يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

طريقة قابلة للتطوير لدراسة بقاء الخلايا العصبية في الثقافة العصبية الأولية بدقة خلية واحدة وفي الوقت الفعلي

1.1K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/62759

⸱

يوليو 26, 2021

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Cortical Circuits in Health and Disease, Centro de Investigación Príncipe Felipe

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، نقدم منهجية بسيطة وقوية ومتعددة الاستخدامات للتحقيق في بقاء الخلايا العصبية على الإجهاد السام للخلايا في الخلايا العصبية القشرية الأولية ذات الدقة الخلوية في الوقت الفعلي أو في مادة ثابتة.

الملخص

يعد فقدان الخلايا العصبية في صميم العديد من الأمراض العصبية ، بما في ذلك السكتة الدماغية ومرض الزهايمر ومرض باركنسون. تم تطوير طرق مختلفة لدراسة عملية بقاء الخلايا العصبية عند الإجهاد السام للخلايا. تعتمد معظم الطرق على مناهج كيميائية حيوية لا تسمح بحل الخلية الواحدة أو تنطوي على منهجيات معقدة ومكلفة. يقدم هنا نموذجا تجريبيا متعدد الاستخدامات وغير مكلف وفعال لدراسة بقاء الخلايا العصبية. تستفيد هذه الطريقة من وضع العلامات الفلورية المتناثرة للخلايا العصبية متبوعا بالتصوير الحي والقياس الكمي الآلي. لهذا الهدف ، يتم تزويد الخلايا العصبية بالكهرباء للتعبير عن علامات الفلورسنت وزراعتها مع الخلايا العصبية غير المثقبة بالكهرباء لتنظيم كثافة الخلايا بسهولة وزيادة البقاء على قيد الحياة.

يسمح وضع العلامات المتناثرة عن طريق التثقيب الكهربائي بقياس تلقائي بسيط وقوي. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن دمج الملصقات الفلورية مع التعبير المشترك لجين ذي أهمية لدراسة مسارات جزيئية محددة. هنا ، نقدم نموذجا للسكتة الدماغية كنموذج سام للأعصاب ، وهو اختبار الحرمان من الأكسجين والجلوكوز (OGD) ، والذي تم إجراؤه في غرفة ناقصة التأكسج محلية الصنع بأسعار معقولة وقوية. أخيرا ، يتم وصف مهام سير عمل مختلفة باستخدام IN Cell Analyzer 2200 أو ImageJ مفتوح المصدر لتحليل الصور لمعالجة البيانات شبه التلقائية. يمكن تكييف سير العمل هذا بسهولة مع النماذج التجريبية المختلفة للسمية وتوسيع نطاقه للفحص عالي الإنتاجية. في الختام ، يوفر البروتوكول الموصوف نموذجا ودودا وبأسعار معقولة وفعالا في المختبر للسمية العصبية ، والذي يمكن أن يكون مناسبا لاختبار أدوار جينات ومسارات معينة في التصوير الحي وفحص الأدوية عالي الإنتاجية.

المقدمة

تتطلب دراسة الاضطرابات العصبية نماذج تجريبية قابلة للتحليلات الجينية والجزيئية والخلوية. الخلايا العصبية القشرية الأولية هي نموذج قوي جدا لدراسة بقاء الخلايا العصبية والسمية1،2،3،4. في ظل الظروف المناسبة ، ستعمل الخلايا العصبية الأولية تدريجيا على تطوير اتصالات متشابكة وتظهر السمات المميزة للخلايا العصبية الناضجة. لذلك ، فإن هذا النموذج أكثر موثوقية من خطوط الخلايا الخالدة في نمذجة فسيولوجيا الخلايا العصبية وأكثر قابلية للتلاعب من النماذج الحيوانية. ومع ذلك ، بالمقارنة مع خطوط الخلايا ، يصعب نقل الخلايا العصبية القشرية الأولية وهشة نسبيا. علاوة على ذلك ، قد يؤدي التشكل المعقد للخلايا العصبية القشرية إلى تعقيد التصوير والتحليل في الثقافات عالية الكثافة. على العكس من ذلك ، فإن الثقافات العصبية الأولية منخفضة الكثافة أسهل في التحليل ولكنها تميل إلى أن تكون أكثر هشاشة.

مع أخذ كل هذا في الاعتبار ، تقدم هذه الورقة سير عمل في المختبر ميسور التكلفة ومتعدد الاستخدامات وقابل للتطوير لنمذجة بقاء الخلايا العصبية والتحقيق فيها (الشكل 1). النقاط الرئيسية لهذا البروتوكول هي أنا) طريقة التثقيب الكهربائي في المختبر للخلايا العصبية بعلامة فلورية للسماح بوضع العلامات المتناثرة وتصوير الخلايا الحية. ب) تعدد استخداماته في نماذج مختلفة من السمية الخلوية ؛ و iii) التحليل شبه الآلي أو الآلي.

يوفر نظام التثقيب الكهربائي (انظر جدول المواد) إجراء مفتوحا وغير مكلف لا يتضمن مجموعات وحلول محددة4،5،6. علاوة على ذلك ، يمكن تكييف هذه الطريقة بسهولة للحصول على كفاءة تحويل مثالية وكثافة الخلايا العصبية المنقولة ، وخلط الخلايا الكهربائية مع الخلايا غير المثقلة بالكهرباء. تعمل الزراعة المشتركة مع الخلايا العصبية الساذجة (غير المثقبة بالكهرباء) على تحسين قابلية الخلايا المثقبة بالكهرباء بشكل كبير مقارنة بالثقافات منخفضة الكثافة. علاوة على ذلك ، فإنه يتيح وضع العلامات المتناثرة بكثافة قابلة للتعديل للخلايا العصبية المثقبة بالكهرباء ، مما يحافظ على مستوى ثابت من التعبير الجيني. من المهم استهداف 3-5٪ من الخلايا العصبية الكهربائية في فحوصات البقاء على قيد الحياة.

