استخراج _F420 عامل مساعد لتحليل طول ذيل Polyglutamate من الثقافات النقية الميثانوجينية والعينات البيئية

_F420 هو عامل مساعد واسع الانتشار ولكنه مهمل في كثير من الأحيان ، والذي يعمل كحامل هيدريد إلكترونين ملزم في عمليات التمثيل الغذائي الأولية والثانوية لكل من Archaea و Bacteria1^،2. _F420 هو 5-deazaflavin ويشبه هيكليا فلافينس، حيث خصائصه الكيميائية والبيولوجية هي أكثر قابلية للمقارنة مع تلك التي NAD ⁺ أو NADP ⁺. بسبب استبدال النيتروجين مع الكربون في موقف 5 من حلقة ايزالوكسازين، بل هو اختزال قوي، وبالتالي تظهر إمكانات الأكسدة القياسية منخفضة من -340 ^mV1،3. _F420 يتكون من حلقة 5-deazaflavin و2-فوسفو-L-لاكتات رابط (_F420-0). يمكن إرفاق ذيل oligoglutamate الذي يحتوي على مونومرات الغلوتامات n+1 بالجزيء (_F420-n+1)⁴.

لفترة طويلة، ارتبط العامل المساعد _F420 فقط مع Archaea وActinobacteria. وقد انقلب هذا إلى حد كبير. كشفت التحليلات الحديثة أن _F420 يتم توزيعها بين الكائنات اللاهوائية والهوائية المتنوعة من فيلا بروتيوبكتيريا، كلوروفليكسي، وربما Firmicutes التي تسكن عددا لا يحصى من الموائل مثل التربة والبحيرات، والأمعاء ^{البشرية1،5}. في عام 2019 ، أظهر Braga et ^al.6 ، أن البروتيوباكتيريوم Paraburkholderia rhizoxinica ينتج مشتق _F420 فريد من نوعه ، يحتوي على 3 فوسفوغليسيرات بدلا من ذيل 2 فوسفولاكت ، والذي قد يكون واسع الانتشار في موائل مختلفة. داخل مجال Archaea، تم العثور على _F420 في عدة أنساب، بما في ذلك ميتانوجينيك7، ميتانوتروبيك8^،9، وأوامر خفض ^{الكبريتات10}، ومن المفترض أن يتم إنتاجها في Thaumarchaeota11. ومن المعروف _F420 كما انزيم الأكسدة الأساسية في هيدروجينوتروبيك والميثيلوتروبيك ميتانوجينيسيس. يعمل الشكل المنخفض من _F420 (_F420H2) كمتبرع إلكترون للحد من الميثيلينتيتراهيدروميثانوبتيرين (ميثيلين-H4MPT، مير) والميثنيل-H4MPT12,13. ويمكن أيضا أن تستخدم كناقل إلكترون في مسارات نقل الإلكترونات المستقلة _H2 من الميثانوجينات التي تحتوي على ^{السيتوكروم12,14}. وعلاوة على ذلك، فإن الشكل المؤتأكسد من _F420 له مضان أزرق وأخضر مميز عند الإثارة عند 420 نانومتر، مما يسهل الكشف عن الميثانوجينات مجهريا (الشكل 1). نظرا لانخفاض إمكانات الأكسدة ، يسهل _F420 (1) التخفيض الخارجي طيف واسع من المركبات العضوية المتمردة أو السامة ، '2' تركيب المضادات الحيوية التتراسيكلين واللينكوساميد أو السموم النباتية في الستربتوميسيتات (فيلوم أكتينوباكتيريا)، و'3' مقاومة الإجهاد التأكسدي أو النيتروزيفي أو غيرها من الظروف غير المواتية في البكتيريا الفطرية (فيلوم أكتينوباكتيريا)^1،5،15، 16,17,18,19,20,21,22. وبالتالي، تعد الاكسيدuctases المعتمدة على _F420 بالمواد الحيوية الواعدة للأغراض الصناعية والصيدلانية وكذلك للمعالجة البيولوجية للبيئات ^{الملوثة1،23}. على الرغم من هذه النتائج الأخيرة ، فإن الأدوار الدقيقة للمتبرع المساعد _F420 لا تزال معروفة بشكل هامشي في Actinobacteria أو الفيلا البكتيرية الأخرى.

