هنا ، نقدم بروتوكولا لإجراء الضربات القاضية الجينية القاتلة جنينيا في الجسم الحي في الأورام المشتقة من نموذج الفئران المهندسة وراثيا ، ثم تقييم تأثير الضربة القاضية على نمو الورم ، والانتشار ، والبقاء على قيد الحياة ، والهجرة ، والغزو ، والنسخ في المختبر وفي الجسم الحي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تحديد وظائف الجينات في تكوين الأورام عن طريق الاستئصال خارج الجسم الحي للأليلات المفلطحة في الخلايا السرطانية الخبيثة للغمد العصبي المحيطي
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
إن تطوير عقاقير جديدة تستهدف بدقة البروتينات الرئيسية في السرطانات البشرية يغير بشكل أساسي علاجات السرطان. ومع ذلك ، قبل استخدام هذه الأدوية ، يجب التحقق من صحة البروتينات المستهدفة كأهداف علاجية في أنواع محددة من السرطان. غالبا ما يتم إجراء هذا التحقق من الصحة عن طريق ضرب الجين الذي يشفر الهدف العلاجي المرشح في نموذج الفأر المعدل وراثيا (GEM) للسرطان وتحديد تأثير ذلك على نمو الورم. لسوء الحظ ، فإن القضايا التقنية مثل الفتك الجنيني في الضربات القاضية التقليدية والفسيفساء في الضربات القاضية المشروطة غالبا ما تحد من هذا النهج. للتغلب على هذه القيود ، تم تطوير نهج لاستئصال جين قاتل جنيني مفلطخ يهتم بالثقافات قصيرة الأجل لأورام غمد الأعصاب الطرفية الخبيثة (MPNSTs) المتولدة في نموذج GEM.
تصف هذه الورقة كيفية إنشاء نموذج فأر بالنمط الوراثي المناسب ، واشتقاق مزارع الورم قصيرة الأجل من هذه الحيوانات ، ثم القضاء على الجين القاتل الجنيني المفلطح باستخدام ناقل فيروسي غدي يعبر عن Cre recombinase وبروتين الفلورسنت الأخضر المعزز (eGFP). ثم يتم تفصيل تنقية الخلايا المحولة بالفيروس الغدي باستخدام فرز الخلايا المنشط بالفلور (FACS) وتحديد كمية التأثيرات التي يمارسها الاستئصال الجيني على الانتشار الخلوي ، والجدوى ، و transcriptome ، ونمو allograft التقويمي. توفر هذه المنهجيات نهجا فعالا وقابلا للتعميم لتحديد الأهداف العلاجية والتحقق من صحتها في المختبر وفي الجسم الحي. توفر هذه الأساليب أيضا مصدرا متجددا للخلايا المشتقة من الورم منخفض المرور مع انخفاض في القطع الأثرية للنمو في المختبر . وهذا يسمح بدراسة الدور البيولوجي للجين المستهدف في عمليات بيولوجية متنوعة مثل الهجرة والغزو والانبثاث والتواصل بين الخلايا بوساطة الإخفاق.
المقدمة
قبل العقدين الماضيين، كان علاج السرطانات البشرية يعتمد بشكل كبير على العلاج الإشعاعي وعوامل العلاج الكيميائي التي استهدفت على نطاق واسع السكان الخلويين الذين ينتشرون بسرعة عن طريق إتلاف الحمض النووي أو تثبيط تخليق الحمض النووي. على الرغم من أن هذه الأساليب تمنع نمو الخلايا السرطانية ، إلا أنها كانت لها أيضا آثار جانبية ضارة على أنواع الخلايا الطبيعية سريعة التكاثر مثل الخلايا الظهارية المعوية وخلايا بصيلات الشعر. في الآونة الأخيرة ، بدأ علاج السرطان في استخدام عوامل العلاج الكيميائي التي تستهدف بدقة البروتينات ضمن مسارات الإشارات التي تعتبر مهمة للغاية لنمو أورام المريض الفردية. وقد أدى هذا النهج ، الذي يشار إليه عادة باسم "الطب الدقيق" ، إلى تطوير ذخيرة دائمة التوسع ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
قبل تنفيذ أي إجراءات مع الفئران ، يجب مراجعة جميع الإجراءات والموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها. تمت الموافقة على البروتوكول الموصوف في هذه المخطوطة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية التابعة لجامعة ساوث كارولينا الطبية. تم تنفيذ هذا البروتوكول من قبل موظفين مدربين بشكل صحيح وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية لرعاية الحيوانات في MUSC.