يسهل وجود ملصقات متفرقة بشكل أساسي أتمتة تحليل الصور لأن الخلايا مفصولة جيدا ويمكن تمييزها بسهولة. والجدير بالذكر أن هذا النموذج التجريبي يمكن تكييفه لاختبار جينات متعددة ذات أهمية من خلال الزراعة المشتركة للخلايا العصبية في نفس الوقت مع علامات الفلورسنت العصارية الخلوية المختلفة (على سبيل المثال ، بروتين الفلورسنت السماوي ، والبروتين الفلوري الأحمر (RFP) ، والبروتين الفلوري الأخضر (GFP)) في نفس البئر. على غرار فحوصات السمية الخلوية الأخرى (على سبيل المثال ، يوديد البروبيديوم أو نازعة هيدروجين اللاكتات) ، يعتمد الاختبار الموصوف هنا على حقيقة أن موت الخلايا العصبية مصحوب بتمزق غشاء الخلية. هذا يثير إطلاق بروتينات العصارة الخلوية عن طريق الانتشار ، وبالتالي فقدان مضان GFP.

يتم تقديم نموذج المختبر للسكتة الدماغية ، وهو نموذج OGD ، كمثال على السمية العصبية7،8،9. يستلزم هذا البروتوكول تعريض الخلايا العصبية الأولية لمخزن ملحي مشابه للسائل الدماغي النخاعي الاصطناعي ولكنه محروم من الأكسجين والجلوكوز. على الرغم من تقديم هذا النموذج كمثال على الإجهاد العصبي السام ، إلا أنه يمكن اختبار الظروف السامة للخلايا المختلفة بنفس سير العمل8،9. أخيرا ، يتيح وضع العلامات المتناثرة بسهولة تطوير تحليل التصوير الآلي. هنا ، تم إنشاء بروتوكول يعتمد على التألق المناعي القياسي وتحليل ImageJ في إعداد أصغر. بعد ذلك ، تم تكييف سير العمل هذا وتوسيع نطاقه باستخدام نظام تصوير الخلية الذي يسمح بتحليل آلي في التصوير المباشر في أوضاع الإنتاجية المتوسطة والعالية. في الختام ، تقدم هذه الورقة منهجية مرنة وبأسعار معقولة وقابلة للتطوير لدراسة بقاء الخلايا العصبية في نماذج تجريبية مختلفة للسمية باستخدام التصوير الحي والقياس الكمي الآلي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

يجب الإشراف على جميع الإجراءات التي تستخدم من قبل لجنة أخلاقيات البيولوجيا للحيوانات التابعة للمعهد وتنفيذها وفقا للوائح المحلية. تمت الموافقة على الإجراءات المعروضة هنا من قبل السلطة المفوضة وتتوافق مع اللوائح في إسبانيا وأوروبا.

1. الثقافة العصبية الأولية

ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الخطوات داخل غطاء المزرعة ، باستخدام مواد ومحاليل معقمة للحفاظ على الظروف المعقمة.

  1. طلاء بولي إل ليسين (PLL)
    1. اغسل الغطاء (CVs ، 15 مم) في 70٪ من الإيثانول طوال الليل (o / n) في شاكر مداري.
      ملاحظة: يجب أن تكون سرعة شاكر المداري كافية لتحريك السيرة الذاتية برفق ولكن ليس بسرعة كبيرة لتجنب إتلاف السير الذاتية أو خدشها. سيختلف عدد الدورات في الدقيقة المحدد اعتمادا على طراز شاكر. يمكن تخزين السير الذاتية في الإيثانول لفترات طويلة (أشهر).
    2. قم بإزالة الإيثانول واغسله مرتين بالماء منزوع الأيونات لمدة 10 دقائق لكل منهما.
    3. دع السير الذاتية تجف في درجة حرارة الغرفة (RT) في طبق بتري 100 مم (13 سيرة ذاتية / لوحة تقريبا). تأكد من أن السير الذاتية لا تلمس بعضها البعض أو حواف اللوحة.
      ملاحظة: يمكن تخزين السير الذاتية الجافة في RT لفترات طويلة (أشهر).
    4. قم بإعداد محلول مخزون PLL 5 مجم / مل في الماء ، وقم بعمل كميات كبيرة ، وقم بتخزينها عند -20 درجة مئوية. خفف محلول المخزون في 1x PBS إلى تركيز عمل قدره 0.1 مجم / مل.
      ملاحظة: يمكن اختبار تركيزات أعلى تصل إلى 1 مجم / مل PLL.
    5. أضف الحد الأدنى لحجم PLL لتغطية سطح السير الذاتية (انظر الأحجام المثلى ل PLL في الجدول 1). أضف محلول PLL بالتنقيط لتسهيل تكوين قطرة.
      ملاحظة: مطلوب طلاء الخلايا العصبية على السير الذاتية للتألق المناعي. بالنسبة للتصوير بفاصل زمني (على سبيل المثال ، للخلية الداخلية) ، يتم طلاء الخلايا مباشرة فوق البئر بدون السير الذاتية لأن السير الذاتية قد تتحرك أثناء الفاصل الزمني. في هذه الحالة ، أضف الحد الأدنى من حجم PLL لتغطية سطح كل بئر.
سطححجم PLL (مل)
أغطية 15 مم0.2
أغطية 13 مم0.18
96 لوحة بئر0.07
24 طبق بئر0.3
6 صحن بئر2
لوحة 60 مم4.5

الجدول 1: الأحجام المثلى من poly-L-lysine وفقا لمساحة السطح.