هناك ما لا يقل عن ثلاثة مسارات _لF420 التمثيل ^{الحيوي2،6،24}. في البداية ، يتم تقسيم مسار التمثيل الحيوي إلى التمثيل الحيوي 5-deazaflavin وفرع التمثيل الغذائي 2-phospholactate. يتم تصنيع الجزء التفاعلي من جزيء _F420 عن طريق _FO-synthase باستخدام التيروزين الركيزة و5-amino-6-ribitylamino-2,4 (1H, 3H)-pyrimidinedione. والنتيجة هي مستوى الريبوفلافين كروموفور _FO. داخل فرع التمثيل الغذائي لللاكتات المقبول حاليا، L-lactate هو الفوسفور إلى 2-فوسفو-L-اللاكتات بواسطة كيناز L-لاكتات (CofB)؛ 2-فوسفو-L-لاكتات، بدوره، هو guanylated إلى L-lactyl-2-diphospho-5'-guanosine بواسطة 2-فوسفو-L-لاكتات جوانيليلترانسفيراز (CofC). في الخطوة التالية، يرتبط L-lactyl-2-diphospho-5'-guanosine إلى _FO عن طريق نقل 2-فوسفو-L-لاكتات (CofD) لتشكيل _F420-02. وأخيرا، فإن إنزيم _F420-0:ɣ-الجلوتاميل ليجاز (CofE) ليغامات مونومرات إلى _F420-0، وتشكيل المساعد ^{النهائي6} في أرقام مختلفة23^،25. تظهر الكائنات الحية المختلفة أنماطا مختلفة في عدد بقايا الغلوتامات المرفقة ، مع ذيول أقصر وجدت للميثانوجينات مما كانت عليه في البكتيريا ^{الفطرية2،25،26}. عموما، تظهر methanogens أطوال الذيل من اثنين إلى ثلاثة، مع ما يصل إلى خمسة في ميثانوجين الأسيتوكلاستيك، ميثانوساركينا sp.، في حين أن أطوال الذيل وجدت في Mycobacterium sp. تراوحت بين خمسة إلى سبعة بقايا الغلوتامات2^،25،26،27. ومع ذلك، أظهرت النتائج الأخيرة أن سلسلة طويلة _F420 يربط إلى oxidoreductases _F420 تعتمد مع تقارب أعلى من _F420 سلسلة قصيرة؛ وعلاوة على ذلك، ملزمة سلسلة طويلة _F420 يزيد من تقارب الركيزة ولكن يقلل من معدل دوران الإنزيمات ^{المعنية23}.

غالبا ما يعتمد الكشف عن _F420 المساعد على مضانه. وبالتالي، تم فصل مشتقات الغلوتامات الأوليغو باستخدام المرحلة المعكوسة (RP) -^HPLC27,28. في الآونة الأخيرة، استخدم Ney وآخرون هيدروكسيد رباعي البوتيلامونيوم ككواشف اقتران أيون لذيل الغلوتامات المشحون سلبيا لتعزيز الفصل على RP-HLPC ^بنجاح5. هنا، نقدم طريقة لإعداد العينات، وتحلل لاحق، واستخراج، وتنقية، وفصل، وتكميم _F420 عامل مساعد ليس فقط من الثقافات النقية ولكن أيضا من عينات بيئية مختلفة (أي التربة والحمأة هاضم).

ملاحظة: استخراج وتحليل _F420 عامل مساعد هو عملية من ثلاث خطوات بما في ذلك تحلل العينة، مساعد قبل تنقية عن طريق استخراج المرحلة الصلبة (SPE)، والكشف عن عامل مساعد عن طريق أيون-يقترن-RP-HPLC (IP-RP-HPLC) مع الكشف عن الفلورية. قبل البدء، قم بإعداد المواد والكواشف كما هو مذكور في الجدول 1.

1. تحلل العينة

1. إضافة ما يصل إلى 5 غرام من العينة إلى أنابيب مناسبة (على سبيل المثال، 50 مل أنابيب مخروطية).
2. إضافة 5 مل من المخزن المؤقت تحلل (2x حل المخزون، الجدول 1) إلى العينات.
3. أحضر إلى الحجم النهائي من 10 مل مع الماء المقطر للوصول إلى تركيز نهائي من 0.5 غرام · ^مل-1.
4. دوامة العينات المخففة لمدة 20 s.
5. الأوتوكلاف لمدة 30 دقيقة عند 121 درجة مئوية.
6. لعينات جافة مثل التربة الحرجية، وجلب إلى حجم النهائي من 20 مل مع الماء المقطر بعد autoclaving ودوامة العينة المخففة.
   تنبيه: قد تؤدي زيادة درجة الحرارة أثناء الالاستعباد التلقائي إلى انفجار الأنابيب.

