تحدد هذه المخطوطة طريقة النشاف والغطس لتجميد العينات البيولوجية يدويا للفحص المجهري الإلكتروني المبرد بجسيمات واحدة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
دليل لطخة والغطس تجميد العينات البيولوجية للجسيمات المفردة المجهر الإلكترون المبردة
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تصوير العينات البيولوجية مع الإلكترونات لتحديد هيكل عالية الدقة عن طريق المجهر الإلكتروني المبردة جسيمات واحدة (cryoEM) يتطلب طبقة رقيقة من الجليد الزجاجي التي تحتوي على الجزيئات الحيوية ذات الأهمية. على الرغم من التقدم التكنولوجي العديد في السنوات الأخيرة التي دفعت cryoEM جسيم واحد إلى طليعة البيولوجيا الهيكلية، والأساليب التي يتم بها تهتز العينات للتصوير عالية الدقة غالبا ما تبقى الخطوة التي تحد من معدل. على الرغم من أن العديد من الجهود الأخيرة وفرت وسائل للتغلب على العقبات التي كثيرا ما تواجه خلال تزجيج العينة ، بما في ذلك تطوير دعامات عينة جديدة وأجهزة التزجيج المبتكرة ، فإن المكبس التقليدي الذي يتم تشغيله يدويا لا يزال عنصرا أساسيا في مجتمع cryoEM بسبب انخفاض تكلفة الشراء وسهولة التشغيل. هنا، نقدم أساليب مفصلة لاستخدام معيار، على غرار المقصلة تعمل يدويا جهاز لطخة والغطس لتزجيج العينات البيولوجية للتصوير عالية الدقة من قبل cryoEM جسيم واحد. بالإضافة إلى ذلك، عادة ما تواجه مشكلات وتوصيات استكشاف الأخطاء وإصلاحها عندما يفشل إعداد قياسي في إنتاج عينة مناسبة يتم وصفها أيضا.
المقدمة
المجهر الإلكتروني المبرد أحادي الجسيمات (cryoEM) هو تقنية هيكلية قوية يمكن استخدامها لحل هياكل العينات البيولوجية الديناميكية إلى الدقة شبه الذرية1،2،3،4. في الواقع ، التطورات الأخيرة في تقنيات كشف الإلكترونات المباشرة4،5،6،7،8،9،10 ، والتحسينات في مصادر الإلكترونات4،
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد بيئة الغطس اليدوي
ملاحظة: وقت التشغيل المقدر: 5-30 دقيقة
- حدد موقع المكبس اليدوي في غرفة باردة 4 درجات مئوية حيث يمكن أن يكون مرطب في موقع مشترك للحفاظ على الغرفة بالقرب من الرطوبة النسبية 100٪ (RH) (الشكل 1A).
تنبيه: يرجى استشارة إرشادات الصحة والسلامة البيئية للمؤسسة بشأن الموقع الآمن للمغطاس اليدوي والعمليات الموصى بها. - قبل إعداد الشبكة، قم بتشغيل المرطب في الغرفة الباردة لضمان أن درجة الحرارة الإنجابية للغرفة الباردة ≥ 95٪.
