يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تنظيم الخلايا الجذعية Mesenchymal من البلعم البلعمي; الكمية والتصوير

2.7K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/62729

⸱

يوليو 16, 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Molloy College

في هذه المقالة

ملخص

يقدم هنا بروتوكول لتحديد وإنتاج صور ديناميكية للخلايا الجذعية الوسيطة (MSC) لتنظيم البلعمة الضامة (MΦ) من جزيئات الخميرة غير opsonized (zymosan) التي يتم اقترانها بجزيء فلوري حساس ل درجة الحموضة.

الملخص

تمت دراسة الخلايا الجذعية الميزنشيمالية (MSC) تقليديا لخصائصها التجديدية ، ولكن في الآونة الأخيرة ، كانت خصائصها المناعية في المقدمة. وهي تتفاعل مع نشاط الخلايا المناعية وتنظمه. ينصب تركيز هذه الدراسة على تنظيم MSC للنشاط البلعوي الضام. الضامة (MΦ) البلعومي هو جزء مهم من استجابة الجهاز المناعي الفطرية للعدوى ، والآليات التي من خلالها تعدل MSC هذه الاستجابة قيد التحقيق النشط. هنا هو وسيلة لدراسة MΦ phagocytosis من الجسيمات غير opsonized zymosan المقترنة جزيء الفلورسنت الحساسة ل درجة الحموضة بينما في الثقافة المشتركة مع MSC. مع زيادة النشاط البلعوسي وانسداد جزيئات الزيموسان المسماة داخل البيئة الحمضية للفسوسوم ، تزداد كثافة الفلورية للجزيء الحساس ل درجة الحموضة. مع الإثارة المناسبة والأطوال الموجية للانبعاثات ، يتم قياس النشاط البلعوسي باستخدام مطياف فلوري ويتم تقديم البيانات الحركية كتغيرات في وحدات الفلورسنت النسبية على مدى فترة 70 دقيقة. ولدعم هذه البيانات الكمية، يتم تصور التغير في النشاط البلعوي باستخدام التصوير الديناميكي. تظهر النتائج باستخدام هذه الطريقة أنه عندما تكون في الثقافة المشتركة ، تعزز MSC الفوسفات MΦ من zymosan غير opsonized من كل من السذاجة وIFN-γ تعامل MΦ. هذه البيانات إضافة إلى المعرفة الحالية لتنظيم MSC من الجهاز المناعي الفطري. ويمكن تطبيق هذه الطريقة في التحقيقات المستقبلية لتحديد الآليات الخلوية والجزيئية الأساسية بشكل كامل.

المقدمة

الخلايا الجذعية الميكنشيمالية (MSC) هي خلايا سلفية تؤدي إلى خلايا النسيج الضام. MSC موجودة في أنسجة الثدييات الكبار ويمكن عزلها عن نخاع العظام1. بسبب خصائصها المناعية ، تتم دراسة هذه الخلايا على نطاق واسع2. الدراسات المبكرة التي ركزت على تنظيم MSC من الخلايا التائية3،4،5،6 ولكن في الآونة الأخيرة ، وتنظيمها للخلايا الضامة (MΦ) ، وهو عنصر خلوي رئيسي من الحصانة الفطرية ، وقد تلقت اهتماما متزايدا7،8،9،10،11،12،13،14 . أهمية التفاعل MSC-MΦ في علاج مرض التهابي يؤكده حقيقة أن استنفاد monocytes / الضامة يلغي الآثار العلاجية للMSC في النماذج الحيوانية8. هنا، التركيز هو تفاعل اتصال الخلية من MSC مع MΦ. MSC لديها القدرة على تنظيم النمط الظاهري من MΦ من خلال تعزيز التحول من الاستجابات الالتهابية إلى المضادة للالتهابات، مما يؤدي إلى أنشطة إصلاح الأنسجة8،9،10،11، وقد تم القيام بالكثير لإثبات هذه الآليات التنظيمية. في ظل ظروف أخرى، يمكن أن تدعم MSC أو تفاقم استجابة التهابية مدفوعة MΦ12،13 وتعزيز النشاط البلعوي MΦ14،15. ومع ذلك، هناك نقص خطير في البيانات الموجودة التي تحدد الآليات التي بموجبها والظروف التي تنظم MSC النشاط البلعوي MΦ.

