هنا، نقوم بوصف بروتوكول مفصل لعزل المستخلص النووي النشط من المرحلة الرابعة من اليرقات وتصور نشاط النسخ في نظام المختبر .
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
عزل نشط Caenorhabditis elegans استخراج النووية وإعادة تشكيل للنسخ في المختبر
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
كان Caenorhabditis elegans نظاما نموذجيا مهما للأبحاث البيولوجية منذ عرضه في عام 1963. ومع ذلك، لم يتم استخدام C. elegans بشكل كامل في الدراسة الكيميائية الحيوية للتفاعلات البيولوجية باستخدام مستخلصاتها النووية مثل النسخ المختبري وتكرار الحمض النووي. هناك عقبة كبيرة أمام استخدام سي إليغانس في الدراسات الكيميائية الحيوية هي تعطيل الجلد الخارجي السميك للنيماتودا دون التضحية بنشاط المستخلص النووي. في حين يتم استخدام العديد من الطرق لكسر كتيكل، مثل تجانس دونس أو سونيكيشن، فإنها غالبا ما تؤدي إلى عدم استقرار البروتين. لا توجد بروتوكولات راسخة لعزل البروتينات النووية النشطة عن اليرقات أو البالغين C. elegans لتفاعلات المختبر. هنا ، يصف البروتوكول بالتفصيل تجانس المرحلة 4 C. elegans اليرقات باستخدام متجانس بالش. يستخدم المتجانس بالش الضغط لإجبار الحيوانات ببطء من خلال فجوة ضيقة تكسر السفاح في هذه العملية. يسمح التصميم الموحد والآلات الدقيقة للمتجانس بالش بطحن الحيوانات بشكل متسق بين التجارب. تجزئة المتجانسة التي تم الحصول عليها من المتجانس بالش تسفر عن استخراج النووية النشطة وظيفيا التي يمكن استخدامها في طريقة في المختبر لاقتناص نشاط النسخ من elegans C.
المقدمة
الصغيرة، والعيش الحر النيماتودا Caenorhabditis elegans هو كائن نموذجي بسيط ولكن قوية لمعالجة مجموعة واسعة من الأسئلة البيولوجية. منذ إدخالها في عام 1963 ، كانت الديدان الخيطية لا تقدر بثمن للإجابة على الأسئلة في علم الأعصاب والتمثيل الغذائي والشيخوخة والتنمية والمناعة وعلم الوراثة1. بعض من العديد من الخصائص الحيوانية التي تجعل من كائن نموذجي مثالي تشمل وقت الجيل القصير، وفعالية تدخل الحمض النووي الريبي، والجسم الشفاف، والخرائط المكتملة لكل من النسب الخلوي والجهاز العصبي.
في حين أن مساهمات النيماتودا في العلوم واسعة ، إلا أنها لم تستخدم بشكل كاف لتوضيح نظام النسخ النواخي ، مع معظم فهمنا حول هذه الآليات القادم....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. الاستعدادات الإعلامية
- إعداد مرق الليوجيني العقيم (LB) لوحات أجار والوسائط السائلة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- سلالة Streak Escherichia coli (الإشريكية القولونية) OP50 على طبق أجار LB. احتضان سلسلة البكتيريا في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- تخزين لوحة E. coli OP50 المتتالية عند درجة حرارة 4 درجات مئوية بعد الحضانة. يمكن تخزين لوحة E. coli OP50 بأمان عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة أسبوعين إذا كانت ملفوفة في البارافيلم لمنع فقدان الرطوبة.
- إعداد 2 L من وسائل الإعلام نمو النيماتودا (NGM) باستخدام وصفة في الجدول 1.