1. جيل من الفئران التي تطور MPNSTs متماثلة الزيجوت لأليلات Erbb4 flox
- إنتاج جيل F1 من P 0-GGFβ3 ؛ Trp53+/-; Erbb4fl / + الحيوانات عن طريق التزاوج P 0-GGFβ3 ؛ Trp53
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يوضح الشكل 4 نتيجة نموذجية تم الحصول عليها عند تحويل P 0-GGFβ3 ؛ Trp53-/+ ؛ خلايا Erbb4 fl / fl MPNST إما مع الفيروس الغدي Ad5CMV-eGFP أو الفيروس الغدي Ad5CMV-Cre / eGFP (الشكل 4A). يتم النظر إلى الثقافات باستخدام المجهر الفلوري لتحديد الخلايا المعبرة عن eGFP وبواسطة المجهر المتباين الطوري لتحديد العدد الإجمالي للخلايا الموجودة في نفس المجال عند 10x (أعلى) و 40x (أسفل). يمكن بعد ذلك حساب النسبة المئوية للخلايا ا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تم تطوير الطرق التفصيلية المعروضة هنا باستخدام نموذج GEM من MPNSTs. ومع ذلك ، إذا كان من الممكن تشتيت أنسجة الورم ذات الأهمية إلى خلايا فردية ، فإن هذه المنهجيات قابلة للتكيف بسهولة مع أنواع الأورام المختلفة الناشئة في GEMs. من المهم التأكد من أن الأليل المفلطح لا يؤدي إلى i) انخفاض البقاء على قيد الحياة الذي يمكن أن يجعل من الصعب الحصول على ما يكفي من الفئران للكشف عن الأورام ، أو ii) زيادة زمن انتقال الورم الذي يمكن أن يجعل من الصعب الحصول على ما يكفي من الفئران الحاملة للورم. إذا لم يؤثر الأليل المفلطح على البقاء على .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من خلال منح من المعهد الوطني للأمراض العصبية والسكتة الدماغية (R01 NS048353 ، R01 NS109655) ، والمعهد الوطني للسرطان (R01 CA122804) ، ووزارة الدفاع (X81XWH-09-1-0086 ، W81XWH-11-1-0498 ، W81XWH-12-1-0164 ، W81XWH-14-1-0073 ، و W81XWH-15-1-0193) ، ومؤسسة أورام الأطفال (2014-04-001 و 2015-05-007).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Ad5CMV-eGFP | نواقل ناقل نقل الجينات ، جامعة ولاية أيوا | VVC-U من ولاية أيوا | |
| Ad5CMVCre-eGFP | الجينات ، جامعة أيوا | VVC-U من ولاية أيوا -1174 | |
| اليكسا 568 الجسم المضاد الثانوي | Thermo / Fisher | GaR A11036 | |
| برنامج مفتوح المصدر للموصل الحيوي لمعلوماتية Bioninformatics | http://www.bioconductor.org | أداة التحليل الإحصائي البديلة المستخدمة للخطوة 4.4 | |
| CD31 | Abcam | ab28364 | |
| مقياس الخلايا Celigo Image Cellular | Tمقياس Nexcelom Bioscience | N / A | |
| Cell Stripper | Corning | 25-056-Cl | خليط من المخلبات |
| مجموعة تلطيخ DAB | Vector Labs | MP-7800 | |
| DAVID (قاعدة بيانات للتعليق التوضيحي والتصور والاكتشاف المتكامل) | DAVID | https://david.ncifcrf.gov | برنامج تحليل التخصيب الوظيفي المستخدم في الخطوة 4.5 |
| DMEM | Corning | 15-013-Cl | |
| DreamTaq and Buffer (التنميط الجيني PCR) | الأجسام المضادة Thermo / Fisher | EP0701 و K1072 | |
| erbB4 الأجسام المضادة | سانتا كروز | sc-284 | |
| erbB4 | Abcam | ab35374 | |
| erbB4 الأجسام المضادة | Millipore | HFR1: 05-1133 | |
| FACS Sorter | BD Biosciences Aria | II | |
| Forskolin | Sigma | F6886 | |