MΦ لديها عائلات المستقبلات التي تعترف إما opsonized (الأجسام المضادة أو تكمل المغلفة) أو مسببات الأمراض غير opsonized مما يؤدي إلى البلعوم16. تفعيل ونشاط هذا الأخير هو أقل دراسة جيدة17. في بيئة غير التهابية في المختبر ، تعزز MSC الفوسفات MΦ من مسببات الأمراض غير opsonized13. ومع ذلك ، يمكن تقليل التعرف على مسببات الأمراض غير opsonized بواسطة MΦ بعد التعرض لبيئة التهابية تنتجها الخلايا الليمفاوية أثناء الاستجابة المناعية التكيفية. IFN-γ، التي أطلقتها الخلايا القاتلة الطبيعية والخلايا الليمفاوية التأثير، له تأثير مثبط على MΦ البلعوم من الجسيمات غير opsonized18. تم تطوير نموذج الثقافة المشتركة لدراسة آليات تنظيم الاتصال المباشر MSC من البلعوس MΦ. الهدف من التجربة المعروضة هنا هو تحديد ما إذا كان MSC ينظم MΦ phagocytosis من مسببات الأمراض غير opsonized بعد MΦ قد تعرضت لIFN-γ (الشكل 1).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ملاحظة: يتم تنفيذ جميع تقنيات الإعداد المتوسط وزراعة الخلايا في ظل ظروف مطهرة باستخدام خزانة السلامة البيولوجية مع تدفق الصفيحة. يتم تنفيذ جميع خطوات حضانة الثقافة الموصوفة باستخدام حاضنة مصممة للحفاظ على جو من 37 درجة مئوية و 5٪ CO2و 95٪ رطوبة.

1. ثقافة الخلية

  1. إعداد متوسط النمو
    1. بالنسبة إلى MSC و LADMAC، أضف 50 مل من FBS و5 مل من مزيج المضادات الحيوية/مضادات الميكويك 100x إلى 500 مل من DMEM عالي الجلوكوز.
    2. بالنسبة إلى MΦ، أضف 50 مل من FBS، و100 مل من وسيط حالة LADMAC (تم إعداده باتباع خطوات القسم 1.2)، و5 مل من مزيج المضادات الحيوية 100x إلى 500 مل من DMEM عالي الجلوكوز.
      ملاحظة: تنتج خلايا LADMAC عامل تحفيز المستعمرة (CSF-1) الضروري لدعم نمو خلايا MΦ.
  2. إعداد LADMAC المتوسطة مشروطة
    1. لزرع خلايا LADMAC من المخزون المجمد، أضف 19 مل من متوسط النمو من القسم 1.1 في كل من قوارير معالجة زراعة الخلايا T75 cm2 الخمسة ووضعها في حاضنة زراعة الخلايا لمدة 15 دقيقة للتوازن إلى 37 درجة مئوية.
    2. وفي الوقت نفسه، ذوبان سريع واحد aliquot من 106 الخلايا المجمدة عن طريق احتضان في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 2-3 دقائق أو حتى يحصل على إذابة. أضف الخلايا إلى 9 مل من متوسط نمو MSC الطازج في أنبوب مخروطي معقم سعة 15 مل أو 50 مل وطارد مركزي عند 125 × ز في دوار دلو متأرجح لمدة 5 دقائق.
    3. أسبيرات أو decant العملاقة، إضافة 5 مل من متوسط النمو الطازج، وماصة بلطف صعودا وهبوطا لإعادة إنفاق بيليه الخلية.
    4. إضافة 1 مل من تعليق الخلية إلى كل من قوارير T75 cm2 الخمسة باستخدام ماصة مصلية معقمة ووضعها في حاضنة ثقافة الخلية.
    5. كل يومين إلى ثلاثة أيام، أضف 10 مل إضافية من المتوسط على مدى فترة 7-10 أيام. ثم، جمع الخلايا وsupernatant في أنابيب مخروطية معقمة 50 مل باستخدام ماصة المصلية معقمة والطرد المركزي في 125 × ز لمدة 5 دقائق.
    6. فصل supernatant من بيليه الخلية ومرشح معقمة supernatant باستخدام وحدة تصفية فراغ 0.2 ميكرومتر عقيمة ذات استخدام واحد.
      1. إزالة التجميع الطامح من الحزمة والاتصال باستخدام أنابيب فراغ إلى مضخة الطامح. صب supernatant في المقصورة العليا واستبدال الغطاء. قم بتشغيل مضخة الطامح لتصفية في المقصورة السفلية.
      2. إعداد aliquots عن طريق الأنابيب في أنابيب مخروطية معقمة 50 مل وتخزينها في -20 درجة مئوية.
    7. لتجميد بيليه الخلية، وإعادة الإنفاق في المتوسط تجميد في 106 خلية / مل، ووضعها في حاوية تجميد، ومن ثم وضعها في الثلاجة -80 درجة مئوية. بعد 24 ساعة، نقل إلى LN2 التخزين.
  3. نشر الخلايا استعدادا للثقافة المشتركة
    1. لزرع خلايا MSC و MΦ من المخزون المجمد ، قم بموافقة 9 مل من متوسط النمو المناسب المعد في القسم 1.1 في كل من الأطباق الأربعة 100 مم من الخلايا المعالجة لكل نوع من الخلايا ومكانها في حاضنة ثقافة الخلية لمدة 15 دقيقة.
    2. وفي الوقت نفسه، إذابة سريعة aliquots من 106 الخلايا المجمدة عن طريق احتضان لهم في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 2-3 دقائق أو حتى إذابة فقط. ثم، إضافة خلايا MSC المذابة إلى 9 مل من المتوسط نمو MSC الطازجة وإضافة الخلايا MΦ المذابة إلى 9 مل MΦ الطازجة متوسطة النمو في 15 أو 50 مل أنابيب مخروطية معقمة والطرد المركزي في 125 × ز في الدوار دلو يتأرجح لمدة 5 دقائق.
    3. أسبيرات أو decant العملاقة وإعادة إنفاق كل بيليه في 4 مل من المتوسط النمو الطازج المناسب عن طريق الأنابيب بلطف صعودا وهبوطا. أضف 1 مل من تعليق الخلية إلى كل طبق من الأطباق الأربعة مقاس 100 مم لكل نوع من أنواع الخلايا التي تم تهاونها في الخطوة 1.3.1.
    4. أعد الأطباق مع الخلايا إلى الحاضنة. تغيير المتوسط كل 2-3 أيام حتى التقاء 70٪-80٪.

