ANS يربط Ca2 +-ATPase recombinant N-المجال. عرض أطياف مضان نمط مثل FRET عند الإثارة في الطول الموجي من 295 نانومتر. ويروي التعديل الكيميائي الذي يتوسط فيه المكتب الوطني للإحصاء في Trp مضان المجال N، مما يؤدي إلى عدم وجود نقل للطاقة (FRET) بين بقايا Trp و ANS.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التعديل الكيميائي لبقايا التربتوفان في Ca2+-ATPase N-domain لدراسة تريبتوفان-ANS FRET
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الساركو / إندوبالازميك ريتيكولم Ca2 +- ATPase (SERCA) هو ATPase من نوع P الذي تم بلورته في تشكيلات مختلفة. ومع ذلك، يمكن الحصول على معلومات وظيفية مفصلة من مجالات منعزلة مؤتلفة. يعرض المجال الهندسي (Trp552Leu و Tyr587Trp) النطاق الملتصق بالنيوكليوتيدات المؤتلف (N-domain) إخمادا مضانا عند الربط بين الليجاند. وفلوروفوري extrinsic، وهي 8-anilino-1-النفثالين السلفونات (ANS)، يرتبط إلى موقع الربط النيوكليوتيدات عن طريق التفاعلات الكهربائية والمائية مع آرغ، له، علاء، ليو، وبقايا في. ويتضح الربط ANS من خلال زيادة في كثافة الفلورسينس عندما متحمس في الطول الموجي (λ) من 370 نانومتر. ومع ذلك، عندما متحمس في λ من 295 نانومتر، ويبدو أن الزيادة في كثافة مضان أن يقترن إرواء الفلورية الجوهرية N-المجال. عرض الطيف الفلورية Föster نقل الطاقة الرنين (FRET) نمط مثل, مما يشير إلى وجود زوج Trp-ANS FRET, الذي يبدو أن تكون مدعومة مسافة قصيرة (~ 20 Å) بين Tyr587Trp و ANS. تصف هذه الدراسة تحليلا لزوج Trp-ANS FRET عن طريق التعديل الكيميائي Trp (وإرواء الفلورسينس) الذي يتم بوساطة N-bromosuccinimide (NBS). في N-المجال المعدل كيميائيا, زيادة مضان ANS عندما متحمس في λ من 295 نانومتر, على غرار عندما متحمس في λ من 370 نانومتر. ومن ثم، يمكن استخدام التعديل الكيميائي بوساطة NBS لبقايا Trp للتحقيق في عدم وجود FRET بين Trp و ANS. في غياب ترب مضان، لا ينبغي للمرء أن يلاحظ زيادة في مضان ANS. التعديل الكيميائي لمخلفات Trp في البروتينات من قبل NBS قد يكون مفيدا لفحص FRET بين بقايا Trp القريبة من ANS المقيدة. ومن المرجح أن يكون هذا المقايسة مفيدا أيضا عند استخدام الفلوروفوريس الأخرى.
المقدمة
أصبح نقل الطاقة الرنين Föster (FRET) تقنية قياسية لتحديد المسافة بين الهياكل الجزيئية بعد الربط أو التفاعل في بنية البروتين ودراسات الوظائف1و2و3و4. في P-نوع ATPases، وقد استخدمت FRET للتحقيق في هيكل ووظيفة من reticulum الساركو-endoplasmic Ca2+-ATPase (SERCA)2،5،6،7،8، على سبيل المثال ، تم تحليل التقلبات الهيكلية خلال دورة الحفاز في البروتين كله من قبل FRET
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. تحديد(في silico)من ANS وSERCA N-المجال التفاعل
- توليد ثلاثي الأبعاد (3D) هيكل البروتين (SERCA N-المجال) عن طريق النمذجة الجزيئية باستخدام البروتين المفضل النمذجة البرمجيات50.
- تحديد بقايا الأحماض الأمينية التي تشكل موقع الربط النيوكليوتيدات باستخدام برنامج التركيب الجزيئي المفضل51، وتحديد وجود بقايا آرغ و ليس35؛ هذه مطلوبة لربط ANS وزيادة كثافة الفلورسينس (العائد الكمي).