  1. احتضان لمدة لا تقل عن 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: يمكن أن تكون فترة الحضانة طويلة تصل إلى o / n.
  2. قم بإزالة PLL من السير الذاتية. اغسل السير الذاتية مرتين بالماء منزوع الأيونات لمدة 10 دقائق لكل منهما. دع السير الذاتية تجف في RT.
    ملاحظة: يمكن تخزين محلول PLL عند 4 درجات مئوية لإعادة الاستخدام (3 مرات كحد أقصى).
  3. قم بتخزين السير الذاتية المجففة داخل طبق بتري عند 4 درجات مئوية (لمدة تصل إلى 7-10 أيام) أو ضعها داخل الآبار ذات وسط الطلاء (انظر التكوين في الجدول 2 وأحجام العمل في الجدول 3). أضف وسط الطلاء مباشرة إلى آبار الألواح المكونة من 12 بئرا (الجدول 3).
    ملاحظة: الخلايا العصبية حساسة جدا لجودة مصل الأبقار الجنينية (FBS). يجب اختبار دفعات مختلفة من FBS لتحديد الدفعة التي تبدو فيها الخلايا أكثر صحة. بمجرد تحديد كمية كبيرة من FBS ، يوصى بالحصول على كمية كبيرة وتخزينها عند -80 درجة مئوية. يمكن تكييف هذا البروتوكول لأنواع أخرى من السير الذاتية واللوحات (انظر أحجام العمل المختلفة في الجدول 3).
الطلاء المتوسط
MEM42.5مل
10٪ مصل الخيول أو FBS *5مل
30٪ جلوكوز (0.6٪ تركيز نهائي)1مل
PS (البنسلين ، 10000 وحدة / مل ؛ الستربتومايسين ، 10 مجم / مل) ؛0.5مل
وسط التثقيب الكهربائي
أوبتي-ميم
الوسط العصبي
الوسط العصبي القاعدي48.5مل
ب -271مل
جلوتاماكس 200 ملي0.125مل
PS (البنسلين ، 10000 وحدة / مل ؛ الستربتومايسين ، 10 مجم / مل) ؛0.5مل
OGD المتوسطة (Tasca، et al. 2014)
كلوريدالهواء 21المليمتر
كيه سي إل5المليمتر
كلوريد الصوديوم137المليمتر
KH2PO40.4المليمتر
نا2HPO40.3المليمتر
مغنكلوريد20.5المليمتر
MgSO40.4المليمتر
هيبس25المليمتر
NaHCO34المليمتر

الجدول 2: تكوين الوسائط المختلفة المستخدمة.

مساحة سطح الآبار والصفائححجم العمل
96 لوحة بئر0.32سم20.1مل
24 طبق بئر1.9سم20.5مل
12 طبق بئر3.8سم21مل
6 صحن بئر9.5سم22.5مل
لوحة 60 مم21.5سم26مل

الجدول 3: مساحة سطح الأنواع المختلفة من الألواح وأحجام العمل.

  1. تحضير الثقافة العصبية
    1. قم بالتسخين المسبق (37 درجة مئوية) وتوازن (في جو 5٪ من ثاني أكسيد الكربون2 ) وسط الطلاء والوسط العصبي ووسط التثقيب الكهربائي (انظر التكوين في الجدول 2) في زجاجة مفتوحة جزئيا داخل حاضنة الخلية لمدة لا تقل عن ساعتين. دع التربسين يسخن في RT. قم بتسخين محلول الملح المتوازن 1x Hank (HBSS) مسبقا عند 37 درجة مئوية في حمام مائي.
    2. قم بالضبط المسبق لمعلمات التثقيب الكهربائي (الجدول 4).
ظروف التثقيب الكهربائي: نبض التثقيب
طولVفترةNد. المعدلقطبيه
2 مللي ثانية17550210زائد
ظروف التثقيب الكهربائي: نبض النقل
طولVفترةNد. المعدلقطبيه
502050540زائد / ناقص

الجدول 4: إعدادات التثقيب الكهربائي ل NEPA21.