2. بذور MSC في الأطباق التجريبية، اليوم 1

ملاحظة: قبل بذر MSC، قم بتصميم تخطيط اللوحة التجريبي 96 جيدا لقياس الطيف الفلوري وشريحة الحجرة للتصوير الديناميكي. بالنسبة للوح 96 بئرا ، يحيط بالآبار التجريبية مع آبار تحتوي على خلايا ولكن لا تستخدمها في المقايسة. وضع علامة على أربعة آبار على الأقل لاستخدامها في الكواشف الفارغة (RBL). راجع الجدول 1 للحصول على مثال قالب 96-well والجدول 2 للحصول على مثال على قالب شرائح غرفة 4-well. يوصى بألواح 96 جيدا بالأبيض والأسود ذات قيعان صافية. شريحة غرفة زجاجية 1.5 ملم borosilicate هو الأمثل، ولكن يمكن تعديل عدد الغرف اعتمادا على تصميم الدراسة. يتم تضمين مخطط تدفق ملخص للأساليب التالية في الشكل 2.

  1. في التقاء 70٪ -80٪، يستنشق متوسط النمو من الثقافات في أطباق 100 ملم وإضافة 5 مل من برنامج تلفزيوني لعزل MSC.
  2. أسبيرات برنامج تلفزيوني، إضافة 2 مل من 0.05٪ تريبسين / EDTA، ووضعه في حاضنة الثقافة لمدة 3-5 دقائق.
  3. بعد 3 دقائق، تحقق من مفرزة الخلية باستخدام مجهر مقلوب. إذا كانت الخلايا منفصلة، تابع إلى الخطوة التالية؛ إذا لم يكن كذلك، استمر في الحضانة لمدة 1-2 دقيقة أخرى. لا تحتضن أطول من 5-6 دقائق.
  4. إضافة 5 مل من متوسط النمو الطازج إلى الطبق مع الخلايا المنفصلة. شطف الطبق باستخدام خليط تريبسين / متوسطة وجمع الخلايا في نظيفة, عقيمة 50 مل أنبوب مخروطي باستخدام ماصة المصلية العقيمة.
  5. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 125 × ز. أسبيرات العملاقة وإعادة إنفاق بيليه الخلية في 10 مل من متوسط النمو الطازج عن طريق الأنابيب بلطف صعودا وهبوطا.
  6. لحساب الخلايا، أضف 10 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى 30 ميكرولتر من محلول أزرق ثلاثي الثقب بنسبة 0.4٪ في أنبوب ميكروسينترريفي سعة 1.5 مل. ثم، ماصة 10 ميكرولتر من الخليط تحت غطاء من غرفة عد مقياس الدم.
  7. باستخدام مجهر حقل مقلوب أو مشرق ، مع هدف 10x ، عد الخلايا غير الملطخة (قابلة للحياة) في أربعة من المربعات 1 مم2. حساب رقم الخلية باستخدام الصيغة: الخلايا / مل = عدد الخلايا / # 1 مم2 المربعات × عامل التخفيف × 104.
    ملاحظة: لهذا المثال، عدد المربعات2 مم 1 يتم عد أربعة وعامل التخفيف هو 4.
  8. استخدم المعادلة C1V1 = C2V2 لحساب وإعداد تعليق خلية/مل 1 ×10 5. إعداد 1 مل من تعليق الخلية / مل لكل عمود من لوحة 96 جيدا ليتم شغلها و 0.75 مل لكل غرفة من الشريحة غرفة 4-جيدا ليتم شغلها وفقا لتصميم لوحة.
    ملاحظة: C1 = عدد الخلايا، V1 = ما يتم حسابه، C2 = 1 × 105، V2 = 5.50 مل.
  9. تحديد V1، طرح من 5.50 مل المطلوب من إجمالي حجم لتحديد حجم المتوسطة الطازجة اللازمة لإعداد التعليق. أضف حجم الخلايا (V1)من التعليق الأصلي إلى حجم الوسط الطازج بإجمالي 5.50 مل مع 1 × 105 خلايا / مل.
  10. إضافة 100 ميكرولتر من 1 × 105 تعليق الخلية / مل إلى كل بئر من لوحة 96 جيدا وفقا لتصميم لوحة باستخدام micropipettor متعددة القنوات و 530 ميكرولتر إلى كل بئر من آبار الشريحة الغرفة باستخدام micropipette وفقا لتصميم لوحة. احتضان بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: لهذه التجربة، يتم طلاء MSC في الأعمدة 1 و 2 و 3 و 6 من لوحة 96 بئرا(الجدول 1)والآبار 1 و 2 من الشريحة غرفة 4-جيدا (الجدول 2). لذلك، يتم إعداد ما لا يقل عن 5.50 مل من تعليق خلية/مل 1 ×10 5. يتم التعامل مع MΦ في التقاء 80٪ مع الوسطاء الالتهابيين في نفس اليوم الذي يتم فيه بذر MSC في الصفائح التجريبية.