2. قبل تنقية عامل مساعد F ₄₂₀ عن طريق استخراج المرحلة الصلبة (SPE)

ملاحظة: يتم إجراء جميع الخطوات من SPE في درجة حرارة الغرفة

1. تهدئة العينات لدرجة حرارة الغرفة.
2. الطرد المركزي عينات autoclaved لمدة 5 دقائق في 11000 x ز.
3. إعداد 5 مل أعمدة SPE مليئة 100 ملغ من أنيون ضعيف مختلطة وضع البوليمرية ماصة.
4. شرط مبادل أنيون مع 3 مل من الميثانول (حل الشرط، الجدول 1).
5. إعادة توازن مبادلة أنيون مع 3 مل من الماء المقطر (حل التوازن، الجدول 1).
6. تحميل ما يصل إلى 9.0 مل من supernatant من lysate الطرد المركزي على العمود SPE.
7. غسل الشوائب مع 5 مل من خلات الأمونيوم 25 mM (SPE غسل الحل 1، الجدول 1).
8. غسل الشوائب مع 5 مل من الميثانول (SPE غسل الحل 2، الجدول 1).
9. Elute عامل _F420 المساعد في 1.0 مل من المخزن المؤقت elution (الجدول 1).
   ملاحظة: تحضير المخزن المؤقت elution جديدة. بسبب الفراغ المطبق وضغط البخار العالي لحاجز الغضوء ، قد تختلف أحجام الغضوء من عينة إلى عينة. من أجل تأمين نفس الحجم النهائي في جميع العينات ، يوصى بوزن سفن التجميع قبل وبعد الوضوء وحساب حجم elution الفعال. موازنة الاختلافات بإضافة المخزن المؤقت elution.

3. الكشف عن _F420 مساعد

1. تعيين الفرن إلى 40 درجة مئوية وكاشف مضان إلى 420 نانومتر الانقراض الطول الموجي و 470 نانومتر الانبعاثات الطول الموجي. تحقيق الفصل عبر وضع التدرج باستخدام المرحلتين المتنقلتين A و B (الجدول 1): 0-3 دقيقة: 26٪ B؛ 3-24 دقيقة: 26٪ -50٪ B؛ 24-25 دقيقة: 50٪ ب; 25-27 دقيقة: 50٪ -26٪ B؛ 27-35 دقيقة: 26٪ ب بمعدل تدفق 0.75 مل·^دقيقة-1.
   ملاحظة: ضمان توازن ظروف العمود قبل حقن العينات عن طريق مسح العمود على الأقل بأحجام عمود 3 من المرحلة المتنقلة A بنسبة 74٪ والمرحلة B المتنقلة بنسبة 26٪ (الجدول 1).
   1. تصفية العينات eluted من SPE إلى قوارير HPLC باستخدام مرشح PTFE مع حجم المسام من 0.22 ميكرومتر.
      ملاحظة: يوصى بفلاتر PTFE بحجم مسام 0.22 ميكرومتر.
   2. حقن 50 ميكرولتر من العينة المتبلورة على نظام HPLC لتحليل تكوين _F420 المساعد وتركيزه.
      ملاحظة: بما أنه لا يوجد معيار كمي مستخدم في هذا البروتوكول، يجب مقارنة العينات والمتغيرات حسب منطقة الذروة.

نمت الثقافات النقية من ميتانوساركينا ثيرموفيليا وميثانوكاليوس ثيرموفيليوس، وكلاهما حرارة ميتانوجينيك Archaea، في وسائل الإعلام المناسبة كما هو موضح سابقا29،30. وبالنسبة لميثانوسارسينا ثيرموفيليا، استخدم الميثانول كمصدر للطاقة، في حين أن ميثانوكوليوس ثيرموفيليوس كان يزرع على H2/CO2. وتم فحص النمو عن طريق التقييم المجهري، في حين تم فحص النشاط عن طريق قياس الميثان (CH4) عن طريق كروماتوغرافيا الغاز كما هو موضح سابقا31. استخدمت الثقافات النقية لاستخراج F420 عامل مساعد وفقا للبروتوكول المقدم. وبالإضافة إلى ذلك، أخذت عينات بيئية تشمل عينات من حمأة مفاعل للغاز الحيوي من نوع ميسوفليك (محطة معالجة مياه الصرف الصحي، زيرل، النمسا؛ للحصول على تفاصيل بشأن بارامترات الحمأة، يرجى الرجوع إلى 32)، يستخدم زراعيا (إنسبروك، النمسا)، والتربة الحرجية (لانس، النمسا) في خريف عام 2020 لاستخراج وتحليل العوامل المشاركة F420.