  1. تشريح الدماغ وحصاد فأر CD-1 embryos في E15 بعد الجماع
    1. التضحية بالأنثى الحامل عن طريق خلع عنق الرحم دون تخدير. تعقيم البطن بنسبة 70٪ من الإيثانول ؛ قطع وفتح البطن بمقص حاد.
    2. استخرج الرحم وضعه في طبق بتري مع 1x HBSS بارد. اتركه على الجليد داخل غطاء مزرعة الخلية باستخدام ملقط مشترك.
    3. استخرج جنينا من الرحم بمساعدة الملقط والمقص واقطع رأسه بقطع واحد باستخدام المقص.
    4. أمسك الرأس وأدخل ملقطا (على سبيل المثال ، ملقط دومون الناعم) في مدار العين.
    5. باستخدام الإبرة (حقنة إبرة 30 جم) كشفرة ، قم بقطع البريجما واختراق الجزء الخلفي من الرأس.
    6. أدخل ملقطا حادا من خلال الشق عموديا في البريما ، وكسر الطبقة الرقيقة من الجلد في المنطقة الأمامية. اسحب الملقط لمتابعة الشق الطولي بين نصفي الكرة الأرضية دون الإضرار بالقشرة.
    7. استخدم الملقط الصغير بزاوية 45 درجة ، من الجزء الأمامي إلى الجزء الخلفي ، لإزالة الدماغ من الرأس.
    8. انقل الدماغ إلى طبق بتري مقاس 3.5 سم مع 1x HBSS المثلج تحت مجهر مجسم.
  2. تشريح القشرة
    ملاحظة: تم تكييف بروتوكول الثقافة العصبية من الإجراء الموصوف بواسطة Dotti and Banker10.
    1. استخدم ملقط دومون (11 سم) لتثبيت المهاد وإبرة مائلة بزاوية 45 درجة لفصل قشرة كل نصف كرة من الدماغ المتوسط. تأكد من أن القشرة لا تظهر آثار للأنسجة الأخرى ؛ استخدم ملقطا حادا لإزالة السحايا.
      ملاحظة: تشكل السحايا غشاءا مرنا رقيقا يغلف الدماغ ويمكن التعرف عليه بسهولة بسبب لونها الأحمر. سيساعد القيام بحركات ناعمة في التعرج على إزالة السحايا. تأكد من إزالة جميع السحايا لأنها سامة للثقافة.
    2. انقل القشرة النظيفة إلى طبق بتري نظيف مقاس 3.5 سم مع 1x HBSS مثلج وضعه على الثلج.
  3. تصنيفها
    1. قم بتقطيع كل قشرة إلى نصفين واستخدم ملقطا أو إبرة حادة (30 جم) لتسهيل تأثير التربسين في الخطوة التالية.
    2. انقل القطع إلى 7 مل من المخزن المؤقت trypsin-EDTA في درجة حرارة الغرفة في أنبوب سعة 15 مل باستخدام ماصة P1000 (مقطوعة 3-4 مم من الحافة). انتظر حتى تغرق في قاع الطرف قبل إطلاقها من طرف الماصة. امزج عن طريق الإمالة.
    3. احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 12 دقيقة في حمام مائي. امزج عن طريق الإمالة كل 4-5 دقائق.
      ملاحظة: يمكن أن يتراوح وقت الحضانة من 12 إلى 15 دقيقة.
    4. دع الأنسجة تغرق بالجاذبية وقم بإزالة التربسين بعناية. اغسل المنديل مرتين باستخدام 8 مل من 1x HBSS وحرك برفق عن طريق الإمالة. قم بإزالة 1x HBSS بعناية باستخدام ماصة P1000 ولكن باستخدام طرف ماصة غير مقطوع.
    5. اغسل المنديل مرة واحدة ب 5 مل من وسط الطلاء. حرك عن طريق الإمالة. قم بإزالة وسط الطلاء بعناية باستخدام ماصة P1000.
    6. أضف 1.5 مل من وسط الطلاء. قم بفصل المزيج ميكانيكيا باستخدام ماصة P1000 عن طريق شفط الوسط من قاع الأنبوب وإطلاقه برفق على الجدران لمدة أقصاها 8-12 مرة.
    7. قم بالتصفية من خلال مصفاة خلوية معقمة (70 ميكرومتر) موضوعة على أنبوب سعة 50 مل. أضف 10 مل أو أي حجم آخر مرغوب فيه من وسط الطلاء إلى الأنبوب.
    8. أدخل 5 ميكرولتر من معلق الخلية في غرفة عد الخلايا ، وأضف 5 ميكرولتر من التريبان الأزرق (0.4٪ وزن / حجم) ، وعد الخلايا.
    9. قم بلوحة الخلايا (انظر القسم 1.6) عن طريق نقل حجم كاف من تعليق الخلية للحصول على العدد المطلوب من الخلايا للتثقيب الكهربائي (على سبيل المثال ، 106 خلايا) في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل. الطرد المركزي للخلايا عند 250 × جم لمدة 5 دقائق. انتقل إلى القسم 1.6.
  4. خلايا الطلاء
    1. قم بلوحة الكثافة المطلوبة لتعليق الخلية غير بالطرد المركزي من الخطوة 1.5.7 في كل بئر يحتوي على وسط الطلاء.
      ملاحظة: في هذا البروتوكول ، تم زرع 100,000 إلى 200,000 خلية / بئر في صفيحة من 12 بئرا. كمرجع ، قم بلوحة 3 سير ذاتية على الأقل لكل حالة تجريبية لحساب التباين التجريبي. قد يستلزم الإعداد التجريبي النموذجي تصوير 4-5 حقول لكل سيرة ذاتية (على سبيل المثال ، باستخدام هدف 20x ، من المتوقع أن يكون عرض كل حقل ~ 1.3 مم2 ).
    2. حرك اللوحة في غطاء مزرعة الخلية في جميع الاتجاهات الأساسية لتوزيع الخلايا بشكل موحد.
  5. التثقيب الكهربائي
    ملاحظة: يمكن استخدام أنظمة تعداء أخرى. يتميز نظام NEPA21 المستخدم في هذا البروتوكول بكونه "نظاما مفتوحا". يمكن للمستخدم تعديل البروتوكول ، ولا يتطلب كواشف محددة لتعداء الكوفيتات الخاصة المستخدمة في التثقيب الكهربائي. تم تعديل هذا البروتوكول من 5.
    1. تابع من الخطوة 1.5.9. أعد تعليق حبيبات الخلية ب 5 مل من وسط التثقيب الكهربائي في أنبوب 15 مل. جهاز الطرد المركزي للأنبوب عند 250 × جم لمدة 5 دقائق.
    2. كرر الخطوة 1.7.1. أعد التعليق باستخدام وسط التثقيب الكهربائي للحصول على تركيز 106 خلايا / مل في كل من كوفيتات التثقيب الكهربائي. امزج الخلايا مع الكمية المطلوبة من الحمض النووي في الكوفيت.
      ملاحظة: بالنسبة للتعبير عن GFP ، تم استخدام 3 ميكروغرام من البلازميد لكل مليون خلية. بسبب التباين العالي ، يوصى باختبار التركيز الأمثل لكل بلازميد. تم اختبار ما بين 2 و 24 ميكروغرام من البلازميد لكل مليون خلية. يمكن دمج البلازميدات المتنوعة في نفس الكوفيت لإجراء تعداء مزدوج. في حالة التعدي المشترك ، قم بنقل الجين المعني بزيادة مقارنة ب GFP (على سبيل المثال ، 3: 1 هي النسبة المثلى التي يجب اختبارها) للتأكد من أن معظم الخلايا التي تعبر عن GFP تشارك في التعبير عن الجين محل الاهتمام.
    3. ضع الكوفيت في حجرة الكوفيت (الشكل 2). اضغط على زر البدء لتنفيذ البرنامج المحدد مسبقا (انظر شروط التثقيب الكهربائي في الجدول 4). سجل قيم التيارات والجول المعروضة في إطار القياسات .
      ملاحظة: يجوز للمستخدم تغيير شروط معينة. على سبيل المثال ، قد يقلل تقليل الجهد من كفاءة التعداء ولكنه يزيد من بقاء الخلايا العصبية.
    4. أخرج الكوفيت من الغرفة. أضف 500 ميكرولتر من وسط الطلاء إلى الكوفيت مباشرة بعد التثقيب الكهربائي وانقل العينة من الكوفيت إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل باستخدام ماصة.
      ملاحظة: كلما زادت سرعة إضافة الوسيط ، كان البقاء على قيد الحياة أفضل بعد التثقيب الكهربائي لأنه يساعد على تجنب تلف الخلايا.
    5. قم بلوحة العدد المطلوب من الخلايا المثقبة بالكهرباء في كل بئر.
      ملاحظة: لوحة من 20,000 إلى 100,000 خلية في صفيحة من 12 بئرا. اعتمادا على الظروف ، قد تبقى 5-10٪ فقط من الخلايا الكهربائية. يجب اختبار الرقم الدقيق وتكييفه من قبل المستخدم.
    6. احتضن لمدة 2-4 ساعات في الظروف القياسية (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، الرطوبة المشبعة).
      ملاحظة: بعد فترة الحضانة ، راقب الخلايا تحت المجهر. إذا كانت الثقافة صحية ، لكانت معظم الخلايا قد تلتصقت بالسطح وبدأت في إنبات امتدادات العصبية المرئية.
    7. قم بتغيير وسط الطلاء إلى وسط عصبي (الأحجام والتكوين في الجدول 1 والجدول 2 ، على التوالي).
  6. الحفاظ على الخلايا
    1. لتحديث الوسط ، قم بإزالة نصف الوسط وأضف حجما متساويا من الوسط الطازج المتوازن مسبقا بعد 7 أيام من الزراعة.
    2. في اليوم العاشر من الثقافة ، استبدل نصف الحجم بوسط عصبي جديد بدون مكملات الجلوتامين (انظر جدول المواد). كرر هذه الخطوة كل يومين بعد يوم 10.
      ملاحظة: بعد 10 أيام من الثقافة ، تنتج الخلايا الغلوتامات من تلقاء نفسها.

