يقدم هنا بروتوكول لتحديد وإنتاج صور ديناميكية للخلايا الجذعية الوسيطة (MSC) لتنظيم البلعمة الضامة (MΦ) من جزيئات الخميرة غير opsonized (zymosan) التي يتم اقترانها بجزيء فلوري حساس ل درجة الحموضة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تنظيم الخلايا الجذعية Mesenchymal من البلعم البلعمي; الكمية والتصوير
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تمت دراسة الخلايا الجذعية الميزنشيمالية (MSC) تقليديا لخصائصها التجديدية ، ولكن في الآونة الأخيرة ، كانت خصائصها المناعية في المقدمة. وهي تتفاعل مع نشاط الخلايا المناعية وتنظمه. ينصب تركيز هذه الدراسة على تنظيم MSC للنشاط البلعوي الضام. الضامة (MΦ) البلعومي هو جزء مهم من استجابة الجهاز المناعي الفطرية للعدوى ، والآليات التي من خلالها تعدل MSC هذه الاستجابة قيد التحقيق النشط. هنا هو وسيلة لدراسة MΦ phagocytosis من الجسيمات غير opsonized zymosan المقترنة جزيء الفلورسنت الحساسة ل درجة الحموضة بينما في الثقافة المشتركة مع MSC. مع زيادة النشاط البلعوسي وانسداد جزيئات الزيموسان المسماة داخل البيئة الحمضية للفسوسوم ، تزداد كثافة الفلورية للجزيء الحساس ل درجة الحموضة. مع الإثارة المناسبة والأطوال الموجية للانبعاثات ، يتم قياس النشاط البلعوسي باستخدام مطياف فلوري ويتم تقديم البيانات الحركية كتغيرات في وحدات الفلورسنت النسبية على مدى فترة 70 دقيقة. ولدعم هذه البيانات الكمية، يتم تصور التغير في النشاط البلعوي باستخدام التصوير الديناميكي. تظهر النتائج باستخدام هذه الطريقة أنه عندما تكون في الثقافة المشتركة ، تعزز MSC الفوسفات MΦ من zymosan غير opsonized من كل من السذاجة وIFN-γ تعامل MΦ. هذه البيانات إضافة إلى المعرفة الحالية لتنظيم MSC من الجهاز المناعي الفطري. ويمكن تطبيق هذه الطريقة في التحقيقات المستقبلية لتحديد الآليات الخلوية والجزيئية الأساسية بشكل كامل.
المقدمة
الخلايا الجذعية الميكنشيمالية (MSC) هي خلايا سلفية تؤدي إلى خلايا النسيج الضام. MSC موجودة في أنسجة الثدييات الكبار ويمكن عزلها عن نخاع العظام1. بسبب خصائصها المناعية ، تتم دراسة هذه الخلايا على نطاق واسع2. الدراسات المبكرة التي ركزت على تنظيم MSC من الخلايا التائية3،4،5،6 ولكن في الآونة الأخيرة ، وتنظيمها للخلايا الضامة (MΦ) ، وهو عنصر خلوي رئيسي من الحصانة الفطرية ، وقد تلقت اهتماما متزايدا7،8،9....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: يتم تنفيذ جميع تقنيات الإعداد المتوسط وزراعة الخلايا في ظل ظروف مطهرة باستخدام خزانة السلامة البيولوجية مع تدفق الصفيحة. يتم تنفيذ جميع خطوات حضانة الثقافة الموصوفة باستخدام حاضنة مصممة للحفاظ على جو من 37 درجة مئوية و 5٪ CO2و 95٪ رطوبة.
1. ثقافة الخلية
- إعداد متوسط النمو
- بالنسبة إلى MSC و LADMAC، أضف 50 مل من FBS و5 مل من مزيج المضادات الحيوية/مضادات الميكويك 100x إلى 500 مل من DMEM عالي الجلوكوز.
- بالنسبة إلى MΦ، أضف 50 مل من FBS، و100 مل من وسيط حالة LADMAC (تم إعداده باتباع خطوات القسم 1.2)، و5 مل من مزيج المضادات الحيوية 100x إلى 500 مل من DMEM عالي الجلوكوز.
ملاحظة: تنتج خلايا LADMAC عا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
بعد حساب متوسط ± SEM لكل مجموعة في كافة النقاط الزمنية، يتم تقديم البيانات بتنسيق الرسم البياني الخطي مع محور Y ككثافة الفلورسنت النسبية ومحور X كزين. يقدم الملف التكميلي 1 مثالا على البيانات الخام من قراءة حركية للوحة 96 جيدا في شكل جدول بيانات.