ملاحظة: نيستاتين اختياري. النيستاتين يساعد على منع العفن....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
وينبغي أن يؤدي اتباع الخطوات المحددة إلى استخراج نووي وظيفي (الشكل 1)، ويمكن أن يؤدي الانحراف في خطوات الطحن أو الغسل إلى ضعف النشاط أو انخفاض الغلة. إذا تم الحصول على استخراج C . elegans النووية وظيفية ، فإنه سيتم نسخ المنطقة المصب من المروج CMV على قالب الحمض النووي عند إضافتها إلى المقايسة في المختبر وصفها سابقا. يمكن تنقية نسخة الحمض النووي الريبي الناتجة من البروتينات النووية وقالب الحمض النووي باستخدام الطرق التقليدية. وبدون الحمض الن.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
C. elegans هو كائن حي نموذج جذاب لدراسة نظام النسخ eukaryotic بسبب صيانته منخفضة التكلفة وسهولة التلاعب الجيني. هنا يتم وصف بروتوكول لعزل ثابت لاستخراج النووية النشطة وظيفيا من L4 C. elegans . على الرغم من أن هذا البروتوكول ركز على تصور نشاط النسخ ، يمكن قياس CDNA المنتجة بعد النسخ باستخدام RT-qPCR للحصول على قياس أكثر دقة لنشاط النسخ8. هذه الطريقة لعزل البروتينات النووية من C. elegans يمكن أن تساعد في توسيع دراسة آلات النسخ eukaryotic. وبما أن سي إليغانس ليست ث.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ولا توجد مصالح متنافسة بين أصحاب البلاغ للكشف عنها.
شكر وتقدير
وقد تم دعم هذا العمل بمنحة من المعهد الوطني للصحة (R35GM124678 إلى J. S.).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| < > المواد الاستهلاكية والكواشف < / قوي> | |||
| 0.2 مل 8 شرائط وأنابيب أغطية الشريط المسطحة, واضح | جينيسي علمي | 24-706 | |
| 0.2 مل أنابيب PCR الفردية | Genesee Scientific | 24-153G | |
| 1.7 مل أنابيب دقيقة معقمة | Genesee Scientific | 24-282S | |
| 100٪ الإيثانول الجزيئي | المطلق فيشر العلمية | & nbsp ؛ BP2818 | |
| 100٪ إيثانول ، Koptec | Decon Labs | ؛ V1001 | |
| 10 مل ماصة مصلية | VWR الدولية | 89130-898 | |
| ألواح بتري 150 مم Tritech | Research | T3325 | |
| 15 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية | Genesee Scientific | 28-103 | |
| 20 مل محاقن بلاستيكية | فيشر ساينتفيك | 14955460 | |
| 2 مل محاقن Norm-Ject | Henke-Sass Wolf GmbH | 4020 | |
| 500 مل كوب فلتر فراغ 0.22 & مايكرو ؛ م PES ، Stericup Millipore Express Plus | Millipore Sigma | SCGPU10RE | |
| 50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية | ThermoFisher Scientific | 339652 | |
| 50 مل ماصة مصلية | VWR الدولية | & nbsp ؛ 89130-902 | |
| 5 مل ماصة مصلية | VWR الدولية | 89130-896 | |
| أجار, معيار | VWR International | C7432 | |
| Agarose | Denville Scientific | CA3510-6 | |
| علامة مقاومة للكحول | VWR International | 52877-310 | |
| باكتو ببتون | VWR الدولية | 90000-264< | |
| em>Caenorhabditis elegans | CGC | N2 | |
| ثنائي كلوريد الكالسيوم | Millipore Sigma | C4901 | |
| الكوليسترول | Millipore Sigma | C8667 | |
| التحكم في بادئات استنساخ معبد الحمض النووي ، إلى الأمام 5 '- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3 ' | |||
| التحكم في بادئات استنساخ معبد الحمض النووي ، إلى الأمام 5 '- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3 ' | |||
| المياه | |||
| Dithiothreitol | Invitrogen | ؛ 15508-013 | |
| صبغة هلام الحمض النووي ، SYBR آمنة | Invitrogen | ؛ S33102 | |
| مزيج سلم الحمض النووي ، O ' حاكم الجينات | فيشر العلمي | ؛ SM1173 | |
| تحميل الحمض النووي ، 6x TriTrack | Fisher Scientific | ؛ FERR1161 | |
| DNase, Baseline-ZERO | Lucigen | DB0715K | |
| الثلج | |||