2. بناء غرفة نقص التأكسج

  1. استخدم أي حاوية محكمة الغلق بغطاء لولبي أو نظام ختم مكافئ لهذا الغرض (الشكل 3 أ). احفر فتحتين في جدار الحاوية البلاستيكية وأدخل أنبوبا بلاستيكيا في كل منها. قم بإغلاقها بالسيليكون بحيث تكون الحاوية محكمة الغلق (الشكل 3).
    ملاحظة: هنا ، تم استخدام حاوية بلاستيكية أسطوانية (مقاس 1 لتر) بغطاء لولبي لبناء الغرفة. تأكد من أن الحاوية كبيرة بما يكفي لاستيعاب السير الذاتية المطلوبة للتجربة. لمعالجة المزيد من السير الذاتية في نفس المساحة ، يمكن تكديس المنصات البلاستيكية فوق بعضها البعض (الشكل 3 أ).
  2. لتحضير غرفة الفقاعات (انظر 3.2) ، قم بحفر ثقب في غطاء القارورة ، باستخدام أي مثقاب ميكانيكي قياسي مع مثقاب أصغر قليلا من الأنبوب ، وأدخل أنبوبا بلاستيكيا من خلال الفتحة في القارورة. أغلق الفتحة باستخدام البارافيلم للحفاظ على الختم المحكم (الشكل 3 ب).
  3. عقم الحاوية والقارورة بنسبة 70٪ من الإيثانول وقم بإشعاعها بالأشعة فوق البنفسجية لدورة واحدة قبل استخدامها.

3. الحرمان من الأكسجين والجلوكوز (OGD)

ملاحظة: بروتوكول OGD مقتبس من Tasca et al.7

  1. تحضير محلول OGD بمحلول الفوسفات (الجدول 2) الذي تم استكماله مسبقا بالمضادات الحيوية.
    ملاحظة: لكل لوحة مقاس 35 مم ، استخدم 5 مل ؛ للوحة 100 مم ، استخدم 10 مل.
  2. أضف محلول OGD داخل غرفة الفقاعات (الشكل 3 ب) وضعه داخل حمام مائي (تم تسخينه مسبقا عند 37 درجة مئوية). قم بتوصيل القارورة بمصدر النيتروجين (N2 ، 100٪).
    ملاحظة: يرجى ملاحظة أنه نظرا لأن محلول OGD يحتوي على HEPES كمخزن مؤقت ، فإنه لا يتطلب ثاني أكسيد الكربون2. إذا كان محلول OGD يعتمد على نظام التخزين المؤقت للبيكربونات ، فاستخدم 5٪ CO2 و 95٪ N2 لتشبع محلول نقص الأكسجين والغرفة.
  3. اشبع محلول OGD بالنيتروجين الفقاعي برفق. اترك المحلول في حالة فقاعات معتدلة لمدة 20-30 دقيقة.
  4. انقل القارورة على الفور إلى غطاء مزرعة الخلية وأضف 5 مل من محلول OGD بدون أكسجين في ألواح 35 مم أو 10 مل في ألواح زراعة 100 مم.
  5. انقل السير الذاتية مع الخلايا المستنبتة إلى اللوحات التي تحتوي على OGD. بدون تغطية الألواح ، انقلها إلى غرفة نقص الأكسجة وأغلقها بإحكام ولكن بعناية.
    ملاحظة: يجب إكمال الخطوتين 3.4 و 3.5 في أسرع وقت ممكن. الحفاظ على السير الذاتية للتحكم (الوسط العصبي في نورموكسيا) في ألواح الآبار داخل الحاضنة. بدلا من ذلك ، قم بتعريض الخلايا العصبية للتحكم في وسط OGD الطبيعي، المكمل بالجلوكوز (10 ملليمتر) لفحص آثار نقص الأكسجة والحرمان من الجلوكوز بشكل أكثر انتقائية.
  6. قم بتوصيل نظام النيتروجين بغرفة نقص الأكسجة وتأكد من أن الأنابيب مفتوحة. قم بتشبع الغرفة ب N2 لبضع دقائق عند ضغط 2-3 بار (على سبيل المثال ، 2-3 دقائق ؛ 1 بار = 750 مم زئبق) (الشكل 3 ج).
    ملاحظة: لا تنس أن تضع فقاعة حل OGD مرة أخرى لمدة 15 دقيقة بين نقاط زمنية متعددة.
  7. قلل ضغط النيتروجين إلى 1.3-1.5 بار وأغلق كلا الأنبوبين في غرفة نقص الأكسجة (الشكل 3 ج). اترك الغرفة في الحاضنة للوقت المطلوب (على سبيل المثال ، 60 دقيقة) عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
    ملاحظة: قد تتطلب مدة OGD تعديلا اعتمادا على الحالة التجريبية وأهداف البحث. وقت حضانة قصير (على سبيل المثال ، 30 دقيقة) من شأنه أن يحاكي نقص الأكسجة الخفيف. عادة ما تكون ساعتان من OGD قاسية جدا تجاه الخلايا العصبية. يوصى باختبار مدة OGD من 45 إلى 90 دقيقة قبل بدء الدراسة. بالطبع ، ستؤثر مدة OGD على البقاء على قيد الحياة الكلي والبداية النسبية لموت الخلايا العصبية بعد التعافي من OGD. إذا كان الهدف هو تحليل الموت العصبي في الوقت الفعلي ، فاستهدف تحقيق ظروف OGD التي من شأنها أن تثير موت الخلايا بعد ساعات قليلة من التعافي من OGD لإجراء تحليل أكثر فعالية.
  8. افتح الغرفة وانقل السير الذاتية إلى لوحة الآبار الأصلية للتعافي. بعد هذه الخطوة ، ضع في اعتبارك بديلين: 1) بالنسبة للتجارب الصغيرة ، انتقل إلى القسم 4 للتألق المناعي وتحليل الصور ؛ 2) لفحص المحتوى العالي ، انتقل إلى القسم 5 للتحليل في محلل الخلية (أو النظام الأساسي المكافئ).
    ملاحظة: يوفر التصوير المباشر نهجا أكثر مرونة لأنه يسمح بالمراقبة في الوقت الفعلي للنقاط التجريبية المختلفة.

