وقد تم تقديم بروتوكول لتصوير microtubules الحيوية في الجسم الحي باستخدام البروتين ملزمة نهاية المسمى fluorescently. وصفنا أساليب لتسمية, صورة, وتحليل microtubules الحيوية في الخلايا العصبية الميكروتبول الجانبي الخلفي (PLM) من C. elegans.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
في الجسم الحي تقييم ديناميات Microtubule والتوجه في Caenorhabditis elegans الخلايا العصبية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
في الخلايا العصبية، كان التوجه microtubule مقيم رئيسي لتحديد المحاور التي لديها زائد نهاية من microtubules و dendrites التي لديها عموما اتجاه مختلط. هنا نحن وصف أساليب لتسمية, صورة, وتحليل ديناميات microtubule والنمو أثناء تطوير وتجديد الخلايا العصبية التي تعمل باللمس في C. elegans. باستخدام المراسلين الفلورسنت المشفرة وراثيا من نصائح microtubule، ونحن صورت microtubules أكسنال. يمكن قياس التغيرات المحلية في سلوك microtubule الذي يبدأ تجديد المحور بعد استئصال الاكستوم باستخدام هذا البروتوكول. هذا المقايسة قابلة للتكيف مع الخلايا العصبية والخلفيات الوراثية الأخرى للتحقيق في تنظيم ديناميات microtubule في مختلف العمليات الخلوية.
المقدمة
الخلايا العصبية لديها بنية متقنة مع مقصورات متخصصة مثل التشعبات، والهيئات الخلية، محاور عصبية، ونقاط الاشتباك العصبي. هيكل الخلايا العصبية الخلوية تتكون من microtubules، microfilaments، و neurofilaments وتنظيمها متميزة تدعم مقصورات الخلايا العصبية هيكليا ووظيفيا1،2،3،4،5،6،7،8،9،10 . على مر السنين، تم تحديد منظمة microtubule كمحدد رئيس....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. مراسل سلالة: الثقافة والصيانة
ملاحظة: لقياس ديناميات microtubule والتوجه في الخلايا العصبية PLM, استخدمنا سلالة دودة التعبير EBP-2::GFP تحت لمسة الخلايا العصبية محددة المروج mec-4 (juIs338 أليل)18,25,26. نحن نستخدم ثقافة الدودة القياسية وأساليب الصيانة لهذه السلالة27.
- إعداد متوسط نمو النيماتودا (3.0 غرام / لتر كلوريد الصوديوم، 2.5 غرام / لتر بيبتون، 20.0 غرام / لتر أجار، 10 ملغ / لتر الكوليسترول (مخففة من محلول الأسهم من 10 ملغم / مل)) في الماء وaut....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
وكمثال تمثيلي، وصفنا في المراقبة الحية لمذنبات EBP في الحالة الثابتة وتجديد محاور عصبية لخلايا PLM العصبية. وتقع الخلايا العصبية PLM في منطقة الذيل من الدودة مع عملية طويلة الأمامية التي تشكل المشبك وعملية قصيرة الخلفي. تنمو الخلايا العصبية PLM في الاتجاه الأمامي الخلفي بالقرب من البشرة وهي مسؤولة عن الإحساس باللمس اللطيف في الديدان. نظرا لهيكلها المبسط، وقابليتها للتصوير وmicrosurgery، وقد تم التحقيق على نطاق واسع الخلايا العصبية PLM لهيكلها الخلوي microtubule29،axonal النقل30،<.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
كان فهم ديناميكيات الميكروتبول محور تركيز رئيسي في مجال أبحاث الهيكل الخلوي على مر السنين. Microtubules الخضوع للنوى وكارثة جنبا إلى جنب مع عملية مستمرة من عدم الاستقرار الديناميكي44،45،46،47. وقد تم الحصول على الكثير من هذه المعلومات من خلال المقايسات في المختبر مثل قراءات التشتت الخفيفة من توبولين الحرة مقابل البوليمرات، ميكروتوبوال نمو المقايسات من توبولين الفلور.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