- إجراء الالتحام الجزيئي (باستخدام برنامج الالتحام المفضل)52،53،54 لتحديد تفاعلات ATP ، الفلورسين ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يظهر الالتحام الجزيئي ربط ANS بموقع الربط بالنيوكليوتيدات في المجال N عبر التفاعلات الكهروستاتيكية وكذلك التفاعلات الكارهة للماء(الشكل 1). المسافة الجزيئية (20 Å) بين بقايا Trp و ANS (ملزمة بموقع الربط النيوكليوتيدات) يدعم حدوث FRET (الشكل 1). تم الحصول على تصميم (هندسي) المؤتلف N-المجال في نقاء عالية من قبل الكروماتوغرافيا تقارب (الشكل 2) وكان مناسبا للتجارب مضان. عرض أطياف مضان من مجمع ANS-N-المجال نمط مثل FRET عند الإثارة في λ = .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
عرض أطياف مضان من مجمع ANS-N-المجال نمط مثل FRET عندما متحمس في λ من 295 نانومتر, في حين أن المسافة الجزيئية (20 Å) بين بقايا Trp و ANS يبدو لدعم حدوث FRET (الشكل 1). TRP التعديل الكيميائي من قبل النتائج NBS في أقل الفلورسنت N-المجال (الشكل 3B, الطيف و); وبالتالي، نقل الطاقة غير ممكن. وأطياف الفلورسينس ANS مماثلة لتلك التي من N-المجال غير المعدلة عندما متحمس في λ من 295 نانومتر (الشكل 3A و C).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.
شكر وتقدير
تم تمويل هذا العمل جزئيا من قبل FAI-UASLP رقم المنحة C19-FAI-05-89.89 ورقم منحة كوناسيت 316463 (أبويوس أ لا سينسيا دي فرونتيرا: Fortalecimiento y Mantenimiento de Infraestructuras de Investigación de Uso Común y Capacitación Técnica 2021). يشكر المؤلفون المساعدة التقنية التي يقدمها جوليان ماتا موراليس في طبعة الفيديو.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| أكريلاميد | بيو راد | 1610107 | SDS-PAGE |
| بيرسلفات الأمونيوم | Bio-Rad | 1610700 | SDS-PAGE |
| 8-Anilino-1-naphthalenesulfonic acid | Sigma-Aldrich | A1028 | Fluorophore |
| Bis-acrylamide | Bio-Rad | 1610125 | SDS-PAGE |
| N-Bromosuccinimide | Sigma-Aldrich | B81255 | Chemical تعديل |
| N ، N-dimethylformamide | JT Baker | 9213-12 | تحضير محلول |
| المخزون الفلورسينات إيزوثيوسيانات | سيجما-ألدريتش | F7250 | تسمية التألق الكيميائي |
| كوفيت التألق | هيلما | Z801291 | مقايسة التألق |
| مقياس الطيف الفلوري | الفلوري شيمادزو | RF 5301PC | مقايسة |
| HisTrap & التجارة ؛ FF | GE Healtcare | 11-0004-59 | تنقية البروتين |
| IPTG ، خالية من الديوكسان | الأمريكية Bionalytical | AB00841-00010 | تعبير البروتين |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513-25G | تنقية البروتين |
| LB media | فيشر 10000713 العلمي | ثقافة الخلايا | |
| Pipetman L P10L | Gilson | FA10002M | Fluorescence المقايسة |
| Pipetman L P100L | Gilson | FA10004M | مقايسة التألق |
| Pipetman L P200L | Gilson | FA10005M | مقايسة مضان |
| Pipetman L P1000L | Gilson | FA10006M | مقايسة مضان |
| Pipetman L P5000L | Gilson | FA10007 | مقايسة مضان |
| الدقة بالإضافة إلى std | Bio-Rad | 1610374 | SDS-PAGE |
| كبريتات دوديسيل الصوديوم | Bio-Rad | 1610302 | SDS-PAGE |
| فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة | JT Baker | 3828-19 | تحضير العازلة |
| فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة | JT Baker | 3818-01 | التحضير العازلة |
| 0.2 um | Millipore | GVWP04700 | محلول ترشيح |
| Temed | Bio-Rad | 1610801 | صفحة SDS |
| تريس | بيو راد | 1610719 | SDS-PAGE |
المراجع
- Munishkina, L. A., Fink, A. L. Fluorescence as a method to reveal structures and membrane-interactions of amyloidogenic proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1768 (8), 1862-1885 (2007).
- Dong, X., Thomas, D. D.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