4. التحليل بواسطة التألق المناعي القياسي و ImageJ

ملاحظة: قد يختلف وقت الاسترداد من 1 إلى 24 ساعة حسب الظروف.

  1. اغسل الخلايا العصبية باستخدام 1x PBS لمدة 10 دقائق.
    ملاحظة: هذه الخطوة اختيارية نظرا لوجود عدة طرق لمتابعة الصور وتحليلها.
  2. قم بإصلاح الخلايا العصبية بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 10 دقائق في RT. اغسلها ثلاث مرات باستخدام 1x PBS لمدة 10 دقائق لكل غسلة.
    ملاحظة: نظرا لأن بارافورمالدهيد سام ، اعمل تحت غطاء كيميائي.
  3. قم باختراق الخلايا العصبية عن طريق إضافة 1x PBS يحتوي على 0.1٪ Triton X-100 لمدة 10 دقائق. اغسل الخلايا بسرعة باستخدام 1x PBS. كرر خطوة الغسيل مرتين لمدة 10 دقائق لكل غسلة.
  4. أضف 350 ميكرولتر من محلول الحجب (1x PBS يحتوي على 2٪ ألبومين مصل بقري) إلى السير الذاتية واتركها لمدة 30 دقيقة على الأقل. قم بتدوير مخزون الجسم المضاد الأساسي (AB) (5 × جم لمدة 30 ثانية) واخلطه مع محلول الحجب عند التخفيف المطلوب ، على سبيل المثال ، مضاد GFP في الساعة 1: 600.
    1. انقل الغطاء إلى البارافيلم في غرفة رطبة (صندوق به مناديل مبللة بالماء للحفاظ على الرطوبة وتجنب التبخر). اعتمادا على حجم السير الذاتية ، أضف بعناية 60 أو 80 ميكرولتر من تخفيف الجسم المضاد الأساسي لكل سيرة ذاتية ، وتأكد من أن الخلايا على اتصال بالجسم المضاد. احتضان السير الذاتية o / n عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: يجب تشكيل قطرة على سطح السيرة الذاتية لتغطية سطح السيرة الذاتية بالكامل. تجنب إزعاج الخلايا أثناء سحب محلول الأجسام المضادة على السير الذاتية. يمكن تقليل وقت الحضانة إلى ساعتين في RT.
  5. اغسل السير الذاتية باستخدام 1x PBS لمدة 10 دقائق فوق البارافيلم. كرر خطوة الغسيل مرتين.
  6. تمييع AB الثانوي ، على سبيل المثال ، Alexa 488 (1: 500) ، و 4 ′ ، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI ، 1: 2,000) في محلول الحظر. اعتمادا على حجم السير الذاتية ، أضف قطرة 60-80 ميكرولتر من محلول AB الثانوي على الخلايا. احتضان السير الذاتية لمدة ساعة واحدة في الظلام في RT. اغسل AB و DAPI الثانويين من الخلايا العصبية باستخدام 1x PBS لمدة 10 دقائق وكرر هذه الخطوة مرتين.
  7. قم بتركيب السير الذاتية في وسط التركيب (انظر جدول المواد) لتحليل التألق المناعي وتخزينها في الظلام عند 4 درجات مئوية بعد التجفيف.
  8. التقاط الصور وتحليلها.
    ملاحظة: تم استخدام مجهر مقلوب لالتقاط الصور بمعدل 20 ضعفا (الشكل 4 أ ، انظر جدول المواد).
    1. استخدم برنامج ImageJ مفتوح المصدر لتحليل الصور والحصول على قناع قناة GFP (الشكل 4C).
      ملاحظة: هناك عدة طرق لتصوير الخلايا العصبية وتحليلها ، اعتمادا على توافر المعدات والشكل التجريبي. يتم توفير سير العمل التالي كمثال أساسي حيث يكون الهدف هو تحديد سوما الخلايا العصبية الفردية التي تعبر عن GFP الموجودة في الصورة. يجب على المستخدم اختبار القيم المحددة المعروضة هنا ، مثل قيمة العتبة وحجم الجسيمات ، بناء على ظروفه التجريبية المحددة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إضافة عوامل تصفية وخطوات معالجة مختلفة. على سبيل المثال ، غالبا ما تساعد مرشحات ImageJ Subtract Background و Despeckle في تنظيف الصورة في بداية المعالجة. يتطلب تحسين سير العمل لظروف تجريبية محددة خبرة سابقة في تحليل الصور ومعرفة المفاهيم الأساسية للتحليل الكمي للصور. نظرا لأن الدليل المتعمق حول تحليل الصور خارج نطاق البروتوكول الحالي ، فإننا نوصي بالموارد التالية: دليل مستخدم ImageJ ، https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/; للحصول على أمثلة ودروس ، https://imagej.nih.gov/ij/docs/examples/index.htm ؛ حزمة MBF ImageJ ، https://imagej.net/mbf/index.htm.
    2. للتجزئة ، حدد تجزئة الشدة مع المعلمات اللازمة لعزل سوما ، وهي ألمع منطقة في الخلايا العصبية.: القائمة | صورة | ضبط | العتبة | تعيين الحد الأدنى (على سبيل المثال، 100) | انقر فوق تطبيق.
    3. كرر العتبة من 4.8.2. إلى جميع الصور لرؤية القناع (أي الصورة المجزأة) لسوما الخلايا العصبية (الشكل 4E).
    4. للحصول على عدد الخلايا الباقية في كل صورة وتصدير النتائج إلى جدول بيانات لإجراء العمليات الحسابية، حدد القائمة | تحليل | تحليل الجسيمات وإدخال قيم المعلمات الضرورية (على سبيل المثال ، الحجم: 50 بكسل لا نهاية ؛ الدائرية: 0.5-1.00). ضع في اعتبارك أنه عند t = 0 ساعة ، فإن عدد الخلايا التي تم عدها هو العدد الإجمالي للخلايا التي تم تحديدها ، واحسب النسبة المئوية للخلايا التي نجت في النقاط الزمنية المختلفة.
      ملاحظة: يعد عتبة الحجم الأصغر مفيدا لتصفية الكائنات الأصغر من سوما (على سبيل المثال ، 60-80 ميكرومتر2).
    5. استخدم وظيفة Record Macro في ImageJ لأتمتة التحليل وتكراره: Menu | الإضافات | وحدات الماكرو | سجل | انقر فوق إنشاء لإنشاء الماكرو.