3. تفعيل MΦ مع IFN-γ، اليوم 1

  1. قم بإعداد وسيط التنشيط والأوراق المالية Γ IFN.
    1. ل200 مل من المتوسط التنشيط, إضافة 40 ملغ من BSA إلى 200 مل من الدم خالية من الجلوكوز عالية DMEM ومرشح معقم باستخدام 0.2 ميكرومتر عقيمة وحدة تصفية فراغ أحادية الاستخدام.
    2. لإعداد 0.1٪ BSA/ PBS، إضافة 20 ملغ من BSA إلى 20 مل من برنامج تلفزيوني. دوامة لتذوب. استخدمي فلتر حقنة معقمة 0.2 ميكرومتر لتصفيته إلى أنبوب مخروطي نظيف معقم سعة 50 مل.
    3. إضافة 1 مل من المعقم 0.1٪ BSA/ PBS الحل إلى 100 ميكروغرام من lyophilized IFN-γ لتحقيق 100 ميكروغرام / مل من محلول المخزون. يخزن في 50 ميكرولتر من الأسعار عند -20 درجة مئوية.
  2. تنشيط MΦ مع IFN-γ
    1. أضف 2.5 ميكرولتر من 100 ميكروغرام/مل من مخزون Γ IFN لكل مل واحد من الوسط المطلوب. لكل طبق 100 مم ليتم تنشيطه، قم بإعداد 10 مل من وسيط التنشيط الذي يحتوي على IFN-γ بتركيز 250 نانوغرام/مل.
    2. يستنشق متوسط النمو من الثقافات MΦ واستبداله مع 5 مل من وسيط التنشيط دون IFN- γ لشطف.
    3. أسبيرات المتوسطة المستخدمة في الشطف واستبدالها مع 10 مل من IFN- γ تكملة وسيطة التنشيط للطبق التجريبي ومع 10 مل من وسيط التنشيط غير المكمل للتحكم. احتضان الثقافات لمدة 16-24 ساعة.

4. عزل MΦ وإعداد الثقافات المشتركة، اليوم 2

  1. إزالة وسيطة التنشيط من الخلايا MΦ واستبدالها مع 5 مل من متوسط النمو الطازج. كشط بلطف مع رافع الخلية وجمع الخلايا في أنبوب مخروطي 50 مل.
  2. عد الخلايا باستخدام استبعاد أزرق ثلاثي الريبان والهيموسيكلوميتري كما هو موضح ل MSC في الخطوات 2.6-2.7.
  3. باستخدام المعادلة في الخطوات 2.8-2.9، قم بإعداد تعليقين منفصلين من 2 × 105 خلايا / مل، واحدة مع خلايا من عنصر التحكم وواحدة مع خلايا من ثقافات MΦ المعالجة.
    ملاحظة: إعداد 1 مل من تعليق الخلية/مل لكل عمود من لوحة 96-well ليتم شغلها و0.75 مل لكل غرفة من الشريحة غرفة 4-جيدا ليتم شغلها وفقا لتصميم لوحة.
  4. يستنشق بلطف المتوسطة من الآبار التجريبية من لوحة 96 جيدا التي تحتوي على MSC. باستخدام micropipette متعدد القنوات، إضافة 100 ميكرولتر من المعالجة وتعليق الخلية MΦ التحكم في الآبار التجريبية المناسبة مع وبدون MSC وفقا لتصميم لوحة. احتضان بين عشية وضحاها.
  5. يستنشق بلطف المتوسطة من الشريحة غرفة 4-جيدا التي تحتوي على MSC، وباستخدام micropipette، إضافة 530 ميكرولتر من تعليق الخلية MΦ إلى الآبار المناسبة وفقا للتصميم. احتضان بين عشية وضحاها.