| GenomeSpace أدوات ومصادر البيانات | GenomeSpace | https://genomespace.org/support/tools/ | مورد عام لعدة أنواع من أدوات المعلوماتية الحيوية مفتوحة المصدر للخطوة 4.5 |
| الجلوتامين | كورنينج | 25-005- | |
| Gorilla Gene Ontology enRIchment anaLysis and visuaLizAtion أداة | Gorilla | N / A ، http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il | برنامج تحليل التخصيب الوظيفي المستخدم في الخطوة 4.5 |
| GSEA Gene Set Enrichment Analysis | Broad Institute | N / A ، https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp | برنامج تحليل التخصيب الوظيفي المستخدم في الخطوة 4.5 |
| HSD: الفئران العاري اللورمية FOxn1nu | Envigo (مختبرات هارلان سابقا) | 69 | |
| Illumina HiSeq2500 (الجيل التالي من تسلسل الحمض النووي) | Illumina | Hi Seq 2500 | المستخدم في الخطوة 4.2 |
| Lasergene: ArrayStar التعبير الجيني وتحليل المتغير | DNAStar LaserGene برنامج | N / A | التحليل الإحصائي والتطبيع المستخدم في الخطوة 4.4 |
| Lasergene: تجميع محاذاة تسلسل SeqMan NGen | محاذاة البرامج المستخدمة في الخطوة 4.3 | N / A | محاذاة البرامج المستخدمة في الخطوة 4.3 |
| Matrigel ، مصفوفة الغشاء القاعدي ذات عامل النمو المنخفض | Corning | 354230 | |
| NRG1-beta | في المنزل | تم إنشاؤها بواسطة SLC ، وهي متاحة أيضا تجاريا من R & أنظمة D (396-HB-050 / CF). | |
| Nuclear Stain Hoeschst 33342 | Thermo | 62249 | |
| نظام تصنيف الأنطولوجيا الجينية النمر | http://pantherdb.org | برنامج تحليل التخصيب الوظيفي المستخدم في الخطوة 4.5 | |
| Partek (محاذاة ومحلل BWA) | Partek ، Ver 7 | N / A | محاذاة البرامج والإحصائيات / التطبيع المستخدمة للخطوة 4.3 |
| Pen / Strep | Corning | 30-002-Cl | |
| التمهيدي 1: 5′-CAAATGCTCTCTCTGTTCTTTTGT GTCTG- 3′ | Eurofins Genomics | Primer 1 + 2: 250 & thinsp ؛ bp ErbB4 منتج فارغ و 350 & thinsp ؛ منتج bp Floxed ErbB4 ؛ | |
| التمهيدي 2: 5 & prime ؛ -TTTTGCCAAGTTCTAATTCCATC AGAAGC-3 & prime; | Eurofins Genomics | Primer 1 + 2: 250 & thinsp ؛ bp ErbB4 منتج فارغ و 350 & thinsp ؛ منتج bp Floxed ErbB4 ؛ | |
| < ص>التمهيدي 3: 5′-TATTGTGTTCATCTATCATTGCA ACCCAG-3′ < / ص > | Eurofins Genomics | التمهيدي 1 + 3: 350 & thinsp ؛ منتج ErbB4 من النوع البري bp. | |
| بروبيديوم اليود | فيشر | 51-351-0 | |
| بروتيوم بروتينر فوسفو كيناز مصفوفات | R & D Systems | ARY003B | |
| الوقت الحقيقي glo | Promega | G9712 | جدوى الخلية المضيئة الحيوية |
| ToppGene Suite | ToppGene | https://toppgene.cchmc.org | برنامج تحليل التخصيب الوظيفي المستخدم في الخطوة 4.5 |
| Trizol (الكاشف القائم على حمض الكينيدينيوم والفينول والكولوروفورم) | Invitrogen | 15596026 | |
| طقم تضخيم إشارة التيراميد | NEL721001EA | بيركين إلمر |
المراجع
- Ricciuti, B., et al. Antibody-drug conjugates for lung cancer in the era of personalized oncology. Seminars in Cancer Biology. 69, 268-278 (2019).
- Litak, J., Mazurek, M., Grochowski, C., Kamieniak, P., Rolinski, J. PD-L1/PD-1 axis in glioblast....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