5. تحليل في الوقت الحقيقي باستخدام محلل الخلية IN 2200

  1. أدخل اللوحة المكونة من 12 بئرا في محلل الخلية ، وقم بتوصيل نظام ثاني أكسيد الكربون2 ، واضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: يمكن توسيع نطاق هذه الخطوة بسهولة في هذه المنصة ، وإجراء تجربة مماثلة في الخلايا العصبية المطلية في صفيحة 96 بئرا.
  2. حدد الهدف 20x ، وحدد بشكل عشوائي 5 حقول لكل بئر (تغطي 2.33٪ من البئر في هذا المثال) ، وركزها تلقائيا لكل قناة مضان (isothiocyanate الفلورسين [FITC] في هذه الحالة). حدد معلمات الاستحواذ (فاصل زمني لمدة 30 دقيقة لمدة 16 ساعة). اضغط على ابدأ وانتظر.
    ملاحظة: يجب أن يحدد الباحث عدد حقول التصوير ويجب أن يكون كافيا لحساب التباين داخل بئر واحد.
  3. استخدم IN Cell Developerbox v1.9 لإعداد سير العمل المناسب للتحليل.
  4. تحليل صور الخلايا العصبية (قناة FITC) لإنشاء قناع لسوما الخلايا العصبية (الشكل 4).
    ملاحظة: الهدف هو تحديد سوما الخلايا العصبية الفردية الموجودة في الصورة. يتبع هذا التحليل الخطوات المكافئة لتلك الموضحة في القسم 4 ل ImageJ. يرجى الرجوع إلى القسم 4 للاطلاع على سير العمل والاعتبارات العامة. يتم تحديد عتبة الشدة لتحديد سوما ، وهي ألمع منطقة في الخلايا العصبية.
    1. للتجزئة، حدد تجزئة الكثافة مع المعلمات الضرورية (في هذه الحالة، حد أدنى يبلغ 20005.40).
    2. للمعالجة اللاحقة، حدد خيار الغربال، مع الاحتفاظ بالأهداف ذات مساحة أكبر من قيمة محددة مسبقا (هنا، 189 بكسل (~80 ميكرومتر2)).
    3. حدد المعلمة Sum لحساب وجمع جميع الخلايا العصبية المحددة في القناع (الخلايا العصبية الباقية) لكل حقل ولجميع حقول البئر في كل نقطة زمنية من الدورة الزمنية.
    4. تصدير النتائج إلى جدول بيانات. عند t = 0 h ، ضع في اعتبارك أن عدد الخلايا التي تم عدها هو إجمالي الخلايا التي تم تحديدها ، واحسب النسبة المئوية للخلايا التي نجت في نقاط زمنية مختلفة. احسب الوقت الذي تموت فيه 50٪ من الخلايا لتسهيل المقارنة بين الظروف.
      ملاحظة: يجب على المستخدم تعديل معلمات خطوات التجزئة والمعالجة اللاحقة لقنوات الفلورسنت المختلفة اعتمادا على الهياكل المراد تحديدها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يهدف هذا البروتوكول إلى إنشاء نموذج في المختبر للسكتة الدماغية. من المهم الحصول على كثافة عصبية كافية ، مما سيسمح بالتعرف على الخلايا العصبية الفردية المثقبة بالكهرباء لتحليلها بشكل فردي. تعتبر مرحلة الثقافة العصبية بعد الطلاء أمرا بالغ الأهمية أيضا. نضوج الخلايا العصبية في الثقافة تدريجي. سيختلف الاعتماد على عوامل النمو ونمو العصبي والاتصال والنشاط الفيزيولوجي الكهربي اختلافا كبيرا اعتمادا على المرحلة. في هذه الظروف المحددة في 4-6 أيام في المختبر ، على الرغم من أن الخلايا العصبية ممتدة جيدا ، إلا أن ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يوضح هذا البروتوكول طريقة فعالة لنمذجة السكتة الدماغية في المختبر. لتحقيق هذا الهدف ، اقترحنا وضع العلامات المتفرقة على الخلايا العصبية القشرية باستخدام نظام التثقيب الكهربائي NEPA215. هذا نظام مفتوح يسمح بتخصيص البروتوكول بأقل تكلفة تشغيلية مقارنة بالأنظمة الأخرى التي تستخدم مجموعات أو أجهزة محددة. تسمح الثقافة المختلطة للخلايا العصبية الساذجة والمثقبة بالكهرباء بمزيد من المرونة والمتانة مقارنة بالثقافة العصبية منخفضة الكثافة. هذا يسمح بدراسة تأثير الجين...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