5. فحص البلعوس ، الفلورسنت الحركي 96-جيدا لوحة قراءة ، اليوم 3

  1. تعيين معلمات الفحص
    1. في يوم الفحص، قم بتشغيل قارئ اللوحة الفلورية وحدد الكمبيوتر درجة الحرارة على النظام إلى 37 درجة مئوية.
    2. افتح برنامج Pro system وتحقق من رمز الأداة في الزاوية العلوية اليسرى لتحديد ما إذا كان الجهاز متصلا بالكمبيوتر. إذا كانت الدائرة الحمراء مع خط مرئية، انقر على أيقونة الصك واختيار الصك في النافذة المنبثقة لإجراء الاتصال.
    3. حدد تجربة جديدة للوصول إلى الإطار المنبثق "مساعد إعداد لوحة". من القائمة مساعد إعداد لوحة، حدد تكوين إعدادات الاستحواذ الخاصة بك.
    4. حدد Monochromator من قائمة الإعدادات للتكوين البصري. حدد FL (مضان) لوضع القراءة والحركية لنوع القراءة.
    5. في نفس نافذة التكوينات، تحت Category، انقر على الأطوال الموجية، ثم قم بتعيين النطاق الترددي إلى 9 نانومتر للإثارة و 15 نانومتر للانبعاثات.
    6. تعيين عدد أزواج الطول الموجي إلى 1. تعيين الأطوال الموجية LM1 إلى 510 نانومتر للإثارة و 540 نانومتر للانبعاثات.
    7. تابع الفئات وحدد نوع اللوحة التالي. حدد الخيار الذي يطابق نوع اللوحة المستخدمة.
      ملاحظة: من المهم أن الاختيار يطابق نوع لوحة. يتم تعيين ارتفاعات القراءة من قبل النظام وفقا للاختيار.
    8. بعد ذلك، حدد منطقة القراءة وأبرز مساحة اللوحة ذات ال 96 بئرا المضمنة في التصميم التجريبي.
    9. حدد PMT والبصريات، تعيين PMT كسب إلى عالية ومضات لكل قراءة إلى 6. حدد المربع بجوار القراءة من الأسفل إذا كنت تستخدم لوحة واضحة أسفل.
    10. حدد التوقيت وحدد فترات زمنية مدتها 10 دقائق على مدى فترة 70 دقيقة.
    11. حدد اهتزاز، حدد المربع قبل القراءة الأولى، ثم قم بتعيين لمدة 5 s. حدد المربع بين القراءات وتعيين لمدة 3 s. تعيين كثافة اهتزاز لكل من منخفض وخطي.
    12. أغلق النافذة. عندما تظهر نافذة مساعد إعداد اللوحة، حدد تكوين تخطيط اللوحة. تسليط الضوء على آبار BL من تصميم لوحة وانقر على لوحة فارغة.
    13. قم بتمييز كل صف من الصفوف التجريبية، وانقر على إضافة، واسم المجموعة، ثم حدد لونا.
    14. ضمن خيارات التعيين أسفل تصميم اللوحة، حدد سلسلة،ثم حدد السلسلة في النافذة وانقر فوق موافق. كرر لكل مجموعة.
  2. إعداد تعليق الزيموسان
    1. أثناء انتظار أن تصل درجة حرارة النظام إلى 37 درجة مئوية ، أعيد إنفاق 1 ملغ من جزيئات الزيموسان في 5 مل من وسيط التصوير بالخلايا الحية.
      1. أضف 1 مل من وسيط التصوير بالخلايا الحية إلى القارورة التي تحتوي على الجسيمات وجمعها في أنبوب زجاجي. شطف القارورة مع 1 مل إضافية من محلول التصوير ونقلها إلى نفس الأنبوب الزجاجي لضمان نقل جميع الجسيمات. أضف 3 مل من محلول التصوير الإضافي لتحقيق تعليق 0.2 ملغم/مل من الجسيمات.
    2. دوامة مع نبضات سريعة لمدة 30-60 s. ثم، استخدم سونيكاتور التحقيق ل sonicate مع 60 نبضة سريعة.
      ملاحظة: من المهم جدا إنشاء تعليق متجانس للجسيمات وعدم السماح للتعليق بالجلوس لفترة طويلة جدا قبل إضافة إلى الآبار التجريبية. تتجمع تتكرر بسرعة. قد تحتاج كثافة الجسيمات لكل خلية إلى تحسينها حسب مصدر MΦ المستخدمة ومعالجتها وكثافتها. في الدراسات المقدمة، تم استخدام جزيئات الزيموسان المترافقة. ومع ذلك، تتوفر أيضا الإشريكية القولونية المترافقة وS. aureus.
  3. إضافة zymosan وقراءة لوحة
    1. يستنشق الوسط من الآبار التجريبية ويشطف 1x ب 100 ميكرولتر من محلول التصوير بالخلايا الحية. شطف آبار RBL مع حل التصوير بالخلايا الحية كذلك.
    2. يستنشق محلول التصوير بالخلايا الحية من الآبار التجريبية وRBL ويستبدله ب 100 ميكرولتر من تعليق الجسيمات الزيموسان المعد في القسم 5.2.
    3. افتح درج لوحة قارئ الفلورسنت باستخدام واجهة لوحة اللمس. تعيين لوحة، دون غطاء، في علبة مع بئر A1 في الزاوية اليسرى العليا. أغلق الدرج باستخدام لوحة اللمس وانقر على الزر "قراءة" الأخضر في القائمة العلوية.
    4. عند اكتمال القراءة، احفظ الملف إلى المجلد المناسب ثم قم بتصدير البيانات بتنسيق جدول بيانات بالنقر فوق ملف وتحديد تصدير.
    5. حساب متوسط ± SEM الفلورسينس النسبي لكل مجموعة تكرار في كل نقطة زمنية (10 دقيقة، 20 دقيقة، 30 دقيقة، الخ) في جدول البيانات(ملف تكميلي 1)ونقل البيانات إلى برامج الرسم البياني.
    6. استخدم تنسيق الرسم البياني الخطي لعرض البيانات وتطبيق ANOVA ثنائي الاتجاه (الوقت x العلاج / MSC كعوامل) متبوعا باختبار المقارنات المتعددة ل Tukey لتحديد الاختلافات بين المجموعات الفردية.
      ملاحظة: أثناء قراءة لوحة 96 جيدا قيد التقدم، قم بإعداد لوحة التصوير الديناميكية للحصول على صورة الفاصل الزمني. تأكد من أن التصوير الديناميكي يمضي قدما في تحليل بئر تجريبي واحد في كل مرة.