وقد تم التحقق من نمو الثقافات النقية عن طريق المجهر (الشكل 1)، مع تحليل الميثان المنتج عن طريق الكروماتوغرافيا الغازية خلال 14 يوما من الحضانة (البيانات غير مبينة). تم اختبار كفاءة استخراج F420 عامل المساعدة من الثقافات النقية من خلال تطبيق استراتيجيات التفكك المختلفة: ضرب الضرب باستخدام 0.5-1.0 ملم يدق السيراميك، والعلاج بالموجات فوق الصوتية، وتفكك درجة حرارة الضغط باستخدام 121 درجة مئوية و 1.2 ضغط شريط (autoclaving). وأصبحت الكفاءة القصوى للاستخراج واضحة باستخدام معالجة الضغط بدرجة الحرارة التي تطبق حاجزا على النحو المبين في قسم البروتوكول، وبالتالي تم تطبيقها كذلك على جميع التجارب اللاحقة (الشكل 2). تم إجراء اختبارات كفاءة الاستخراج عن طريق إضافة قياسية لأحجام مختلفة من ثقافة ميتانوكوليوس الحرارية المتنامية بشكل جيد. وعلاوة على ذلك، استندت مقارنة العينات والمتغيرات المختلفة إلى منطقة الذروة من الكروماتوجرامات.

وفي وقت لاحق، خضعت مستخلصات الخلايا لإجراء استخراج المرحلة الصلبة (SPE). لهذا الغرض، تم اختبار مبادلات أيونية مختلفة. اتضح أن مادة ماصة بوليميراية ضعيفة ذات وضع مختلط أنيون أسفرت عن أعلى كمية من F420 cofactor بعد elution. وبالإضافة إلى ذلك، تم اختبار مخازن elution مختلفة وحلول الغسيل وأظهرت أفضل النتائج لخلات الأمونيوم 25 mm كحاجز غسل وخليط من NH3 في الميثانول كمخزن مؤقت elution. يمكن تبادل الميثانول من خطوة elution بعد الوضوء بالماء عن طريق معالجة درجة الحرارة الفراغية.

تم اختبار تحليل HPLC ل F420 المساعد مع أعمدة C18 مختلفة مع أفضل النتائج لتكوين النظام الذي تحقق خلال الدراسة المقدمة مع عمود NX C18. واستخدم معيار يحتوي على توزيع معروف لمشتقات F420 ذات طول ذيل الغلوتامات المتفاوت لأغراض مرجعية. وقد تكرم البروفيسور كولين جاكسون من الجامعة الوطنية الأسترالية بتقديم هذا المعيار. وكشف تحليل طول ذيل الغلوتامات عن اختلافات في التركيز الكلي للمتبرع المساعد F420 وتوزيع طول ذيل F420 من الثقافات النقية الميثانوجينية والعينات البيئية (الشكل 3).

الجدول 1: تكوين المرحلة العازلة والمتنقلة لاستخراج المرحلة الصلبة (SPE) وتحليل HPLC. 

الشكل 1: الثقافة النقية الميثانوجينية الفلورية. تصور ميتانوساركينا thermophila عبر (A) المرحلة النقيض المجهر وعبر (B) المجهر الفلوري عندما متحمس F420 مساعد مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية (الإثارة في 395-440 نانومتر والانبعاثات في 475-495 نانومتر). شريط المقياس: 10 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: الإضافة القياسية. منطقة الذروة من F420 مساعد تعافى بعد SPE من 1.0 غرام من مصفوفة ارتفعت مع أحجام مختلفة من الثقافات M. thermophilus . تم تعديل ماتريكس مع 0 ميكرولتر، 250 ميكرولتر، 500 ميكرولتر، 750 ميكرولتر، و 1000 ميكرولتر من الثقافة وخضع لاستراتيجيات تفكك مختلفة: الضرب بالضربات، والعلاج بالموجات فوق الصوتية، وتفكك درجة حرارة الضغط (الالاستعباد التلقائي). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: توزيع طول ذيل الغلوتامات. عامل مساعد F420 توزيع طول الذيل من الثقافات النقية والعينات البيئية. من أعلى إلى أسفل: المستخدمة زراعيا (التربة)، والغابات (التربة)، ومفاعل الغاز الحيوي mesophilic، والثقافة النقية من M. thermophilus، والثقافة النقية من M. thermophila. تم حساب الامتصاص النسبي عن طريق التطبيع على أعلى قمة داخل الرسم اللوني المعروض. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.