نود أن نشكر كارلوس دوتي على مشاركة خبرته في الثقافة العصبية. كما نشكر أليسيا مارتينيز روميرو من مرفق Cytomics Core التابع لمركز التحقيقات Principe Felipe (CIPF) ، والذي يدعمه تمويل FEDERER الأوروبي. يتم دعم المشروع من قبل وزارة الاقتصاد والقدرة التنافسية الإسبانية للكواشف والمواد و SAF2017 رواتب YDC و PF. يتم دعم PF أيضا من خلال المنحة RyC-2014-16410. يتم دعم CGN و PF من قبل Conselleria de Sanitat of Generalitat Valenciana ، بالإضافة إلى AGM (ACIF / 2019/015). يتم دعم Ángela Rodríguez Prieto من قبل وزارة العلوم والابتكار والجامعات الإسبانية ، بمنحة PRE2018-083562.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أطباق بتري 10 سمفيشر ساينتفيك ، SL1130-9283
3.5 سم أطباق بتريSterilin
75 سم 2< / sup> قارورةCorning430641U
B-27Life Technologies17504-044
لوحات زراعة الخلاياCorning incorporation Costar & reg ؛3513
حاضنة خليةشركة Thermo Electron Corporationموديل 371
مصفاة خلية 70 & ميكرو ؛ mFalcon352350
أضواء باردةSchott223488KL 1500 أغطية LCD
(15 مم)Marienfeld111530
CU500 Cuvette ChamberNepa Gene
CU600 Cuvette Stand HolderNepa Gene
DAPISigma-Aldrich Quimica، S. L.D9542-10MG1: 2000
DMSOPanreacA3672
ملقط دومون الناعمFST11254-20
ملقط دومون الناعمFST11252-00
EC-002S NEPA أكواف التثقيب الكهربائي ، مصفاةنيبا
فالكون352350
مقص ناعم - حادFST14028-10
مقص فاين - ToughCut rFST14058-09
دجاج GFP IgYAves LabsGFP-10101: 600
جلوكوزسيجما68769-100 مل
مكمل غذائي جلوتا ماكس I 200 ملم 100 ملفيشر ساينتفيك35050-061
HBSSثيرموفيشر14175-095https://www.thermofisher.com/es/es/home/technical-resources/media-formulation.156.html
هيبس 1 مثيرموفيشر15630-080
مصل الحصانInvitrogen26050088
MEMThermofisher11095080https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11095080#/11095080
شريحة مجهر (بوليسين)VWR 631-0107الأبعاد: 25 × 75 × 1 ملم
ميول 4-88سيجما ألدريتش كيميكا ، إس إل.81381-250G
إبر صفراء ، 30 مقياسBD Microlance & trade ؛ 3304000
NEPA21 جهاز الثقب الكهربائيNepa Gene
NeubauerBlau العلامة التجارية717805
Neurobasal MediumThermoFisher21103-49
Opti-MEMInvitrogen31985-062
Parafilmكول بارمرPM996
بارافورمالدهيد (PFA) ، 95٪سيجما ألدريتش كيميكا ، إس إل.158127-500Gاستخدم الحل: 4٪
PEIPolysciences23966-1
Plasmid ل GFPpCMV-GFP-ires-Cre ، الموصوف في Fazzari et al. ، Nature ، 2010
Poly-L-LysineSIGMAP2636
PS (البنسلين ، الستربتومايسين)ملقط ThermoFisher15140122
المسننةFST11152-10
مجهرعالمي للأدوات
محاقنBD Plastipak 1 مل303176
تريتون X-100سيجما ألدريتش كيميكا ، إس إلرقم MDL: MFCD00128254
25300054غير أيونية Trypsin-EDTAThermoFisher
15 ملفيشر05-539-4
أنابيب 50 ملVWR21008-242
Tupperware-تابروير محكم مع غطاء لولبي. SP بيرنر - تفتق 1 لتر ريدوندو يخدع روسكا. يمكن شراء أي Tupperware محكم المكافئ في أي سوبر ماركت.
حمام مائيمختبر شيلدون موديل 12241641951
فلتر جيني بفجوة 2 مم حاد Chamber مجهر الدقيقة أنابيب

المراجع

  1. Salazar, I. L., Mele, M., Caldeira, M., Costa, R. O., Correia, B., Frisari, S., Duarte, C. B. Preparation of primary cultures of embryonic rat hippocampal and cerebrocortical neurons. Bio-protocol. 7 (18), 2551(2017).
  2. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).
  3. Fazzari, P., et al. Cell autonomous regulation of hippocampal circuitry via Aph1b-γ-secretase/neuregulin 1 signalling. eLife. 3, 02196(2014).
  4. Navarro-González, C., Huerga-Gómez, A., Fazzari, P. Nrg1 intracellular signaling is neuroprotective upon stroke. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019, 3930186(2019).
  5. NEPA21 transfection of cell suspensions using cuvettes. NEPAGENE Co. Ldt. , Available from: http://2017.igem.org/wiki/images/3/3a/T--TECHNION-ISRAEL--Electroporation-NEPA2_for_HPC-7.pdf (2017).
  6. Larson, M. A., Gibson, K. A., Vivian, J. L. In vivo validation of CRISPR reagents in preimplantation mouse embryos. Methods in Molecular Biology. 2066, 47-57 (2020).
  7. Tasca, C. I., Dal-Cim, T., Cimarosti, H. In vitro oxygen-glucose deprivation to study ischemic cell death. Methods in Molecular Biology. 1254, 197-210 (2015).
  8. Holloway, P. M., Gavins, F. N. E. Modeling ischemic stroke in vitro: the status quo and future perspectives. Physiology and Behavior. 47 (2), 561-569 (2016).
  9. Sommer, C. J. Ischemic stroke: experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 245-261 (2017).
  10. Dotti, C. G., Banker, G. A. Experimentally induced alteration in the polarity of developing neurons. Nature. 330 (6145), 254-256 (1987).
  11. Fazzari, P., et al. Control of cortical GABA circuitry development by Nrg1 and ErbB4 signalling. Nature. 464 (7293), 1376-1380 (2010).
  12. Sadiq, A. A., et al. An overview: Investigation of electroporation and sonoporation techniques. 2015 2nd International Conference on Biomedical Engineering. , 1-6 (2015).
  13. Shi, J., et al. A review on electroporation-based intracellular delivery. Molecules. 23 (11), 3044(2018).
  14. Fazzari, P., Mortimer, N., Yabut, O., Vogt, D., Pla, R. Cortical distribution of GABAergic interneurons is determined by migration time and brain size. Development. 147 (14), 185033(2020).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الفيديو قريباً
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.