6. فحص داء البلعوس، التصوير الديناميكي، اليوم الثالث

  1. قم بتشغيل نظام التصوير والكمبيوتر. انقر نقرا مزدوجا لفتح البرنامج. حدد وضع البرنامج Pro.
  2. تحقق من منطقة المرحلة للتأكد من عدم وجود عينات ولا شيء يعيق حركة المرحلة. ثم انقر على معايرة الآن.
  3. تحت قائمة الحضانة على الشريط الجانبي على اليمين، حدد المربع بجوار H Unit XL وحدده إلى 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: انتظر حتى تصبح المرحلة المحتضنة تقريبا إلى درجة الحرارة قبل إعداد العينات للتصوير.
  4. شطف البئر التجريبية الأولى مع 750 ميكرولتر من وسائط التصوير واستبداله مع 400 ميكرولتر من تعليق الجسيمات zymosan أعدت في القسم 5.2. اترك الآبار المتبقية في وسط النمو.
    ملاحظة: قد يكون من الضروري دوامة و sonicate تعليق الجسيمات مرة أخرى لفترة وجيزة إذا كان قد استقر لأكثر من 15 دقيقة.
  5. ضع الشريحة على المرحلة المحتضنة من نظام التصوير. تعيين جهاز توقيت لمدة 10 دقيقة.
  6. استخدم برنامج التصوير، وحدد Brightfield ضمن علامة التبويب تحديد موقع، ثم انقر فوق رمز العدسة في إطار تكوين النظام أدناه. مع الهدف 10x في مكان، واستخدام العدسة ومقبض التركيز للتركيز على الخلايا.
  7. حدد علامة التبويب Acquisition ، واستخدم القائمة المنسدلة Experiment ، ثم حدد مجموعة من الأطوال الموجية التي تتضمن مجموعة مرشح EGFP لاستيعاب أطوال موجية انبعاث 533 نانومتر من الصبغة الحساسة لHP لاستيعاب 509 نانومتر.
  8. عندما يكون هناك ~ 2 دقيقة اليسار على جهاز ضبط الوقت ، واستخدام البرنامج لتغيير الهدف إلى 20x عن طريق النقر على رمز 20x في القائمة الهدف.
    1. انقر على قائمة Channels ، وحدد مرشحات EGFP واستخدم قائمة التعرض لتعيين وقت التعرض إلى 400 مللي ثانية للكشف عن الفلوروفور الأخضر الحساس ل درجة الحموضة بمجرد أن يتم تضمينه في phagolysosome.
    2. انقر على لايف وضبط التركيز باستخدام مقبض التركيز.
  9. انقر على إيقاف لإيقاف تشغيل الضوء وحدد المربع بجوار الإعداد التجريبي الفاصل الزمني في الأعلى.
  10. في القائمة استراتيجية التركيز حدد التركيز التلقائي للبرامج. من القائمة المنسدلة في قائمة التركيز البؤري التلقائي، حدد الإعدادات الذكية والخشنة لتقليل وقت التعرض للضوء أثناء تشغيل التركيز البؤري التلقائي.
  11. في القائمة الفاصل الزمني، حدد العدد المطلوب من عمليات الاستحواذ إلى 30-60 ووقت الفاصل الزمني إلى دقيقة واحدة.
  12. بعد تعيين معلمات الفاصل الزمني وبعد 10 دقائق من إضافة الجسيمات إلى البئر الأول ، انقر على زر بدء التجربة لبدء الاستحواذ.
  13. عند اكتمال عملية الاستحواذ باستخدام البئر التجريبي الأول، كرر الخطوات 6.4-6.12 لكل بئر من الآبار التجريبية المتبقية.
  14. حفظ كافة ملفات التجربة مع التاريخ والمعلمات في العنوان إلى المجلد المناسب.
  15. أغلق البرنامج. أعد فتح البرنامج في وضع المعالجة واصدر الملفات بتنسيق MP4 باستخدام قائمة التصدير.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