في هذه الدراسة، تظهر النتائج المثلى المقدمة في الشكل 3A، والجدول 3 أن 1) الثقافة المشتركة مع MSC يعزز النشاط البلعوي للكافر ، 2) العلاج IFN-y يقلل من نشاط الضامة ، و 3) الثقافة المشتركة م.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تحليل البلعوس باستخدام الجسيمات الحيوية المترافقة مع صبغة حساسة ل درجة الحموضة هو أداة جديدة نسبيا التي أثبتت جدواها على الجسيمات التقليدية المسمى الفلورسنت12،19،20. مع الجسيمات التقليدية ذات العلامات الفلورية ، لا يمكن إجراء سوى تحليل نقطة النهاية. يتم الكشف عن طريق المجهر الفلوري و / أو قياس الطيف بعد غسل أو إخماد الجسيمات التي لم يتم تناولها من قبل الخلايا الفرجية. البيانات الكمية المستمدة من قياس الطيف لديها القدرة على الكشف.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ولا يوجد لدى صاحبي البلاغ تضارب في المصالح يعلنانه.
شكر وتقدير
وقد دعم هذا العمل آلية أداة البحوث الرئيسية التابعة ل NSF في إطار أعداد المنح 1626093 1919583.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 96 بئر أسود البوليسترين ميكروبليت | ميليبورسيجما | CLS3603-48EA | |
| 0.4٪ محلول تريبان أزرق | MilliporeSigma | T8154-20ML | |
| 15 مل و 50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطي المعقم من مادة البولي بروبيلين | ThermoFisher | 339653 | |
| 4 آبار غطاء زجاجي مع آبار غير قابلة للإزالة | ThermoFisher | 155382PK | |
| مضاد حيوي مضاد للفطريات (100X) Gibco | ThermoFisher | 15240096 | |
| Axiobserver 7 نظام التصوير | Zeiss | ||
| مصل الأبقار ألبومين (BSA) | MilliporeSigma | A8806-1G | |
| رافع الخلايا | MilliporeSigma | CLS3008-100EA | |
| قوارير الثقافة ، معالجة زراعة الأنسجة ، مساحة السطح 75 & nbsp ؛ سم < سوب>2< / سوب> ، رقبة معلقة ، مع غطاء ، مفلتر | MilliporeSigma | C7231-120EA | |
| D1 ORL UVA [D1] | ATCC | CRL-12424 | Mouse MSC Cell Line |
| DMEM ، مصل ThermoFisher عالي الجلوكوز | 11965092 | ||
| الأبقار الجنينية ، مؤهل ، معطل بالحرارة | ThermoFisher | 16140071 | |
| مقياس الدم | FisherScientific | 02-671-51B | |
| - 11.15 | ATCC | CRL-2470 | الماوس M & Phi ؛ خط الخلية |
| LADMAC Cell Line | ATCC | CRL-2420 | تفرز خلايا LADMAC عامل تحفيز مستعمرة العامل 1 (CSF-1). |
| محلول تصوير الخلايا الحية | ThermoFisher | A14291DJ | |
| PBS ، درجة الحموضة 7.4 | ThermoFisher | 10010031 | |
| pHrodo Green Zymosan Bioparticles Contringate | ThermoFisher | P35365 | |
| المؤتلف Murine IFN- & gamma ؛ | Preprotech | 315-05 | |
| Spectramax i3X | الجزيئية | ||
| وحدات تصفية فراغ معقمة للاستخدام الفردي ، 250 مل ، 0.2 وميكرو ؛ m | ThermoFisher | 568-0020 | |
| مرشحات حقنة معقمة ، 0.2 ميكرومتر | ThermoFisher | 723-2520 | |
| أطباق ثقافة معالجة بزراعة الأنسجة ، 100 مم × 20 مم | MilliporeSigma | CLS430167-100EA | |
| Trypsin-EDTA (0.05٪) ، أحمر الفينول | ThermoFisher | 25300054 |
المراجع
- Phinney, D. G., Prockop, D. J. Concise review: Mesenchymal stem/multipotent stromal cells: The state of transdifferentiation and modes of tissue repair--current views. Stem Cells. 25 (11), 2896-2902 (2007).
- Bernardo, M. E., Fibbe, W. E.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