نشكر يشي جين وأندرو تشيشولم على الدعم الأولي والإجهاد المستخدم في الدراسة. تم الاستفادة من سلالة البكتيريا OP50 تجاريا من مركز علم الوراثة Caenorhabditis (CGC) بتمويل من مكتب المعاهد القومية للصحة لبرامج البنية التحتية للبحوث (P40 OD010440). كما نشكر دارميندرا بوري على توحيد الإجراءات التجريبية. يتم تمويل الدراسة من المنحة الأساسية للمركز الوطني لأبحاث الدماغ (بدعم من إدارة التكنولوجيا الحيوية، الحكومة الهندية)، DBT/Wellcome Trust India Alliance في وقت مبكر منحة مهنية (منحة # IA/E/18/1/504331) إلى S.D.، ويلكوم ترست-DBT الهند التحالف منحة وسيطة (منحة # IA/I/13/1/500874) إلى A.G.-R ومنحة من مجلس البحوث العلمية والهندسية (الصربية: CRG/2019/002194) إلى A.G.R.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| سلالة دودة | CZ18975 CZ18975 | مختبر Yishi | Jin تم إنشاؤها بواسطة Anindya Ghosh-Roy |
| Agarose | Sigma | A9539 | غطاء الديدان المتصاعدة |
| (18 مم × 18 مم) | Zeiss | 474030-9010-000 | الديدان المتصاعدة |
| حمام جاف مع كتلة تسخين | Neolab | ديدان متصاعدة | |
| زجاجية (35 مم × 25 مم) | نجمة | زرقاءالديدان المتصاعدة | |
| محلول حبة البوليسترين (4.55 × 10 ^ 13 جسيما / مل في وسط مائي مع الحد الأدنى من الفاعل بالسطح) | شركة Polysciences Inc. | 00876 | الديدان المتصاعدة |
| أنابيب | الديدان المتصاعدة | ||
| OP50 السلالة البكتيرية | Caenorhabditis مركز علم الوراثة (CGC) | OP50 | معالجة الدودة |
| 60 مم لوحات بتري | Praveen Scientific | 20440 | شفاط مناولة الدودة |
| / الشعيرات الدموية | VWR | 53432-921 | مناولة الدودة |
| باناسونيك | MIR554E | معالجة الدودة | |
| سلك | التعامل مع الدودة | ||
| مجهر مجسم مع مرفق مضان | Leica | M165FC | معالجة الدودة |
| 0.3٪ كلوريد الصوديوم | سيجما | 71376 | نمو الديدان الخيطية متوسط |
| 0.25٪ الببتون | تي إم وسائل الإعلام | 1506 | نمو الديدان الخيطية متوسط |
| 10 مجم / مل الكوليسترول | سيجما | C8667 | نمو الديدان الخيطية المتوسطة |
| 1 ملي مولار كلوريد الكالسيوم ثنائي هيدرات | سيجما | 223506 | نمو الديدان الخيطية متوسط |
| 1 ملي كبريتات المغنيسيوم سباعي هيدرات | سيجما | M2773 | نمو الديدان الخيطية متوسط |
| 2٪ أجار | تي إم ميديا | 1202 | نمو الديدان الخيطية متوسط |
| 25 ملي فوسفات ثنائي هيدروجين البوتاسيوم أحادي القاعدة | سيجما | P9791 | وسط نمو الديدان الخيطية |
| 0.1M أحادي القاعدة فوسفات ثنائي هيدروجين البوتاسيوم | Sigma | P9791 | 1X M9 عازلة |
| 0.04M كلوريد الصوديوم | Sigma | 71376 | 1X M9 عازلة |
| 0.1M كلوريد الأمونيوم | فيشر Scientific | 21405 | 1X M9 عازلة |
| 0.2M ثنائي القاعدة ثنائي الصوديوم فوسفات الهيدروجين سباعي هيدرات | Sigma | S9390 | 1X M9 عازلة |
| زجاجات | Borosil | تخزين عازل | |
| 488 نانومتر ليزر | Zeiss | Imaging | |
| 5X الهدف | Zeiss | Imaging | |
| 63X الهدف | Zeiss | Imaging | |
| Camera | Photometrics | Evolve 512 Delta | |
| Imaging Computer System for Spinning Disk Unit | HP | Intel & reg; Xeon CPU E5-2623 3.00GHz | التصوير |
| مجهر التألق | Zeiss | Observer.Z1 | التصوير |
| مصباح الهالوجين | Zeiss | التصوير | |
| Mercury Arc lamp | Zeiss Imaging Zeiss | ||
| Imaging Spinning Disk Unit | Yokogawa | CSU-X1 | Imaging |
| ZEN2 | Zeiss | ||
| Imaging Image J (فيجي الإصدار) | تحليل الصور ومعالجتها | ||
| Adobe Creative Cloud | Adobe تحليل الصور ومعالجتها | ||
| نظام الكمبيوتر لتحليل الصور | Dell | Intel & reg; النواة والتجارة; i7-9700 وحدة المعالجة المركزية 3.00 جيجا هرتز | معالجة الصور / التمثيل |
المراجع
- Bush, M. S., Eagles, P. A. M., Gordon-Weeks, P. R. The neuronal cytoskeleton. Cytoskeleton: A Multi-Volume Treatise. 3, 185-227 (1996).
- Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. Building the Neuronal Microtubule Cytoskeleton. Neuron. 87 (3), 492-506 (2015).
- Tas, R. P., Kapitein, L. C.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