بعد حساب متوسط ± SEM لكل مجموعة في كافة النقاط الزمنية، يتم تقديم البيانات بتنسيق الرسم البياني الخطي مع محور Y ككثافة الفلورسنت النسبية ومحور X كزين. يقدم الملف التكميلي 1 مثالا على البيانات الخام من قراءة حركية للوحة 96 جيدا في شكل جدول بيانات.

في هذه الدراسة، تظهر النتائج المثلى المقدمة في الشكل 3A، والجدول 3 أن 1) الثقافة المشتركة مع MSC يعزز النشاط البلعوي للكافر ، 2) العلاج IFN-y يقلل من نشاط الضامة ، و 3) الثقافة المشتركة م...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تحليل البلعوس باستخدام الجسيمات الحيوية المترافقة مع صبغة حساسة ل درجة الحموضة هو أداة جديدة نسبيا التي أثبتت جدواها على الجسيمات التقليدية المسمى الفلورسنت12،19،20. مع الجسيمات التقليدية ذات العلامات الفلورية ، لا يمكن إجراء سوى تحليل نقطة النهاية. يتم الكشف عن طريق المجهر الفلوري و / أو قياس الطيف بعد غسل أو إخماد الجسيمات التي لم يتم تناولها من قبل الخلايا الفرجية. البيانات الكمية المستمدة من قياس الطيف لديها القدرة على الكشف...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ولا يوجد لدى صاحبي البلاغ تضارب في المصالح يعلنانه.

شكر وتقدير

وقد دعم هذا العمل آلية أداة البحوث الرئيسية التابعة ل NSF في إطار أعداد المنح 1626093 1919583.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
96 بئر أسود البوليسترين ميكروبليتميليبورسيجماCLS3603-48EA
0.4٪ محلول تريبان أزرقMilliporeSigmaT8154-20ML
15 مل و 50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطي المعقم من مادة البولي بروبيلينThermoFisher339653
4 آبار غطاء زجاجي مع آبار غير قابلة للإزالةThermoFisher155382PK
مضاد حيوي مضاد للفطريات (100X)  GibcoThermoFisher15240096
Axiobserver 7 نظام التصويرZeiss
مصل الأبقار ألبومين (BSA)MilliporeSigmaA8806-1G
رافع الخلاياMilliporeSigmaCLS3008-100EA
قوارير الثقافة ، معالجة زراعة الأنسجة ، مساحة السطح 75 & nbsp ؛ سم < سوب>2< / سوب> ، رقبة معلقة ، مع غطاء ، مفلترMilliporeSigmaC7231-120EA
D1 ORL UVA [D1]ATCCCRL-12424Mouse MSC Cell Line
DMEM ، مصل ThermoFisher عالي الجلوكوز11965092
الأبقار الجنينية ، مؤهل ، معطل بالحرارةThermoFisher16140071
مقياس الدمFisherScientific02-671-51B
- 11.15ATCCCRL-2470الماوس M & Phi ؛ خط الخلية
LADMAC Cell LineATCCCRL-2420تفرز خلايا LADMAC عامل تحفيز مستعمرة العامل 1 (CSF-1).
محلول تصوير الخلايا الحيةThermoFisherA14291DJ
PBS ، درجة الحموضة 7.4ThermoFisher10010031
pHrodo Green Zymosan Bioparticles ContringateThermoFisherP35365
المؤتلف Murine IFN- & gamma ؛Preprotech315-05
Spectramax i3Xالجزيئية
وحدات تصفية فراغ معقمة للاستخدام الفردي ، 250 مل ، 0.2 وميكرو ؛ mThermoFisher568-0020
مرشحات حقنة معقمة ، 0.2 ميكرومترThermoFisher723-2520
أطباق ثقافة معالجة بزراعة الأنسجة ، 100 مم × 20 ممMilliporeSigmaCLS430167-100EA
Trypsin-EDTA (0.05٪) ، أحمر الفينولThermoFisher25300054
الأجهزة

