M80Leica
Microsystems Fluorometer ، Qubit 2.0InvitrogenQ32866
Gel Imaging System ، iBright FL1500ThermoFisher Scientific  ؛ A44241
نظام هلامThermoFisher Scientific
Heat blockVWR International12621-048
أجهزة الطرد المركزي الدقيقة ، Eppendorf 5424Eppendorf22620401
PIPETBOY acu 2Integra155017
Pipette L-1000 XLS + ، Pipet-LiteLTS Rainin17014382
Pipette L-10 XLS+ ، Pipet-Lite LTSRainin17014388
Pipette L-200 XLS + ، Pipet-Lite LTS17014391Rainin
Pipette L-20 XLS + ، Pipet-Lite LTS LTSRainin17014392
Rocking PlatformVWR International
Thermocycler ، Eppendorf Mastercycler ProEppendorf950030010
منزوعة الأيونات صبغة ، Sensiscript Qiagen 205211 مجموعة RNeasy الصغيرة Qiagen 74004 RNase Inhibitor Applied Biosystems  ؛

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
  2. Blackwell, T. K., Walker, A. K. Transcription mechanisms. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , Pasadena, CA. 1-16 (2006).
    3. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Caenorhabditis ElegansNuclear ExtractIn Vitro TranscriptionBalch HomogenizerNuclear Protein IsolationLarval Stage FourHypotonic BufferHypertonic BufferRNA TranscriptionProtein Quantification

Related Articles