| الجاف < م > الإشريكية القولونية < / م > سلالة OP50 | CGC | OP50 | |
| حمض الخليك الجليدي | فيشر العلمي | ؛ A38 | |
| الجلسرين | ميليبور سيجما | G6279 | |
| مستخلص هيلا النووي في نظام النسخ في المختبر ، HeLaScribe | Promega | & nbsp ؛ E3110 | |
| محلول هيبس ، 1 م جيبكو | ميليبور سيجما | 15630080 | |
| حمض الهيدروكلوريك 37٪ | ميليبور سيجما | ؛ P0662 | |
| مبيض هيبوكلوريت | كلوركس | ||
| LB مرق | Millipore سيجما | ؛ L3022 | |
| ثنائي كلوريد المغنيسيوم | Millipore Sigma | M8266 | |
| كبريتات المغنيسيوم | Millipore Sigma | أطباق M7506 | |
| متوسطة الوزن | فيشر العلمية | 02-202-101 | |
| شرائح مجهر ، فيستا فيجن VWR | الدولية | 16004-368 | |
| مياه الصف الجزيئي ، مختبرات | Hypure Hyclone | ؛ SH30538 | |
| Nystatin | Millipore Sigma | نظام N1638 | |
| PCR ، FailSafe مع بريمكس A | Lucigen | ؛ FS99100 | |
| كلوريد البوتاسيوم | Millipore Sigma | P39111 | |
| فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدة | Millipore Sigma | P3786 | |
| فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة | Millipore Sigma | P0662 | |
| مثبط البروتياز ، وقفة كوكتيل للاستخدام الفردي 100x | ThermoFisher Scientific | 78430 | |
| مجموعة فحص البروتين ، Qubit | ThermoFisher Scientific | & nbsp ؛ طقم النسخ العكسي Q33211 | |
| طقم استخراج الحمض النووي الريبي | |||
| N8080119 | |||
| كلوريد الصوديوم | VWR International | BDH9286-12 كجم | |
| هيدروكسيد الصوديوم | Millipore Sigma | 1-09137 | |
| فلتر حقنة معقمة مع 0.2 & micro ؛ م غشاء بولي إيثر سلفون | VWR الدولي | 28145-501 | |
| السكروز | VWR الدولي | ؛ 200-334-9 | |
| بادئات النسخ ، إلى الأمام 5 '- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3 ' | |||
| بادئات النسخ ، عكس 5 '- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3 ' | |||
| تريس بيس | فيشر العلمية | BP152 | |
| Tween20 | Millipore Sigma | P2287 | |
| <قوي>المعدات | |||
| -20 & درجة; حاضنة C | ThermoFisher Scientific | ||
| 20 درجة ؛ حاضنة C | ThermoFisher Scientific | ||
| 37 درجة ؛ حاضنة C | Forma Scientific | ||
| 4 ° ثلاجة C | ThermoFisher Scientific-80 | ||
| ° الفريزر C | Eppendorf | ||
| Autoclave | Sanyo | ||
| Balch الخالط ، الخالط الخلية isobiotec | Isobiotec | ||
| Benchtop Vortexer | فيشر | 2215365 | |
| المركزي ، Eppendorf 5418 R | Eppendorf | 5401000013 | |
| الطرد المركزي ، VWR Clinical 50 | VWR International | 82013-800 | |
| مجهر تشريح ، Leica M80 | Leica | ||
| Microsystems Fluorometer ، Qubit 2.0 | Invitrogen | Q32866 | |
| Gel Imaging System ، iBright FL1500 | ThermoFisher Scientific | ؛ A44241 | |
| نظام هلام | ThermoFisher Scientific | ||
| Heat block | VWR International | 12621-048 | |
| أجهزة الطرد المركزي الدقيقة ، Eppendorf 5424 | Eppendorf | 22620401 | |
| PIPETBOY acu 2 | Integra | 155017 | |
| Pipette L-1000 XLS + ، Pipet-Lite | LTS Rainin | 17014382 | |
| Pipette L-10 XLS+ ، Pipet-Lite LTS | Rainin | 17014388 | |
| Pipette L-200 XLS + ، Pipet-Lite LTS | 17014391 | Rainin | |
| Pipette L-20 XLS + ، Pipet-Lite LTS LTS | Rainin | 17014392 | |
| Rocking Platform | VWR International | ||
| Thermocycler ، Eppendorf Mastercycler Pro | Eppendorf | 950030010 |
المراجع
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
- Blackwell, T. K., Walker, A. K. Transcription mechanisms. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , Pasadena, CA. 1-16 (2006). ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