المراجع

  1. Phinney, D. G., Prockop, D. J. Concise review: Mesenchymal stem/multipotent stromal cells: The state of transdifferentiation and modes of tissue repair--current views. Stem Cells. 25 (11), 2896-2902 (2007).
  2. Bernardo, M. E., Fibbe, W. E. Mesenchymal stromal cells: sensors and switchers of inflammation. Cell Stem Cell. 13 (4), 392-402 (2013).
  3. Tobin, L. M., Healy, M. E., English, K., Mahon, B. P. Human mesenchymal stem cells suppress donor CD4(+) T cell proliferation and reduce pathology in a humanized mouse model of acute graft-versus-host disease. Clinical and Experimental Immunology. 172 (2), 333-348 (2013).
  4. Giuliani, M., et al. Long-lasting inhibitory effects of fetal liver mesenchymal stem cells on T-lymphocyte proliferation. PLoS One. 6 (5), 19988(2011).
  5. Plumas, J., Chaperot, L., Richard, M. J., Molens, J. P., Bensa, J. C., Favrot, M. C. Mesenchymal stem cells induce apoptosis of activated T cells. Leukemia. 19 (9), 1597-1604 (2005).
  6. Luz-Crawford, P., et al. Mesenchymal stem cells generate a CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cell population during the differentiation process of Th1 and Th17 cells. Stem Cell Research & Therapy. 4 (3), 65(2013).
  7. Waterman, R. S., Tomchuck, S. L., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. A new mesenchymal stem cell (MSC) paradigm: Polarization into a pro-inflammatory MSC1 or an Immunosuppressive MSC2 phenotype. PLoS One. 5 (4), 10088(2010).
  8. Nemeth, K., et al. marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their Interleukin-10 production. Nature Medicine. 15 (1), 42-49 (2009).
  9. Maggini, J., et al. Mouse Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells Turn Activated Macrophages into a Regulatory-Like Profile. PLoS One. 5 (2), 9252(2010).
  10. Takizawa, N., et al. marrow-derived mesenchymal stem cells propagate immunosuppressive/anti-inflammatory macrophages in cell-to-cell contact-independent and-dependent manners under hypoxic culture. Experimental Cell Research. 358 (2), 411-420 (2017).
  11. Kim, J., Hematti, P. Mesenchymal stem cell-educated macrophages: a novel type of alternatively activated macrophages. Experimental Hematology. 37 (12), 1445-1453 (2009).
  12. Evans, J. F., Salvador, V., George, S., Trevino-Gutierrez, C., Nunez, C. Mouse aorta-derived mesenchymal progenitor cells contribute to and enhance the immune response of macrophage cells under inflammatory conditions. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 56(2015).
  13. Cho, D. I., et al. Mesenchymal stem cells reciprocally regulate the M1/M2 balance in mouse bone marrow-derived macrophages. Experimental Molecular Medicine. 46, 70(2014).
  14. Fernandez, N., et al. Mouse mesenchymal progenitor cells expressing adipogenic and osteogenic transcription factors suppress the macrophage inflammatory response. Stem Cells International. 2017, 5846257(2017).
  15. Jackson, M. V., et al. Mitochondrial transfer via tunneling nanotubes is an important mechanism by which mesenchymal stem cells enhance macrophage phagocytosis in the in vitro and in vivo models of ARDS. Stem Cells. 34 (8), 2210-2223 (2016).
  16. Chaplin, D. D. Overview of the immune response. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (2), Suppl 2 3-23 (2010).
  17. Lim, J., et al. Characterizing the mechanisms of nonopsonic uptake of cryptococci by macrophages. Journal of Immunology. 200 (10), 3539-3546 (2018).
  18. Wang, Z., et al. Interferon-γ inhibits nonopsonized phagocytosis of macrophages via an mTORC1-c/EBP pathway. Journal of Innate Immunity. 7 (2), 165-176 (2015).
  19. Lindner, B., Burkard, T., Schuler, M. Phagocytosis assays with different PH-sensitive fluorescent particles and various readouts. Biotechniques. 68, 245-250 (2020).
  20. Kapellos, T. S., et al. A novel real time imaging platform to quantify macrophage pahgocytosis. Biochemical Pharmacology. 116, 107-119 (2016).
  21. Takahashi, D., et al. Flow cytometric quantitation of platelet phagocytosis by monocytes using a pH-sensitive dye, pHrodo-SE. Journal of Immunological Methods. 447, 57-64 (2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الخلايا الجذعية الميزنكيميةطريقة الزراعة المشتركةالمناعة الفطريةمقايسة البلعمةجزيئات الزيموزانالتصوير الفلوريإنترفيرون غاماعد الخلايافلورة الجسيم البلعومي lysosome
تنظيم الخلايا الجذعية Mesenchymal من البلعم البلعمي; الكمية والتصوير
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.