ملاحظة: يمكن أن يؤدي إعداد الشبكة في الرطوبة المنخفضة إلى جفاف الأفلام الرقيقة وتغيير مكونات العازلة بسبب التبخر وانخفاض في قابلية النسخ من الشبكة إلى <....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
سيؤدي التنفيذ الناجح لبروتوكول النشاف والغطس الموصوف هنا إلى طبقة رقيقة وموحدة من الجليد الزجاجي الخالي من أي جليد سداسي وملوثات وتدرجات كبيرة من الجليد غير القابل للاستخدام والتي يمكن ملاحظتها تحت المجهر الإلكتروني (الشكل 3). الاتصال غير المتسق لورق النشاف مع سطح الشبكة ، أو إزالة ورق النشاف قبل الأوان ، أو تحريك ورقة النشاف أثناء اتصال الشبكة يمكن أن يقلل من جودة الجليد الزجاجي ويؤدي إلى سمك جليدي غير متناسق عبر شبكة EM (الشكل 4)
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
لا يزال تزجيج العينات البيولوجية للتصوير عن طريق المجهر الإلكتروني المبرد أحادي الجسيمات (cryoEM) خطوة بالغة الأهمية لتحديد الهيكل الناجح. تمثل طريقة النشاف والغطس اليدوية الموصوفة في هذا البروتوكول طريقة فعالة من حيث التكلفة وموثوقة وقوية لتجميد العينات البيولوجية بسرعة في أفلام رقيقة من الجليد الزجاجي للتصوير بالتبريد. وباستخدام الأساليب المبينة في المخطوطة، سيتمكن الباحثون من تجميع وتشغيل المكبس اليدوي، وإعداد المبرد المناسب للعينات البيولوجية التجميدية، وشبكات EM الملطخة يدويا التي تحتوي على عينات بيولوجية. في حين أن.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدينا ما نكشفه
شكر وتقدير
نشكر أعضاء مختبر هيرزيك على التفكير النقدي وتقديم الملاحظات حول هذه المخطوطة ومحتوى الفيديو. M.A.H.Jr. مدعوم من قبل NIH R35 GM138206 وكباحث سيرل. H.P.M.N مدعوم بمنحة التدريب على الفيزياء الحيوية الجزيئية (NIH T32 GM008326). كما نود أن نشكر بيل أندرسون وتشارلز بومان والدكتور غابرييل لاندر في معهد سكريبس للأبحاث للمساعدة في تصميم وتجميع واختبار المكبس اليدوي المعروض في الفيديو.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 4 فتحات صندوق تخزين شبكة | تيد بيلا | 160-40 | |
| 14 قياس المعدن المسطح طرف الاستغناء عن المعدن | B07M7YWWLT | ||
| 22 × 22 مم غطاء زجاجي مربع Sigma | C9802-1PAK | ||
| 60 مم طبق بتري زجاجي لتخزين الشبكات | فيشر | 08-747A | |
| 100 مم طبق بتري زجاجي لتخزين ورق واتمان | فيشر | 08-747D | |
| طبق بتري زجاجي 150 مم لتخزين ورق واتمان | فيشر | 08-747F | |
| 250 مل دورق | فيشر | 02-555-25B | |
| ستايروفوم أزرق ديوار | سبير لاب | FD-500 | |
| وعاء إيثان نحاسي | لاسكو | 17-4075 | |
| ملاقط | لقط تيد بيلا | 38825 | |
| مناديل مهمة دقيقة | فيشر | 06-666 | |
| منظم ثنائي المرحلة مع صمام تحكم | Airgas | Y12N245D580-AG | |
| قاعدة شبكة | Dewer منصة UCSD | ||
| Ethane | UCSD | ||
| خزان البروبان الإيثان | Praxair | ET PR50ZU-G | الإيثان (50٪): البروبان (50٪) في خزان الضغط العالي |
| خزان الإيثان | Praxair | UN1035 | الإيثان (100٪) |
| ضوء مهمة الذراع المرن | Amscope | LED-11CR | |
| Grids (UltrAufoil R 1.2 / 1.3 300 شبكة) | علوم المجهر الإلكتروني | Q325AR1.3 | |
| الهدف | 719438 | ||
| مقياس الرطوبة | ThermoPro | B01H1R0K68 | |
| معطف المختبر | UCSD | ||
| النيتروجين السائل dewar | Worthington | قفازات | |
| فيشر | 19-059-925 | ||
| حامل المكبس اليدوي (حامل أسود + دواسة قدم) | UCSD | ||
| Mark 5 (منصة غطس) قفازات | النتريل UCSD | ||
| VWR | 82026-424 | ||
| P20 ماصة | Eppendorf | 13-690-029 | |
| أنابيب PCR | Eppendorf | E0030124286 | |
| نصائح الماصة | مصباح إيبيس العلمي | 63300005 | |
| الدائري | أمازون | B07HMR4H8G | |
| نظارات السلامة مقص | UCSD | ||
| أمازون | فيسكارس 01-004761J | ||
| مفك براغي | 354711 | أيرونسايد | |
| فيشر 15-901-10R | |||
| ملاقط لنقل صندوق الشبكة | Amazon | LTS-3 | |
| Tygon tubing | Fisher | 14-171-130 | |
| Whatman Blouting Paper | Fisher | 1001-090 |
المراجع
- Hofmann, S., et al. Conformation Space of a Heterodimeric ABC Exporter under Turnover Conditions. Nature. 571 (7766), 580-583 (2019).
- Fica, S. M., Nagai, K. Cryo-Electron Microscopy Snapshots of....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
